烯醇化酶在微生物中的研究進展

彭昱萱

（西安交通大學附屬中學航天學校 陜西西安 710100）

烯醇化酶(enolase, 2-phospho-D-glycerate-hydrolyase)是催化2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸，在糖酵解過程中起著重要作用，并廣泛存在于不同的生物體中[1]。烯醇化酶在1934首次由Lohman和Mayerhof兩位科學家在肌肉提取物中發現[2]。烯醇化酶又稱D-2-磷酸-甘油鹽水解酶，主要起催化作用，在糖異生途徑中催化逆向反應烯醇化酶[3]。烯醇化酶廣泛存在于真核和原核生物細胞中，并具有高度保守性。

在脊椎動物中，烯醇化酶α、β、γ有三種形式的同功酶。其中，我們發現α-ENO存在于腎、肝等組織中。因此，α-ENO為非神經系統的烯醇化酶(NNE)；β-ENO主要存在于心肌和骨骼肌中，在脊椎動物中又稱為肌肉特異性烯醇化酶；γ-ENO主要存在于神經元和神經內分泌組織中，又稱為神經元烯醇化酶(neuralenolase)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specificenolase, NSE)。α-ENO、β-ENO、γ-ENO由3種不同的基因所編碼，其氨基酸序列具有高度保守性，活性形式為二聚體，由兩個亞基組成。目前，我們已知有5種形式的組合：αα、ββ、γγ、αβ、αγ，在烯醇化酶脊柱動物中常以二聚體的形式存在，而原核生物中多以八聚體形式存在，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）[4,5]。

烯醇化酶作為一種多功能蛋白，存在于多種病原生物體表面或分泌物中，能參與到外界環境并與之發生作用。烯醇化酶在糖酵解過程中可以通過調節細胞生產能量的過程來保證細胞ATP水平、細胞的存活、細胞生理功能的執行。烯醇化酶還可作為自身抗原參與機體免疫反應，如引發類風濕性關節炎等慢性炎癥反應。同時，烯醇化酶在脊椎動物中還能參與各種侵染，主要原因是因為烯醇化酶能與血纖維溶酶原（plasminogen）結合，可以將纖維蛋白溶酶原結合在細胞周圍促使活化，發揮蛋白水解酶的作用激活纖溶酶，參與胞外基質重塑的生理及病理過程，并引發一系列下游反應[6]。

一、白念珠菌烯醇化酶

（一）白色念珠菌烯醇化酶的特征

我們在微生物領域對白色念珠菌烯醇化酶的研究起步較晚，但這些年在這方面研究的進展速度很快。白色念珠菌烯醇化酶的結構特征、理化性質也逐步被解析。烯醇化酶是白念珠菌細胞壁與細胞漿中的一種糖酵解酶，并存在于白念珠菌胞壁與胞漿中的一種糖酵解代謝關鍵酶，在白色念珠菌感染期間大量分泌。體外實驗發現，烯醇化酶是白色念珠菌中含量豐富的蛋白質之一[7]。分析白念珠菌烯醇化酶的氨基酸序列可知，其大約由440個氨基酸組成，和釀酒酵母及哺乳動物中烯醇化酶組成相近(分別由436和433個氨基酸組成)，分子量大約45KD-48KD之間(不同環境有差異)，據計算分別占白念珠菌酵母相和菌絲總蛋白量的0.7%和2%[8]。Ishiguro等通過純化出白念珠菌烯醇化酶活性為4262U/mg，比釀酒酵母烯醇化酶活性約高出10倍左右。釀酒酵母烯醇化酶和白念珠菌烯醇化酶一樣都不含有碳水化合物部分。

Sundstrom[9]等從白念珠菌cDNA文庫中對烯醇化酶基因進行分離并測序，分子量為14Kb，同時表明烯醇化酶基因是一個含有1320bp連續閱讀框的片段，編碼440個氨基酸蛋白與釀酒酵母細胞，編碼的Eno1和Eno2分別有78%和76%的同源性，與人類細胞的α、β烯醇化酶的相似性分別為65.1%和65.5%。酶蛋白的α螺旋、β片層及β轉角區域的結構有很強的保守性。除竣基端16個氨基酸外，白念珠菌和釀酒酵母烯醇化酶的一級結構很接近。

此外，我們通過研磨硫酸銨沉淀以及色譜等步驟將烯醇化酶分離和純化，發現它的相對分子質量約是46000～48000，且烯醇化酶在pH＝6.8時的活性最強，而Mg2+則是烯醇化酶最有效的活化劑[10]。

（二）白色念珠菌烯醇化酶與疾病的發生

白念珠菌通過未知的機制將烯醇化酶送至細胞表面，在細胞表面的烯醇化酶可以激活宿主的纖溶系統，發揮血纖溶酶原受體的作用，與血纖溶酶原相結合，切除N端部分序列，使其轉化為有絲氨酸蛋白酶活性的血纖溶酶，發揮蛋白質水解酶的作用，降解纖維蛋白和細胞外的基質。利用宿主自身系統破壞屏障，便于入侵與擴散[11]。目前，烯醇化酶與血纖溶酶原的結合有兩種方式：一是烯醇化酶通過它的氨基酸序列C端的賴氨酸與血纖溶酶原結合，如A型鏈球菌的烯醇化酶只在末端是兩個賴氨酸的條件下才與血纖溶酶原相結合；另一種則是以烯醇化酶肽鏈中部一段結構域和血纖溶酶原結合。除了影響宿主纖溶系統以外，也有部分烯醇化酶用免疫抑制的方式來侵染宿主，如齲齒鏈球菌表面烯醇化酶可以抑制針對T細胞依賴性抗原的免疫反應，同時誘導宿主產生白介素10協助侵染[12]。

