基于網絡藥理學研究抵當芪桂湯治療糖尿病周圍神經病變的潛在機制

張 瀟， 楊景鋒， 陳麗名， 李小會， 屈 杰

（陜西中醫藥大學傷寒金匱教研室，咸陽 712046）

全球成年糖尿病患者達到5.37 億例，約有670 萬人死于糖尿病和糖尿病并發癥[1]。隨著糖尿病病程的延長，患者出現糖尿病微血管病變的概率逐步升高，其中糖尿病周圍神經病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是主要表現之一[2]，發生在約50%的糖尿病患者中[3]。DPN 臨床以遠端對稱多發性感覺運動神經病變最為常見，且有25%的患者有痛覺異常，但目前關于疼痛感產生的機理尚未完全明確[4]。DPN 的發病率高，早期癥狀不明顯，嚴重者可造成不可逆的神經損傷，是糖尿病患者致殘的主要原因之一[5]。

目前，現代醫學多以控制血糖、改善微循環、營養神經、抗氧化等藥物治療DPN，但存在較多不良反應且長期療效表現不佳[6]。中醫藥治療DPN 有一定的優勢，中醫認為DPN 屬于“消渴變證”，根據其臨床表現可歸于痹癥、血痹等范疇[7]。其發病機制之一為氣虛血瘀，治療以益氣養血、活血化瘀為主[8]。抵當芪桂湯是楊景鋒教授基于張仲景《傷寒雜病論》兩首著名方劑（黃芪桂枝五物湯、抵當湯）化裁而來，組方為生黃芪、桂枝、炒白芍、酒大黃、鬼箭羽、水蛭，具有通絡降糖、益氣化瘀的作用[9]。楊景鋒等[10]通過常規劑量抵當芪桂湯治療2 型糖尿病模型大鼠發現，其可以降低空腹血糖與血清游離脂肪酸（serum free fatty acid，FFA）、空腹胰島素（fasting insulin，FINS）含量，升高血清中脂聯素（adiponectin，ADPN）含量，進而降低“糖脂毒性”，保護胰島β 細胞結構。韓思榮等[11]研究發現，抵當芪桂湯治療2 型糖尿病大鼠能夠有效降低其血糖水平，保護胰島細胞，上調胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）表達，下調糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）的水平。本研究利用網絡藥理學從靶點基因層面探索抵當芪桂湯治療DPN 的作用機制，以期為臨床提供中藥治療DPN 的客觀依據。

1 資料與方法

1.1 相關數據庫的建立

TCMSP（https：//tcmsp.php），HERB（http：//herb.ac.cn/），UniProt（https：//www.uniprot.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/），PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/），TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/），DrugBank（https：//www.drugbank.com/），OMIM（https：//omim.org/），PDB（http：//www.rcsb.org/）。

1.2 抵當芪桂湯活性成分與相應靶點的篩選

利用數據庫TCMSP 得到黃芪、桂枝、白芍、大黃、鬼箭羽的活性成分，設篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-like，DL）≥0.18。利用數據庫HERB得到水蛭的活性成分（此數據庫無OB、DL 閾值）。將獲得的潛在活性成分，使用UniProt 數據庫下載限制為Human 的相關基因數據，對抵當芪桂湯的成分和靶點進行整合及轉換基因名稱。

1.3 抵當芪桂湯治療DPN 的相關疾病靶點

使用GeneCards、PharmGKB、TTD、DrugBank、OMIM 數據庫，以“Diabetic Peripheral Neuropathy”為檢索詞查找相關的疾病靶點。將藥物靶點和疾病靶點取交集，得到交集靶點。

1.4 藥物—成分—靶點網絡圖的構建

對藥物活性成分、靶點和疾病交集靶點進行數據處理整合，并導入軟件Cytoscape 3.7.2 構建“藥物—成分—靶點”相互作用網絡。利用Cytoscape 軟件的NetworkAnalyzer 工作計算網絡拓撲參數。

1.5 靶點蛋白互作網絡（PPI）的構建及核心靶點的篩選

將獲得的藥物—疾病交集靶點導入STRING數據庫，限定物種為“Homo Sapiens”進行檢索，運用Cytoscape 軟件中“CytoNCA”功能進行網絡的拓撲屬性分析，根據其度值明確靶點間作用關系，進行兩次核心靶點篩選，得到其核心靶點。

