基于下丘腦瘦素受體介導的JAK2/STAT3通路探討穴位埋線治療食源性肥胖大鼠的中樞機制

張榮， 伍先明， 楊碩， 莫倩

（1.貴州中醫藥大學，貴州貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州貴陽 550003）

肥胖是心腦血管等疾病的高危因素，我國肥胖發生率逐年升高[1]。肥胖防治問題亟需解決。機體能量代謝紊亂是導致肥胖發生的重要原因。下丘腦是調控機體能量穩態的重要高級中樞[2]，而瘦素（leptin）是中樞神經系統調節機體能量代謝的關鍵上游因子，主要通過下丘腦長型瘦素受體（LepR）介導的Janus激酶2（JAK2）/信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）通路傳遞能量代謝信號[3]。穴位埋線減肥在臨床上已被證實是一項安全有效的方法[4]。團隊前期研究發現，以中脘、水道、天樞、脾俞、胃俞、三焦俞等穴組方，穴位埋線治療肥胖癥臨床療效顯著[5-6]，其機制可能與調控血清瘦素的表達從而良性調節外周脂肪代謝有關[7-8]，但是否同時影響中樞有待于進一步研究。因此，在前期研究的基礎上，本研究以下丘腦LepR介導的JAK2/STAT3通路為切入點，觀察該通路在正常狀態下及被特異性阻斷劑AG490 阻斷時，穴位埋線對食源性肥胖（diet-induced obesity，DIO）大鼠減重降脂效用變化，初步探討穴位埋線治療肥胖癥的中樞機制，以期為臨床治療本病提供科學佐證，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 健康SPF 級雄性SD 大鼠40 只，1 月齡，體質量120～140 g，購自第三軍醫大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（渝）2017-0002，飼養于貴州中醫藥大學動物實驗中心，光照12 h 晝夜交替，室溫（23±2）℃，濕度（40±5）%。本研究獲得貴州中醫藥大學第二附屬醫院倫理委員會批準（審批號：2015088）。動物的處置嚴格遵照《關于善待實驗動物的指導性意見》[9]。

1.2 試劑與儀器 AG490（美國MCE公司）；甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）生化檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；瘦素檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；RNA 提取及純化試劑盒（德國Qiagen 公司）；RNA 逆轉錄試劑盒、PCR擴增試劑盒（日本TaKaRa公司）；LepR兔多抗、JAK2 兔單抗、STAT3兔單抗（美國Abcam公司）；β-actin抗體、羊抗兔IgG二抗（北京博奧森生物技術有限公司）。7號一次性埋線針（蘇州市吳中區東方針灸器械廠）；3-0號羊腸線（上海信成醫療器械有限公司）；凝膠掃描成像系統、CFX96熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；酶標儀、核酸蛋白測定儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1. 3 模型制備與分組 大鼠適應性喂養1 周后，采用隨機抽樣的方法選取10 只作為正常組，給予普通飼料飼養。剩余30 只大鼠給予高脂飼料（配方：普通飼料60%，豬油12%，雞蛋10%，花生、奶粉、蔗糖各5%，食鹽2%，麻油1%，由北京科澳協力有限公司配制）飼養25 周建立DIO 模型[10-11]，自由攝食、飲水。25周后體質量高于正常組平均體質量20%及以上的示為造模成功[12]。將DIO 造模成功后的大鼠隨機分為模型組、埋線組、埋線+AG490組，每組10只。

1. 4 干預方法 埋線組、埋線+AG490 組在造模成功后第1、8、15、22 天進行埋線治療，操作方法：參照文獻研究[13-16]選取中脘、水道、天樞、脾俞、胃俞、三焦俞等穴位，自制固定架固定大鼠，穴區皮膚備皮，將0.5~0.6 mm 的3-0 號羊腸線用7 號一次性埋線針埋入上述穴位的脂肪層[7]，共治療4 次。埋線+AG490 組埋線期間每天腹腔注射AG490（1 mg/kg）[17]。正常組和模型組僅抓取固定。干預期間，各組均用普通飼料飼養，自由飲水攝食。

1.5 觀察指標與檢測方法

1.5.1 樣本采集 治療結束后大鼠禁食過夜，腹主動脈取血，離心后將上清液轉移到無菌EP 管中，-80 ℃冰箱冷凍保存。處死大鼠后迅速取下丘腦組織分裝至無酶EP 管，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存備用。

