隴西臘肉加工過程中亞硝胺與理化指標的相關性分析

范小寧,師希雄,包曉明,趙瑞娜,陳敬敬,郭雨軒

(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070)

隴西臘肉作為西北著名的腌臘肉制品,是以豬肉為主要原料,添加食鹽、雪花鹽、香辛料等,采用干腌法在0～7 ℃條件下腌制30～45 d,之后在8～13 ℃條件下晾曬35 d左右,待臘肉表面出油、皮面紅亮則晾曬階段結束,最終制成的隴西臘肉色澤鮮紅、瘦而不柴、肥而不膩、臘味濃郁、咸香可口,深受廣大消費者喜愛[1]。但傳統隴西臘肉腌制時使用亞硝酸鹽,在加工過程中易導致生物胺、亞硝胺等有害物質的生成,可能會為食品安全帶來隱患[2]。其中國際癌癥研究機構認定亞硝胺是強致癌物質,過量攝入會導致器官癌變,嚴重危害人體健康[3]。

亞硝胺是N-亞硝基類化合物的總稱,其主要是通過亞硝酸鹽與胺類物質反應生成,胺類物質可由蛋白質分解產生,亞硝酸鹽可由硝酸鹽轉化生成,除此之外,加工過程中的pH值、食鹽含量、丙二醛(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)、揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen, TVB-N)、水分含量等理化因素在一定程度上也調節著亞硝胺的生成[4-5]。ROSEIRO等[6]報道葡萄牙香腸中的pH值在5.5左右有利于具有產胺酶活性的微生物繁殖,增加亞硝胺前體物的形成。朱清清[7]通過對比臘肉中空白組和實驗組(添加亞硝酸鈉)亞硝胺的含量發現,空白組中并未檢測出亞硝胺,表明亞硝酸鈉的添加是導致亞硝胺生成的必要條件。姜皓[8]研究表明西式培根在加工過程中,脂肪氧化越嚴重,TBARS值越大,越有利于亞硝胺的形成;除此之外加工溫度和輔料的添加也對亞硝胺的形成有重要影響[9]。由此可見,臘肉中亞硝胺的生成與理化指標具有重要聯系。近年來,有學者研究表明金華火腿、如皋火腿、哈爾濱紅腸等腌臘肉制品在制作過程中,均伴隨著亞硝胺的生成,且亞硝胺的生成與理化指標之間具有一定的相關性[10-12]。然而,關于隴西臘肉中亞硝胺的生成與理化指標的相關性未見報道。

因此,本試驗通過研究隴西臘肉加工過程中亞硝胺與理化指標的變化量,分析亞硝胺的生成與理化指標的相關性,以期為隴西臘肉生產過程中亞硝胺的控制及品質改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10種亞硝胺標品,分別為N-二甲基亞硝胺(N-nitrosodimethylamin, NDMA)、N-二乙基亞硝胺(N-nitrosodiethylamine, NDEA)、N-甲基乙基亞硝胺(N-nitrosomethylethylamine, NMEA)、N-二丁基亞硝胺(N-nitrosodinbutylamine, NDBA)、N-二丙基亞硝胺(N-nitrosodinpropylamine, NDPA)、N-亞硝基哌啶(N-nitrosopiperidine, NPIP)、亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine, NPYR)、N-亞硝基嗎啉(N-nitrosomorpholine, NMOR)、N-亞硝基二苯胺(N-nitrosodiphenylamine, NDPHA)、N-亞硝基二異丙胺(N-nitrosodiisopropylamine, NDIPA),純度均≥99.9%,常州市壇墨質檢科技股份有限公司。

