基于網絡藥理學分析補氣養血通絡組方對硼替佐米誘導的周圍神經病變機制

楊 東， 王 苗， 張 楠

（1.河北省優撫醫院內一科，石家莊 050000； 2.河北省滄州中西醫結合醫院放化療科，滄州 060000； 3.河北省滄州中西醫結合醫院脊柱脊髓四科，滄州 060000）

多發性骨髓瘤是一種發生于血液系統的惡性腫瘤，其臨床特點為漿細胞的單克隆擴增過程異常，雖然對其疾病機制的認識和理解不斷增加，但治療結果欠佳，即使對化療有初步反應的患者也可能逐漸出現耐藥性[1]。美國食品藥品監督管理局2003 年批準硼替佐米可應用于多發性骨髓瘤的治療，它是首次被應用于治療該病的蛋白酶體抑制劑[2-3]，但存在諸多不良反應，其誘導的周圍神經病變較常出現[4]。硼替佐米誘導的周圍神經病變（bortezomib-induced peripheral neuropathy，BIPN）的特征是感覺功能障礙，其癥狀包括神經性疼痛、四肢麻木、感覺異常喪失、灼熱感等，還可能影響運動神經功能，嚴重甚至會癱瘓[5-7]。

網絡藥理學作為一種新興的生物學研究方法，能夠將中藥復方制劑的藥物活性成分與潛在治療靶點進行匹配，進而構建互作網絡，有助于了解中草藥發揮生物學作用的藥理學機制，篩選出治療疾病的有效成分，提高藥物治療效果。因此，本研究通過采用網絡藥理學的研究策略明確補氣養血通絡組方治療BIPN 的機制。

1 資料與方法

1.1 補氣養血通絡組方相關治療靶點的篩選

利用中藥系統藥理數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）在線數據庫（https：//www.tcmsp-e.com/tcmsp.php）[8]初步篩選補氣養血通絡組方的中藥化學組成成分，篩選條件存在兩個維度，分別是口服利用度與類藥性，被納入進一步研究的組成成分需要同時滿足口服利用度≥30%與類藥性≥0.18 兩個條件，并進一步通過該數據庫獲得相關組成成分的作用靶點。然后，依據自Uniport 數據庫（https：//www.uniport.org）獲取的蛋白質注釋信息對上一步獲取的作用靶點信息進行注釋。

1.2 BIPN 相關靶點篩選

以“bortezomib-induced peripheral neuropathy”為關鍵詞進行BIPN 相關靶點篩選，在GeneCards數據庫（http：//www.genecards.org）以及OMIM 數據庫（http：//www.omim.org）進行檢索，得到BIPN相關靶點，然后利用R 4.1.2 軟件將兩者取并集，再去重獲得BIPN 的相關靶點。

1.3 補氣養血通絡組方與BIPN 相關靶點篩選及中藥—活性成分—靶點—疾病網絡圖構建

為進一步明確補氣養血通絡組方與BIPN 的關系，基于R 4.1.2 軟件將補氣養血通絡組方的靶點與BIPN 相關靶點取交集獲得共同靶點，然后利用R 4.1.2 軟件繪制韋恩圖將其可視化。進一步篩選出可作用于共同靶點的補氣養血通絡組方中主要的相關活性成分，并以Cytoscape 3.8.0 軟件為基礎，結合上述得到的各作用靶點、BIPN 以及補氣養血通絡組方中的有效活性成分之間的關系，從而構建中藥—活性成分—靶點—疾病網絡關系圖。

1.4 補氣養血通絡組方治療BIPN 的蛋白互作網絡構建以及核心靶點篩選

將補氣養血通絡組方與BIPN 相關的共同靶點導入蛋白質相互作用網絡（protein-protein interaction networks，PPI）平臺STRINGv11.0（https：//www.string-db.org），設置納入篩選物種為“Homo sapiens”，設置最低相互作用閾值為最高等可置信區間（＞0.9），隱藏沒有相互作用的靶點基因，其余相關參數的設置均不作任何修改，最終得到蛋白相互作用網絡的可視化網絡圖及相關數據結果。利用Cytoscape 3.8.0 讀取上述數據結果的tsv 文件作進一步分析。利用Cytoscape 3.8.0 中的cytoHubba 擴展插件，根據度值篩選出位列前10的靶點。