1.5.2 血清生化指標及瘦素檢測 采用ELISA 方法檢測各組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C及瘦素水平，檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1. 5. 3 Western Blot 法檢測下丘腦LepR、JAK2、STAT3蛋白表達 提取下丘腦總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。根據目的蛋白的分子量配制相應濃度的分離膠和濃縮膠，以β-actin 為內參，采用十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）（恒壓60 V 持續1 h，120 V 持續30 ~40 min），濕轉法轉膜（恒流，250 mA，約3 h），封閉，TBST 洗膜。分別加入一抗（LepR 1∶1 500，JAK2 1∶5 000，STAT3 1∶2 000，β-actin 1∶5 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜，加入羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例為1∶10 000）孵育1.5 h。TBST洗膜后再加入增強化學發光（ECL）顯影劑，放入化學發光成像系統，進行自動曝光，并保存圖片。用Image Lab Software 5.2分析條帶，計算灰度值。

1.5.4 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測下丘腦中LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表達 提取下丘腦總RNA 并檢測其濃度及純度。逆轉錄生成cDNA。按PCR 擴增試劑盒配制反應液進行擴增，反應程序：預變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，擴增39 個循環；變性95 ℃、10 s，延伸65 ℃、5 s，酶瞬間滅活97 ℃、5 s。以GAPDH 為內參，用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1. 6 統計方法 采用SPSS 26.0 軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。如果方差齊，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗；如果方差不齊，兩兩比較則采用Tamhane’s T2 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠干預前后體質量比較 圖1 結果顯示：干預前，與正常組比較，模型組、埋線組、埋線+AG490組大鼠體質量均升高（P＜0.01），提示DIO 造模成功；與模型組比較，埋線組、埋線+AG490 組體質量無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。干預后，與模型組比較，埋線組體質量降低（P＜0.01）；與埋線+AG490組比較，埋線組體質量降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠干預前后體質量比較Figure 1 Comparison of body mass among various groups of rats before and after intervention

2. 2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量比較 圖2結果顯示：與正常組比較，模型組TG、TC、LDL-C 含量均升高（P＜0.05），HDL-C無顯著性差異（P＞0.05）；與模型組比較，埋線組TG、TC、LDL-C 含量降低（P＜0.05），HDL-C 無顯著性差異（P＞0.05）；與埋線+AG490組比較，埋線組TG、TC、LDL-C含量降低（P＜0.05），HDL-C無顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較Figure 2 Comparison of serum TG，TC，LDL-C，HDL-C levels among various groups of rats

2.3 各組大鼠血清瘦素比較 圖3 結果顯示：與正常組比較，模型組瘦素水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，埋線組瘦素水平降低（P＜0.01）；與埋線+AG490 組比較，埋線組瘦素水平降低（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠血清瘦素水平比較Figure 3 Comparison of serum leptin level among various groups of rats

2. 4 各組大鼠下丘腦組織LepR、JAK2、STAT3 mRNA表達水平比較 圖4結果顯示：與正常組比較，模型組LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表達水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，埋線組LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表達量均升高（P＜0.01）；與埋線+AG490 組比較，埋線組LepR、JAK2、STAT3 mRNA表達量均升高（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠下丘腦組織中的LepR、JAK2、STAT3 mRNA表達水平比較Figure 4 Comparison of mRNA expression levels of LepR，JAK2 and STAT3 in hypothalamus tissue among various groups of rats

2. 5 各組大鼠下丘腦組織LepR、JAK2、STAT3蛋白表達水平比較 圖5 結果顯示：與正常組比較，模型組LepR、JAK2、STAT3 蛋白表達水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，埋線組LepR、JAK2、STAT3 蛋白表達水平均升高（P＜0.01）；與埋線+AG490組比較，埋線組LepR、JAK2、STAT3蛋白表達水平均升高（P＜0.01）。

圖5 各組大鼠下丘腦組織中的LepR、JAK2、STAT3蛋白表達水平比較Figure 5 Comparison of protein expression levels of LepR，JAK2 and STAT3 in hypothalamus tissue among various groups of rats