1.6 KEGG 通路富集分析和GO 富集分析

通過R 語言軟件把藥物—疾病靶點數據轉換成基因序列號（ID），再進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析和基因本體（GO）富集分析。

1.7 活性成分—蛋白受體的分子對接

運用PubChem 數據庫和Chem3D 軟件獲取藥物活性成分3D 結構并最小化處理；運用UniProt 數據庫和PDB 數據庫獲取靶點的蛋白結構。運用AutoDock 軟件進行加氫和脫水等處理，再通過PyMOL 軟件進行對接可視化。

2 結果

2.1 抵當芪桂湯治療DPN 的相關疾病靶點

通過數據庫TCMSP 檢索抵當芪桂湯藥物的活性成分為白芍10 個、大黃16 個、鬼箭羽8 個、桂枝7 個、黃芪20 個，通過數據庫HERB 得到水蛭的活性成分59 個（表1、表2）。剔除重復值后獲得藥物成分靶點共923 個。

表1 抵當芪桂湯中的有效成分（藥材）

2.2 抵當芪桂湯治療DPN 的關鍵靶點

通過GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD 和DrugBank 數據庫得到DPN 的疾病靶點，剔除重復值后獲得1 736 個，見圖1。疾病靶點與藥物靶點取交集得到214 個共同靶點，即抵當芪桂湯所含藥物治療DPN 的潛在作用靶點，見圖2。

圖1 DPN 疾病靶點

圖2 抵當芪桂湯藥物靶點與DPN 靶點交集

2.3 抵當芪桂湯治療DPN 的藥物—成分—靶點相互作用網絡

對藥物活性成分、靶點和疾病靶點進行數據整合，并導入Cytoscape 3.7.2 構建抵當芪桂湯治療DPN 的“藥物—成分—靶點”相互作用網絡圖，見圖3。網絡圖包括263 個節點（node），930 條邊（edge）。其中藥物活性成分排名前10 的是槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic acid）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、肝素（heparin）、酪氨酸（tyrosine）、刺芒柄花素（formononetin）、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、棕櫚酸（palmitic acid）。

圖3 藥物—成分—靶點網絡圖

2.4 抵當芪桂湯治療DPN 的PPI 網絡分析

通過STRING 數據庫和CytoNCA 插件，以置信度為0.900 分析得到靶點的PPI 網絡圖，圖中共有181 個節點、452 條邊，見圖4。運用CytoNCA插件獲取PPI 網絡核心，依據靶點節點度值的平均值進行篩選，最終篩選得到SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、TP53 和EP300等為核心靶點，見圖5。這些靶點在PPI 網絡中起連接作用，與抵當芪桂湯的有效活性成分作用的發揮有著緊密的關系，可能成為治療DPN 的核心靶點。

圖4 抵當芪桂湯治療DPN 靶點PPI 網絡圖

圖5 抵當芪桂湯治療DPN 的核心靶點圖

2.5 生物過程注釋及代謝通路分析

2.5.1 抵當芪桂湯治療DPN 關鍵靶點GO 富集分析 通過R 語言軟件以P<0.05 進行篩選，排名前10 位的以GO 富集分析柱狀圖展示，見圖6。關鍵靶點涉及對脂多糖的反應、細胞對化學壓力的反應、MAPK 級聯正調控、氧化應激反應、對外源性刺激的反應、激酶活性的正向調節、調節體液水平、對氧氣水平的反應、對氧含量下降的反應，以及應對缺氧、對活性氧反應等生物過程，主要集中在膜筏、膜微區、囊腔，分泌顆粒管腔、胞質囊泡腔、質膜外側、內吞囊泡和黏著斑等部位，涉及DNA 結合轉錄因素綁定、細胞因子受體結合及RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白磷酸酶綁定、核受體的活性、配體激活的轉錄因子活性、激素綁定等分子功能。

2.5.2 抵當芪桂湯治療DPN 關鍵靶點KEGG 通路富集分析 通過R 語言軟件以P<0.05 進行篩選，排名前30 位的以KEGG 通路富集分析氣泡圖展示，見圖7。關鍵靶點涉及PI3K-AKT 信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、MAPK 信號通路、AGE-RAGE 信號通路在糖尿病并發癥、內分泌抵抗、HIF-1 信號通路等相關通路。

