β-胡蘿卜素高效降解菌株的篩選鑒定及產香研究

梁 偉，蔡聯合，蘇 贊，陳義昌，鄒克興，王明月，王 伊

（1.廣西中煙工業有限責任公司，廣西南寧 530001；2.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471023）

類胡蘿卜素是在分子兩端各有1 個不飽和己烯環的四萜化合物，其存在于植物和有光合作用的細菌中，是一類重要的香料前體物質[1]。目前，已知的主要胡蘿卜素有α，β和γ共3 種同分異構體，其中β-胡蘿卜素占主要地位[2]。β-胡蘿卜素被氧化分解產生α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內酯和β-大馬酮等多種揮發性致香物質[3]。這類致香物質具有較低的感官閾值，是許多香料的特征香味[4]。β-胡蘿卜素降解主要有熱降解、光氧化降解、化學氧化降解和生物降解[5]。熱降解和光氧化降解具有降解條件不夠溫和的缺點，化學氧化降解則選擇性差。盡管利用傳統的有機合成或從植物中提取的方法仍具有一定的可行性，但是近年來，通過生物技術制備的天然香料及其酶解-酶促反應生成的天然香料正逐步成為其主要的降解模式，且研究也表明生物降解具有降解效率高、專一性強、催化條件溫和、產物中目標化合物含量高等優點，備受學者關注[6]。目前，研究發現酵母菌、芽孢桿菌和巴氏葡萄球菌等微生物能降解β-胡蘿卜素[7]。有研究以新鮮水果為樣本，篩選出一株降解β-胡蘿卜素產生香味物質β-紫羅蘭酮的高效菌種。Zorn H 等人[8]篩選的絲狀真菌和酵母菌降解β-胡蘿卜素產生二氫獼猴桃內酯和β-紫羅蘭酮香味物質。蔡程晨[9]從土壤中篩選到一株降解類胡蘿卜素的枯草芽孢桿菌，并將其應用于芒果汁發酵，結果顯示類胡蘿卜素降解產物含量有所增加。田爭福等人[10]使用具有類胡蘿卜素降解能力的庫特氏菌發酵液輔助枸杞酒發酵，發酵結束后其香氣成分改善。這些研究也表明，通過生物降解類胡蘿卜素改良產品風味特征是可行的。

以學校里常年落葉的土壤為樣本，通過形態觀察、生理生化和分子生物學鑒定等技術手段，篩選得到β-胡蘿卜素高效降解菌株TR-3，旨在為生物降解β-胡蘿卜素提供高效降解新菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤，采集自河南科技大學校園內常年落葉的地塊；β- 胡蘿卜素，北京索萊寶科技有限公司提供；β-胡蘿卜素儲備液，避光條件下將β-胡蘿卜素（10 mg） 溶于二氯甲烷（20 mL） 中，溶解后，加入Tween-80（2 g） 進行乳化，減壓濃縮除去二氯甲烷，將殘留物分散在蒸餾水（100 mL） 中，微孔濾膜過濾得橘黃色的儲備液，置于4 ℃冰箱待用。

1.2 儀器與設備

TSQ9000 三重四極桿GC-MS，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司產品；梯度PCR 儀，德國Eppendorf 公司產品；UV-2600 型紫外可見分光光度計，日本島津公司產品。

1.3 篩選培養基[11]

（1） 富集培養基。蔗糖15 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硝酸鈉3 g/L，酵母粉2 g/L。初始pH 值調為7.2~7.4，于121 ℃條件下滅菌20 min。

（2） 分離培養基。富集培養基中加入2%的瓊脂20 g/L，β-胡蘿卜素儲備液20 mg/L。β-胡蘿卜素經微孔濾膜過濾除菌，加入冷卻至60 ℃的分離培養基中，倒平板，備用。

1.4 試驗方法

1.4.1β-胡蘿卜素高效降解菌的篩選

取1 g 土樣溶于100 mL 無菌水中，振蕩12 h，抽濾得菌懸液。用移液槍吸取2 mL 菌懸液加入100 mL富集培養基中，于30 ℃下以轉速150 r/min 避光振蕩培養12 h。

（1） 初篩。對振蕩12 h 的菌液進行梯度稀釋，分別選取10-3，10-4，10-5濃度涂布于分離培養基上，設置空白對照，于30 ℃下避光培養24~48 h。觀察菌對β-胡蘿卜素的分解。