1.5 補氣養血通絡組方治療BIPN 靶點GO 功能富集分析

GO 功能富集分析使用了R 4.1.2 軟件中的enrichplot、clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包進行GO功能富集分析。根據篩選條件基因富集數目與顯著程度（P＜0.05，Q＜0.05），利用R 4.1.2 ggplot2 包分別將生物過程（biological process，BP）、細胞組成和分子功能（molecular function，MF）中排名前10 的條目繪制成柱狀圖。

1.6 補氣養血通絡組方治療BIPN 靶點KEGG通路富集分析

利用R 4.1.2 軟件中的enrichplot、clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包進行KEGG 通路富集分析，根據篩選條件基因富集數目與顯著程度（P＜0.05，Q＜0.05），篩選出主要的70 條KEGG 通路。利用R 4.1.2 的ggplot2 包將上述結果可視化。進一步利用R 4.1.2 的pathview 包將治療相關靶點映射至主要的信號通路并將其可視化。

1.7 分子對接

在度值位列前10 的活性成分及靶點中，挑選出適當的活性成分及靶點。通過檢索PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取補氣養血通絡組方中活性成分的2D 分子組成結構。通過檢索美國生物物理結構數據庫中心（https：//www.rcsb.org/） 獲得靶點的3D 大分子結構。使用ChemBio3D Ultra 14.0 軟件將活性成分的2D 結構輸出為mol2 格式。使用PyMOL 2.4.0 軟件將靶點的3D 大分子結構進行預處理，去除水分子及小分子配體，并將結果輸出為pdb 格式。使用AutoDockTools 1.5.6 軟件將靶點的3D 大分子結構渲染為2D 圖像，并將結果輸出為pdbqt 格式文件；再次使用該軟件確定靶點的分子活性口袋，并輸出相應參數；同時，使用該軟件將有效成分的2D 分子組成結構渲染為2D 圖像，并輸出為pdbqt 格式文件。利用上述過程得到的兩個pdbqt 文件及分子活性口袋的相應參數，在vina軟件中進行分子對接，最終利用PyMOL 2.4.0 軟件輸出最終的結果。依據vina 軟件輸出的affinity值評價有效成分與靶點的親和力。

2 結果

2.1 補氣養血通絡組方中活性成分及其靶點篩選

依托TCMSP 平臺，查找補氣養血通絡組方中的潛在治療成分，并以口服利用度≥30%及類藥性≥0.18 為條件進一步篩選相關成分，最后共得到白芍的活性成分13 種，丹參的活性成分59種，大棗的活性成分29 種，桂枝的活性成分7種，黃芪的活性成分20 種，雞血藤的活性成分24 種，路路通的活性成分4 種，生姜的活性成分5 種。經過合并去重獲得補氣養血通絡組方的活性成分為139 種。

2.2 藥物—疾病有效成分靶點篩選

將通過TCMSP 數據庫獲取的補氣養血通絡組方相對應的靶點蛋白，進一步依據Uniport 數據庫中的相關蛋白質信息進行注釋完成標準化，取交集后共得到作用靶點255 個。其中，白芍作用靶點為76 個，丹參作用靶點為116 個，大棗作用靶點為184 個，桂枝作用靶點為40 個，黃芪作用靶點為185 個，雞血藤作用靶點為120 個，路路通作用靶點為97 個，生姜作用靶點為44 個。通過GeneCards 數據庫檢索關鍵詞bortezomibinduced peripheral neuropathy，共得到652 個BIPN 相關靶點；通過OMIM 數據庫檢索共得到174 個BIPN 相關靶點。利用R 4.1.2 的venn 包，合并且去重后獲得815 個BIPN 相關靶點。進一步將補氣養血通絡組方的255 個中藥成分靶點與BIPN 相關靶點取交集獲得97 個共同靶點，并通過R 4.1.2 的venn 包繪制Venn 圖（圖1）進行可視化。