圖7 KEGG 通路富集分析氣泡圖

2.6 活性成分—蛋白受體的分子對接

通過PubChem 數據庫獲取核心藥物活性成分結構并用Chem3D 軟件處理，運用PDB 數據庫和UniProt 數據庫獲取基因靶點蛋白結構。選取核心基因靶點SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、CTNNB1、TP53 和EP300，與藥物活性成分槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、酪氨酸（tyrosine）、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）進行分子對接。一般結合能≤-20.93 kJ·mol-1表示結合作用較好，≤-29.3 kJ·mol-1表示結合作用較強。對接結果見圖8，以對接結果排名前5為例進行部分可視化展示，見圖9。

圖8 分子對接結合鍵能熱圖

圖9 活性成分與關鍵靶點分子對接圖

3 討論

DPN 的發病機制較為復雜，受多個基因及多條信號通路的調控。高血糖、脂代謝異常及胰島素抵抗等因素會誘發代謝通路的異常，如多元醇通路、蛋白激酶C 通路等；同時也導致代謝產物的異常，如改變細胞內線粒體的穩態，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基及糖基化終產物積聚等；而代謝通路和代謝產物的異常引起細胞內氧化應激反應，導致炎癥產生的同時也會激活異常代謝通路，最終導致神經受損[12]。DPN屬于中醫痿證、痹癥、不仁等范疇，其病機分為氣虛血瘀和痰瘀互結等[13]。本研究中抵當芪桂湯君藥以黃芪補脾肺腎，益氣以行血；臣藥以桂枝溫通經脈；佐以白芍養陰生津，補肝體以助肝用，使肝能疏泄以助脾之運化；鬼箭羽、水蛭、大黃三藥并使，化瘀通絡兼祛濕濁[14]。諸藥合用，具有益氣化瘀、氣血同調、標本兼治之功。針對氣虛血瘀的DPN 患者[9]，楊景鋒教授認為2 型糖尿病周圍神經病變的基本病機為氣虛血瘀，抵當芪桂湯切中此病病機，臨床運用此方加減治療糖尿病及其并發癥效果較好[15]。

網絡藥理是通過大數據進行藥物分析的新模式，通過網絡藥理學方法預測抵當芪桂湯治療的靶點，可為抵當芪桂湯治療DPN 的研究提供一定的理論依據。本研究除水蛭外，其余中藥均以OB≥30%、DL≥0.18 的閾值為標準篩選活性成分，未達到閾值標準的活性成分未納入本次研究中。其中篩選得到抵當芪桂湯活性化合物123個，預測藥物活性成分與DPN 的潛在共同靶點214 個。網絡圖提示抵當芪桂湯治療DPN 的有效化合物為槲皮素（quercetin）、熊果酸（ursolic acid）、D-甘露醇（D-mannitol）、山柰酚（kaempferol）、色氨酸（tryptophan）、肝素（heparin）、酪氨酸（tyrosine）、刺芒柄花素（formononetin）、7-O-甲基異微凸劍葉莎醇（7-O-methylisomucronulatol）、棕櫚酸（palmitic acid）等。

山柰酚是一種黃酮類化合物，它及其衍生物具有抗炎、抗氧化和抗抑郁等作用，其中它對神經的保護作用受到廣泛關注[16]。山柰酚可以抑制炎癥細胞因子表達和ROS 的產生，也可通過調節氧化和亞硝化應激及抑制AGE-RAGE 的激活改善疼痛反應，具有抗糖尿病，改善糖尿病神經疼痛的作用[17]。熊果酸是一種五環三萜類化合物，可以通過抗氧化和抗炎對抗神經功能障礙，也可以降低蛋白酪氨酸磷酸酶1B，使胰島素受體磷酸化，從而誘導葡萄糖吸收[18]。熊果酸可以通過抗氧化和抗炎作用改善糖尿病的多種并發癥[19]。槲皮素是自然界的一種黃酮類化合物，同樣具有較強的抗炎、抗氧化、保護心血管、抗腫瘤的作用[20]。槲皮素能改善DPN 模型大鼠坐骨神經中髓鞘中的脫髓鞘，糾正軸突萎縮，且增加了DPN模型大鼠中背根神經節（DRG）神經元，對高糖誘導的周圍神經病變具有神經保護作用[21]。肝素是一種糖胺聚糖藥物，與多種蛋白結合后可以發揮抗炎、抗凝、抗腫瘤等作用[22]。有實驗研究[23]發現，基于肝素的水凝膠，可以更有效、安全地遞送神經營養因子［神經生長因子（NGF）和bFDF］共同到達坐骨神經損傷的糖尿病大鼠中以增強受損的坐骨神經髓鞘再生；軸突生長，出現周圍神經再生。