（2） 復篩。選取透明圈明顯的單菌落接種于發酵培養基中，于30 ℃下以轉速150 r/min 避光培養24 h。β-胡蘿卜素降解能力較強的菌株通過測定溶液中β- 胡蘿卜素降解率和降解產物進行篩選。

1.4.2β-胡蘿卜素標準曲線的繪制

采用紫外可見分光光度計測定β- 胡蘿卜素溶液全波長得出，β-胡蘿卜素于波長460 nm 處有最大吸收峰，用石油醚分別配制質量濃度為0，2.5，5.0，7.5，10.0 mg/L 的β-胡蘿卜素標準溶液，用石油醚作為空白對照，于波長460 nm 處對β-胡蘿卜素標準溶液的吸光度進行測量，將其記錄為OD460，將OD460作為縱坐標（Y），將β-胡蘿卜素質量濃度作為橫坐標（X），制作出標準曲線[12]。

1.4.3 菌種生長狀態測定

固定培養時間過后，取3 mL 降解菌液，以初始培養基為空白對照，在波長為600 nm 的紫外可見分光光度計中，對菌液的吸光度值進行測定，作為菌種生長狀態的判定標準，記為OD600[13]。

1.4.4β-胡蘿卜素降解率測定

測得OD600后，發酵液在避光條件下，于4 ℃條件下以轉速8 000 r/min 高速離心10 min，留下分離出的沉淀，加入與上清液等體積的石油醚，振蕩，使沉淀分散，讓沉淀中的β-胡蘿卜素完全溶解在石油醚中，靜置取上清液，將得到的β-胡蘿卜素溶液，用石油醚做空白對照，于波長460 nm 處測定溶液吸光度，根據計算公式計算降解率[14]。

1.4.5β-胡蘿卜素降解產物的萃取

（1） 頂空固相微萃取[15]。量取8 mL 避光培養24 h的β-胡蘿卜素降解菌液于20 mL 頂空瓶中，加入2 g NaCl 調節離子濃度，添加8 μL 的2 -辛醇作為內標溶液，封口，在40 ℃磁力攪拌器上平衡10 min，插入裝有50/30 μm 萃取頭的手動進樣手柄，吸附萃取40 min 后，收回萃取頭纖維部分再取出萃取頭，插入GC-MS 進樣口于250 ℃下解析5 min，用于GC-MS 分析。

1.4.6β-胡蘿卜素降解產物的GC-MS 工作條件

（1） GC 條件。參照參考文獻[16]稍作修改，色譜柱為HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm），載氣：高純度的He，流速1.0 mL/min，進樣維持250 ℃，程序升溫為起始溫度45 ℃，將此溫度儲存5 min，以5 ℃/min 的速率上升到280 ℃保持20 min，溶劑延遲6 min，進樣量1.0 μL，分流比5∶1。

（2） MS 條件。電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，檢測器溫度280 ℃，掃描范圍為30~450m/z。

1.4.7β-胡蘿卜素高效降解菌的鑒定

（1） 菌落形態觀察。包括菌落大小、形狀、邊緣、光澤、質地、顏色和透明程度等。

（2） 顯微形態觀察。采用革蘭氏染色和顯微鏡觀察。

（3） 16S rDNA 序列分析。

通過16S rDNA 測序對篩選菌株進行分子鑒定。采用細菌基因組DNA 提取試劑盒（BioFlux，Kyoto，Japan） 進行DNA 的提取。以提取的DNA 為模板，進行16S rDNA 擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增結果，PCR 產物送生工生物工程（上海） 股份有限公司進行測序。將所測16S rDNA 序列在GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/） 中進行BLAST 比對，選出相似性大于98%的部分序列，以16S rDNA同源性為基礎MEGA7 軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 β -胡蘿卜素標準曲線的繪制

胡蘿卜素標準曲線見圖1。

圖1 胡蘿卜素標準曲線

吸光度（Y） 與β-胡蘿卜素質量濃度（X） 的回歸方程為Y=0.200 32X-0.038，相關系數R2=0.997 1，這表明在0~10 mg/L 的質量濃度范圍內，β-胡蘿卜素質量濃度與吸光度具有良好的線性關系。