圖1 補氣養血通絡組方與硼替佐米誘導的周圍神經病變共同靶點的韋恩圖

2.3 中藥—活性成分—靶點—疾病網絡關系的構建

將補氣養血通絡組方與BIPN 共同的靶點作為研究對象，再將組方中的有效成分與單種藥材的相應關系以及有效成分與共同靶點的關系導入Cytoscape 3.8.0 軟件進行優化分析，最終獲得一個有201 個節點以及638 條邊的中藥—活性成分—靶點—疾病的網絡關系圖（圖2）。通過Cytoscape 3.8.0 自帶的Network Analyze 分析網絡關系圖中的網絡拓撲學參數，度值越大表明該有效成分越關鍵。在這個網絡中篩選出前10 位的活性成分為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、熊果酸（ursolic acid）、山柰酚（kaempferol）、丹參酮ⅡA（tanshinone ⅡA）、甘草查爾酮A（licochalcone A）、β-胡蘿卜素（beta-carotene）、芒柄花黃素（formononetin）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、異鼠李素（isorhamnetin）。進一步推測這10 種成分在補氣養血通絡組方治療BIPN 中作為核心成分起到了關鍵作用，同時也印證了補氣養血通絡組方可能同時作用于多個靶點治療BIPN。

圖2 補氣養血通絡組方有效成分與硼替佐米誘導的周圍神經病變的相互作用關系

2.4 PPI 蛋白相互作用網絡的構建

在STRING 數據庫中輸入補氣養血通絡組方和BIPN 共同的靶點97 個，設置篩選種族為“Homo sapiens”，設定了最低相互作用閾值高等可置信區間（＞0.9），并去除孤立的沒有相互作用的靶點，其余參數不做修改，最終得到PPI 蛋白相互作用網絡圖（圖3），并采用Cytoscape 3.8.0軟件讀取上述相關數據結果的tsv 文件。通過Cytoscape 3.8.0 中的CytoHubba 擴展插件挑取排列在前10 的關鍵靶點，為TP53、AKT1、MAPK14、FOS、RELA、MYC、STAT3、CTNNB1、ESR1、MAPK1，提示這些成分可能是補氣養血通絡組方治療BIPN 的核心靶點基因，這為進一步探究補氣養血通絡組方治療BIPN 的深層次機制提供了重要方向。

圖3 補氣養血通絡組方治療硼替佐米誘導的周圍神經病變的PPI 網絡圖

2.5 補氣養血通絡組方治療BIPN 的靶點GO 功能富集分析

利用R 4.1.2 軟件中的enrichplot、clusterProfiler、org.Hs.eg.db 軟件包進行GO 功能富集分析，最終共獲得涉及BP 2 105 個，主要包括細胞環境刺激的反應、細胞化學應激的反應、細胞對非生物刺激的反應、氧化應激反應、對金屬離子的響應；涉及細胞組成69 個，主要包括細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶、膜微域、膜筏、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物、蛋白激酶復合物等；涉及MF 146 個，主要包括DNA 結合轉錄因子結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合、轉錄因子結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、泛素樣蛋白連接酶結合。利用R 4.1.2 的ggplot2 包將排名前10 的BP、細胞組成和MF 繪制成柱狀圖（圖4）。

圖4 GO 功能富集分析結果（前10 位）

2.6 補氣養血通絡組方治療BIPN 的靶點KEGG通路富集分析

利用R 4.1.2 軟件中的enrichplot、clusterProfiler、org.Hs.eg.db 包進行KEGG 通路富集分析，根據基因富集數目與顯著程度（P＜0.05，Q＜0.05），篩選出主要的70 條KEGG 通路（圖5），主要涉及細胞凋亡、蛋白質聚糖在癌癥中的應用，NFκB 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路、FoxO 信號通路、p53 信號通路、MAPK 信號通路、JAK-STAT 信號通路等與治療BIPN 相關的信號通路。利用ggplot2 包將上述結果可視化，pathview 包將治療相關靶點映射至PI3K-Akt 信號通路并將其可視化（圖6）。

圖5 KEGG 通路富集分析結果（前70 位）

圖6 PI3K-Akt 信號通路

2.7 分子對接

最終選取了槲皮素與TP53（PDB ID：8F2I）和AKT1（PDB ID：6HHF）進行分子對接。affinity值的單位為kcal·mol-1，可以用來比較配體與靶分子相互作用的能力。一般來說，可以將配體的affinity 值分為3 個級別：高affinity：兩者之間的相互作用能力非常強，一般在-7.0 kcal·mol-1以下；中affinity：兩者之間的相互作用能力中等，一般在-7.0～-5.0 kcal·mol-1；低affinity：兩者之間的相互作用能力較弱，一般在-5.0 kcal·mol-1以上。槲皮素與TP53 與AKT1 的affinity 值分別為-7.9 kcal·mol-1和-9.3 kcal·mol-1。提示槲皮素與兩個靶點有良好的親和力，兩者結合的結構比較穩定，其分子對接的3D 模擬結合圖見圖7、圖8。