3 討論

中醫學認為，肥胖多與飲食不節、勞逸失調等因素有關，基本病機為脾胃虛衰，運化功能失常，痰濕聚集，壅滯臟腑經絡[18]，病位主要在脾胃，故肥胖治療多以調脾胃、祛痰濕為主。本團隊前期臨床研究[5-6]顯示，穴位埋線治療肥胖癥臨床療效顯著，且基礎研究[7-8]結果顯示，在降低肥胖大鼠體質量、Lee’s指數以及調節外周脂質代謝方面，脂肪層埋線效果優于肌肉層埋線。因此，本研究采用脂肪層穴位埋線的方法，選取脾胃經之背俞穴脾俞、胃俞以健脾和胃，胃、大腸經之募穴中脘、天樞以和胃氣，調節胃腸，配合水道、三焦俞以疏利三焦、通調水道，達健脾胃、祛痰濕、利水道之功。結果顯示，脂肪層穴位埋線可顯著降低食源性肥胖（DIO）大鼠的體質量，下調血清TG、TC、LDL-C水平，調節脂質代謝。

目前肥胖動物多以飲食誘導為主[19]，故本研究以高脂飲食誘導建立DIO 模型，以體質量超過同期普通飼料飼養大鼠的20%為造模成功的標準[12]。

肥胖的發生是遺傳、社會環境等因素共同作用的結果。下丘腦是機體調控能量平衡和代謝的高級中樞，是導致肥胖患者脂肪組織聚集的關鍵區域，同時也是瘦素發揮作用的主要靶器官[20]。瘦素是防治肥胖的重要靶點，具有減少能量攝入、促進能量消耗、抑制脂肪合成并促進其分解的生理功能，同時作為“信使”，向中樞神經系統反映機體能量儲存情況[21]。既往臨床研究[22]顯示，肥胖患者血清瘦素水平偏高，但不能抑制食欲，提示機體對瘦素的代謝性調節作用敏感性降低，這種現象稱為“瘦素抵抗”。出現“瘦素抵抗”的原因錯綜復雜，JAK2/STAT3 通道活性降低是導致機體出現“瘦素抵抗”重要原因之一[23]。下丘腦LepR介導的JAK2/STAT3通路是目前已知的瘦素發揮調節機體能量代謝的主要信號通路，瘦素正常生物學效應的發揮與JAK2/STAT3 通路活性呈正相關。瘦素經血液循環穿過血腦屏障到達下丘腦，與長型LepR 結合后通過激活JAK2，使LepR 上的酪氨酸殘基磷酸化，被磷酸化的酪氨酸殘基通過特異性的招募結合使STAT3活化并形成二聚體，STAT3二聚體轉移至細胞核內通過調節目的基因的轉錄從而發揮瘦素作用[24]。

本研究結果顯示：穴位埋線后，DIO大鼠體質量，瘦素，TG、TC、LDL-C 水平降低，LepR、JAK2、STAT3 mRNA 和蛋白表達升高，說明穴位埋線能夠激活LepR 介導的JAK2/STAT3 通路，糾正瘦素抵抗。AG490 可通過與受體酪氨酸酶競爭結合位點特異性阻斷JAK2/STAT3 通路[25]。穴位埋線的同時腹腔注射AG490，DIO大鼠各項指標與模型組相當，基本上抵消了穴位埋線的治療效應。這一結果雙重證明：下丘腦LepR 介導的JAK2/STAT3通路參與了穴位埋線降低DIO大鼠體質量的調節過程。

綜上所述，穴位埋線對DIO 大鼠具有良好的減重降脂作用，其中樞作用機制可能與下調血清瘦素水平，激活下丘腦LepR 介導的JAK2/STAT3通路有關。本研究為臨床上采用穴位埋線治療肥胖癥提供了一定的科學依據，但也存在一些不足，如雖采用公認的飲食誘導建立DIO 模型，但造模成功的評價標準較為單一，可能對實驗結果有一定的影響，且觀察指標中未納入下丘腦相關的形態學指標進行分析。研究中還發現，抑制JAK2/STAT3通路后，LepR、JAK2 mRNA水平也有所改善，推測穴位埋線可能同時通過其他中樞或外周途徑調節機體能量代謝，今后有待采用光遺傳等先進科學技術進一步驗證。