2.2 β -胡蘿卜素高效降解菌的篩選

采用富集培養基和分離培養基篩選出具有明顯降解透明圈，且在培養過程中有明顯香味產生的菌株。

所篩選菌株在類胡蘿卜素培養基平板上的菌落形態和降解結果圖見圖2。

圖2 所篩選菌株在類胡蘿卜素培養基平板上的菌落形態和降解結果圖

2.3 β -胡蘿卜素降解率

β-胡蘿卜素降解率測定見圖3。

圖3 β -胡蘿卜素降解率測定

對初篩的菌株進行β-胡蘿卜素降解率的測定。由圖3（a） 可知，含有β-胡蘿卜素的培養液接種后，于30 ℃條件下以轉速150 r/min 避光培養24 h，培養液的顏色明顯變淺且變透亮。對3 株菌的降解能力分析顯示，菌株TR-3 對β-胡蘿卜素降解能力最強，降解率達到86.65%；菌株TR-2 和TR-1 對β-胡蘿卜素的降解能力較弱。故接下來對菌株TR-3進行進一步的研究分析。

2.4 菌種鑒定

2.4.1 形態特征鑒定

菌株TR-3 在添加β-胡蘿卜素的固體培養基的菌落呈現出透明，形狀較規則，表面光滑且濕潤，邊緣整齊，容易挑起。革蘭氏染色結果為陰性，光學顯微鏡觀察菌體多為短桿狀。

菌株TR-3 的革蘭氏染色結果（400×） 見圖4。

圖4 菌株TR-3 的革蘭氏染色結果（400×）

2.4.2 生理生化試驗

該菌株能利用表1 中的糖產酸產氣，且可看到紫色培養基全部變黃，與《常見細菌系統鑒定手冊》中關于腸桿菌的描述基本一致，結合形態學鑒定結果，初步鑒定TR-3 為腸桿菌。

表1 菌株TR-3 生理生化試驗結果

菌株TR-3 生理生化試驗結果見表1。

2.4.3 菌株TR-3 的16S rDNA 分子鑒定

將16S rDNA 測定序列于NCBI Blast 進行同源序列檢索，構建系統進化樹。菌株TR-3 與Enterobacter sp.strainAPCB2（ON564857.1）、Enterobacter hormaechei subsp.Xiangfangensis strainER48（MT124573.1） 同源性最高。綜合形態學觀察結果、生理生化試驗結果及16S rDNA 分子系統發育分析，鑒定菌株TR-3為腸桿菌屬。

TR-3 菌株的16S rDNA 系統進化樹見圖5。

圖5 TR-3 菌株的16S rDNA 系統進化樹

2.5 β -胡蘿卜素降解產物分析

菌株TR-3 降解β-胡蘿卜素產生香氣物質，對降解菌液進行頂空固相微萃取后，樣品進行GC-MS分析。

香氣成分GC-MS 圖見圖6，色譜峰對應時刻的質譜圖見圖7。

圖6 香氣成分GC-MS 圖

圖7 色譜峰對應時刻的質譜圖

該菌株降解β-胡蘿卜素后共檢出揮發性成分45 種，在這些產物中，仲辛酮相對含量最高（37.69%），其次是苯乙醇（13.88%）、磷酸三丁脂（5.55%）、癸酸乙酯（5.54%）、β-紫羅蘭酮（4.8%） 及月桂酸乙酯（3.73%），其他降解產物的相對含量較低，除β-紫羅蘭酮和月桂酸乙酯的相對含量在3%以上外，其余降解產物的相對含量均在3%以下。原本預測產物中二氫獼猴桃內酯和β-紫羅蘭酮相對含量最高，但實際測得二氫獼猴桃內酯含量僅有0.16%，其原因可能為該菌種降解β-胡蘿卜素的反應不同，導致其他產物含量增高。

3 結論

從土壤中分離篩選出一株高效降解β- 胡蘿卜素的菌株TR-3，通過形態觀察、生理生化和分子生物學鑒定該菌株為腸桿菌屬；其對β-胡蘿卜素的降解能力較高，降解率達86.65%。菌株TR-3 對β-胡蘿卜素的降解產物中共檢出揮發性成分45 種，主要包括仲辛酮（37.69%）、苯乙醇（13.88%）、磷酸三丁脂（5.55%）、癸酸乙酯（5.54%）、β-紫羅蘭酮（4.80%） 及月桂酸乙酯（3.73%） 等致香物質。試驗為β-胡蘿卜素的生物降解提供了一株高效降解菌，研究結果對類胡蘿卜素生物法制備香精香料提供了理論基礎。