圖7 槲皮素與TP53 的分子對接模式圖

圖8 槲皮素與AKT1 的分子對接模式圖

3 討論

硼替佐米聯合治療方案最主要的劑量限制性不良反應是硼替佐米藥物誘導出現的周圍神經病變，并且BIPN 的發病率存在增長趨勢[9-11]。但即使終止硼替佐米治療后，神經功能的損害也不是完全可逆的[12-14]。因此，尋求新的治療方法和策略、預防和治療BIPN 相關癥狀十分有必要。

中醫多認為多發性骨髓瘤從屬于骨痹，自擬方劑補氣養血通絡組方用于治療BIPN，以《金匱要略》中黃芪桂枝五物湯為基礎，加以路路通、丹參、雞血藤配制而成，具有滋補氣血、溫養經絡、緩解痹癥、減少疼痛的作用。本研究通過“藥物—活性成分—靶點—疾病”相互作用網絡初步篩選出補氣養血通絡組方治療BIPN 的主要活性成分為槲皮素、木犀草素、熊果酸、山柰酚、丹參酮ⅡA、甘草查爾酮A、β-胡蘿卜素、芒柄花黃素、蘆薈大黃素、異鼠李素。KEGG 通路的富集分析主要是細胞凋亡、蛋白質聚糖在癌癥中的應用，FoxO 信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、AK-STAT 信號通路、IL-17 信號通路、p53信號通路、NF-κB 信號通路、JAK-STAT 信息通路等與BIPN 治療相關的信號通路。

MAPK 信號通路在BIPN 的發展過程中發揮著重要作用。背根神經節神經元中c-Jun N 末端激酶（JNK）和p38 MAPK 的磷酸化增加，這些激酶的藥理學抑制作用對于BIPN 相關病變有促進作用[15]。Liu 等[16]通過動物實驗證明，STAT3 的藥理或遺傳性抑制以及NLRP3 siRNA 的治療可以預防硼替佐米誘導的大鼠和小鼠機械性疼痛的產生。Alé 等[17]研究表明，經過硼替佐米治療，與野生型小鼠相比，NF-κB 活化受損的小鼠出現嚴重程度較低的神經病變。抑制NF-κB 信號通路可能是治療多發性骨髓瘤和BIPN 聯合的一種有前景的治療策略。槲皮素具有抗炎癥、抗癌癥、降低氧化應激、免疫調節等重要功效[18-19]。近年來，槲皮素對神經元的保護作用越來越受到臨床醫生的關注。Godoy 等[20]報道，槲皮素對海馬神經元中由H2O2誘導的神經細胞損傷有保護作用，可緩解由H2O2介導的活性氧分子的增多、線粒體損傷以及神經元損傷，并可降低H2O2對神經元線粒體動力學以及能量代謝的影響。Lee 等[21]發現，槲皮素通過激活ERK1/2 信號通路，從而使小鼠胚胎來源的原代皮層神經元細胞免于受DL-丁硫氨酸亞砜的損傷。Lei 等[22]通過動物實驗證明，槲皮素通過Akt 信號的上調在腦組織中起到了神經保護作用。呂明義等[23]通過動物實驗研究表明，木犀草素通過抑制JAK2/STAT3 信號通路激活，降低組織間的炎性反應以及減少細胞凋亡，并進一步保護神經系統的功能。熊果酸可以通過Nrf 2 信號通路，減少ROS 的產生，增強抵抗氧化應激防御系統從而起到抗氧化的作用，還可以通過調控NF-κB 和MAPK 信號通路，抵抗炎癥反應，起到良好的神經保護作用[24]。

綜上所述，補氣養血通絡組方含有多種活性成分，通過多途徑、多靶點發揮治療BIPN 的作用。本研究通過網絡藥理學研究探究了補氣養血通絡組方中的有效活性成分、潛在靶點以及信號通路。從整體分析了補氣養血通絡組方在多成分、多途徑、多靶點上治療BIPN 的潛在機制，為BIPN 患者提供了一個潛在的治療策略。然而，本研究未考慮中藥方劑在煎煮過程中的化學變化以及體內的代謝過程，因此需要進行更深入的臨床研究，以進一步證實補氣養血通絡組方在治療BIPN 中的作用。