二、金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)屬于微球菌科葡萄球菌屬，排列是葡萄球形，直徑0.8μm左右，致病性葡萄球菌菌體較小，革蘭陽性球菌，無鞭毛、芽孢，多數無莢膜，是一種廣泛分布于自然界中條件性人畜共患病原菌[12]。金黃色葡萄球菌還易導致食品受污染，是一種重要的食源性致病菌[13]，也是臨床上重要的革蘭陽性致病菌，可以造成皮膚、軟組織感染以及心內膜炎等多種疾病[14]。金黃色葡萄球菌還是導致術后傷口感染和呼吸道相關性肺炎等疾病的重要原因[15]。

金黃色葡萄球菌烯醇化酶作用機制：金黃色葡萄球菌可以利用宿主的纖溶系統侵入宿主體內。烯醇化酶通過可識別纖溶酶原受體C末端的賴氨酸殘基和其受體結合后生成纖溶酶。然而，纖溶酶原僅識別賴氨酸或賴氨酸類似物[16]。生成的纖溶酶不僅發揮纖溶作用，而且可以協助病菌穿越組織屏障，進而幫助細菌侵染不同生物組織系統[17]。金黃色葡萄球菌表面的纖溶酶可以協助其破壞宿主的細胞外基質，穿透基底膜，在宿主內快速擴散[15]。

金黃色葡萄球菌中enolase與細胞外基質的一種主要成分層粘連蛋白Laminin有相互作用，發現金黃色葡萄球菌表面有一種蛋白能夠與Laminin相結合，然后用單克隆抗體篩選出與Laminin相互作用的蛋白序列，通過比較發現與enolase完全重合。金黃色葡萄球菌表面的這種蛋白的單克隆抗體也能夠識別酵母的α-enolase。此外，在Laminin包被培養過程中，單克隆抗體的加入會抑制金黃色葡萄球菌對培養板的粘著，這證明對enolase的抑制會影響金黃色葡萄球菌和Laminin的結合[18]。

三、支原體的相關介紹

支原體(Mycoplamsa)又稱霉形體，歸屬于柔膜體綱 (Mollicutes)，共有6個屬，120個種別[19]。支原體最早發現于1898年，1956年Robinson L B等[20]首次從細胞培養物中分離出支原體。它們廣泛存在于自然界中，有80余種。支原體不具有細胞壁結構。絕大多數支原體的生長必須寄生于宿主細胞表面并具有嚴格的宿主選擇特異性。支原體缺乏呼吸系統，而且三羧酸循環不完整，不會產生細胞色素，同時不會有高效的氧化磷酸化產生ATP的方式，僅能產生低水平的ATP。因此，支原體的主要能量來源是糖酵解途徑。大量定位于支原體外的糖酵解酶在細胞代謝的過程中可以及時捕捉細胞外的葡萄糖。

支原體烯醇化酶：支原體的黏附決定著毒力。烯醇化酶在細菌中是一種毒素。它定位于細胞外，具有與血纖溶酶原或纖連蛋白結合的能力。支原體表面的烯醇化酶蛋白均能結合血纖溶酶原，從而發現烯醇化酶與細菌的黏附、定植、侵襲及其在組織中穿梭等生理過程有著極為密切的關系。在哺乳動物中，這種相互作用使細胞外基質降解，有助于細菌在組織間的穿梭和轉移。宿主產生的抗細菌的烯醇化酶抗體可以與自身的烯醇化酶發生反應，在加速組織損壞的同時也加劇炎癥反應，引發關節炎等自身免疫性疾病支原體的黏附決定了支原體的毒力定植的開始和關鍵點。我們在牛支原體 7 群中亦發現烯醇化酶是血纖溶酶原結合蛋白[21]。

四、總結與展望

烯醇化酶是一種多功能蛋白，廣泛存在于各類生物體中。它是糖酵解過程中一種至關重要的酶，也可以作為自身抗原參與機體免疫反應。不僅如此，烯醇化酶還可以作為纖維蛋白溶酶原受體參與纖溶過程。在病原菌表面的烯醇化酶可以發揮蛋白質水解酶的作用，降解纖維蛋白和細胞外的基質，利用宿主自身系統破壞屏障，以便侵染與擴散。除了影響宿主纖溶系統外，也有部分烯醇化酶用免疫抑制的方式來侵染宿主。烯醇化酶除了參與病原菌侵染宿主的過程外，還是診斷學研究的靶分子。同時，烯醇化酶疫苗毒副作用小且具有靶向選擇性。這些性質會為病菌感染治療和預防提供條件。烯醇化酶還能結合現有的病菌診斷方法，成為臨床輔助診斷的依據。