本研究的關鍵靶點蛋白有MAPK14、MAPK1、AKT1、ESR1、SRC、EGFR、FOXO3、JUN、CTNNB1、IL6、TP53、STAT3、PIK3CA、EP300、MAPK3 和FOS。根據度值得到排名前10 的核心靶點為SRC、STAT3、MAPK3、PIK3CA、MAPK1、AKT1、JUN、CTNNB1、TP53 和EP300。絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen activated protein kinase 3，MAPK3）是MAP 激酶家族的一員，也被稱為細胞外信號調節激酶（ERK）1，MAPK3 參與多種細胞過程，包括增殖、炎癥和細胞代謝等，當肝臟在空腹期間通過分解糖原和糖異生將葡萄糖釋放到循環中時，MAPK3 在維持葡萄糖穩態中起主要作用[24]。STAT3 是信號轉導和轉錄激活因子3。通過檢測神經損傷誘導神經疼痛性大鼠模型的背根神經發現，Janus 激酶2（JAK2）/STAT3 表達上調，磷酸化的STAT3 和JAK2 表達增強，且通過電針抑制背根神經中的JAK2/STAT3 信號傳導后，神經損傷誘發的神經疼痛緩解[25]。腫瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）可誘導凋亡調節因子和糖酵解轉換途徑，降低ROS 水平，維持細胞內氧還原，增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），調節細胞內葡萄糖代謝[26]。研究[27]表明，TP53 在受損的神經元中表達是升高的，但它的缺失可以抑制神經元的凋亡。

GO 富集結果顯示，抵當芪桂湯中的藥物作用于DPN 的靶點主要涉及DNA 結合轉錄因素綁定、細胞因子受體結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合等分子功能，其作用主要集中在膜筏、膜微區、囊腔，分泌顆粒管腔、胞質囊泡腔、質膜外側等部位，在對脂多糖的反應、細胞對化學壓力的反應、MAPK 級聯正調控、氧化應激反應、對外源性刺激的反應等生物過程中發揮作用。

KEGG 通路富集結果提示，抵當芪桂湯的作用靶點主要集中在PI3K-AKT 信號通路、MAPK信號通路、AGE-RAGE 信號通路在糖尿病并發癥、內分泌抵抗和HIF-1 信號通路等。AGERAGE 信號通路的傳導導致NADPH、氧化酶、MAPK、蛋白激酶C 等多個細胞內信號通路激活，促進腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-6、Il-1β等多種促炎細胞因子的表達，導致外周神經元節段性脫髓鞘[28]。實驗研究[29]表明，通過抑制AGERAGE 減少氧化應激，減少磷酸化的NF-κB，可以改善動物機械負荷引起的疼痛閾值，在動物坐骨神經切片下觀察到，受藥物抑制AGE－RAGE信號治療的髓鞘神經纖維受損傷程度小。PI3KAKT 信號通路參與多個生物過程，包括細胞增殖、細胞凋亡、葡萄糖代謝等[30]，它的激活傳導促進了糖尿病大鼠背根神經節神經元的神經突生長[31]。MAPK 信號通路被激活作為很多信號通路傳導的反應，且有研究調查MAPK 信號通路參與炎癥反應，通過細胞實驗研究發現抑制MAPK 途徑可以使脂多糖誘導的RAW264.7 巨噬細胞中磷酸化的P38 和ERK 下調，達到抗炎的作用[32]。因此，抵當芪桂湯的有效成分可以通過調控多個信號通路，參與多個生物過程，發揮治療DPN 的作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法預測了抵當芪桂湯治療DPN 的化學成分、作用靶點及信號通路，體現了中藥復方多成分、多靶點、多通路的特點。然而，網絡藥理學存在一定局限性，在抵當芪桂湯實際藥效、毒理性、量效關系等方面還需相關實驗研究加以驗證。