固相萃取柱(C18),天津博納艾杰爾科技有限公司;甲醇、鹽酸、乙腈、甲酸、二氯甲烷(均為色譜純),天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1290-6460高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀,美國安捷倫公司;RE-52 C旋轉蒸發儀,鄭州亞榮儀器有限公司;FSH-2A高速勻漿機,江蘇友聯儀器研究所;TGL-16MC冷凍離心機,湖南湘儀集團;KH3200B超聲波清洗器,昆山禾創超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水系統,Millipore公司。T6新世紀紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司;HX202-電子天平,慈溪市天東衡器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 隴西臘肉的制作方法及樣品采集

1.3.1.1 隴西臘肉制作方法

工藝流程:

原料—修整—腌制—晾曬—干燥—成品

配料:肉塊100 kg,食鹽10%,5 g亞硝酸鹽,花椒、小香、桂皮等輔料少許,將香料粉碎后混勻[1-2]。

1.3.1.2 樣品采集

隴西臘肉購買于甘肅隴源情肉制品有限公司。按照隴西臘肉一個完整的生產周期采集樣品,根據其加工過程中的關鍵階段,確定原料肉(0 d)、腌制中期(20 d)、腌制末期(45 d)、晾曬中期(65 d)、晾曬末期(80 d)5個加工時間點進行采樣,采集的樣品當天完成分樣,之后放入-80 ℃冰箱保存,以備相關指標的測定。相關樣品信息見表1。

表1 樣品信息Table 1 Information of samples

1.3.2 pH的測定

參照馬儷珍等[10]的方法略作修改,準確稱取攪碎后的樣品5.00 g于50 mL的離心管中,按樣品與水以體積比1∶10的比例添加超純水,然后以200 r/min搖床5 min,然后用pH計測定,每個樣品平行測定3次。

1.3.3 TVB-N的測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》半微量定氮法測定。

1.3.4 水分測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》直接干燥法測定。

1.3.5 食鹽含量測定

參照GB 5009.44—2016《食品安全國家標準 食品中氯化物的測定》銀量法測定。

1.3.6 亞硝酸鈉殘留量的測定

參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》分光光度法測定。

1.3.7 TBARS測定

參照GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》分光光度法測定

1.3.8 亞硝胺測定

前處理方法:參照張瀟[13]的方法略作修改,稱取5 g臘肉樣品,加入10 mL乙腈,超聲15 min,置于-20 ℃冰箱中冷凍40 min,取出加入4 g無水Na2SO4,1 g NaCl,渦旋1 min,在4 ℃條件下以6 000 r/min離心10 min。取上清液,加入5 mL正己烷,重復上述操作。在固相萃取柱中緩慢加入5 mL的甲醇溶液活化C18柱,活化完成后加入樣品,加入2 mL甲醇沖洗,收集萃取液,溫度40 ℃旋轉蒸發至1 mL,加水定容至2 mL,過0.22 μm的有機濾膜后,上機檢測,流動相A為0.1%的甲酸水,流動相B為100%乙腈。洗脫程序為:0～3 min,70%的流動相A+30%流動相B;3～5 min,25%流動相A+75%流動相B;5～6.5 min,5%的流動相A+95%流動相B;6.5～8 min,70%流動相A+30%流動相B。

色譜柱EclipsePlus-C18柱;柱溫35 ℃;流速0.3 mL/min;進樣量10 μL;檢測時間8 min;波長230 nm。

質譜條件:掃描方式電噴霧電離源;氣簾氣25 psi;電離電壓5 000 V;離子源溫度550 ℃;霧化氣50 psi;加熱輔助氣50 psi;碰撞氣medium;采集模式為多反應監測(multiple reaction monitoring, MRM)模式,見表2。

表2 十種N-亞硝胺類化合物的MRM參數Table 2 MRM parameters of 10 N-nitrosamine compounds

1.4 統計分析

使用SPSS 20.0統計軟件對本試驗結果進行顯著性分析,采用Origin 2017軟件繪制柱狀圖,每組試驗重復3次,用Duncan’s法進行多重比較,P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 隴西臘肉加工過程中pH值的動態變化

由圖1可知,在腌制中期,隴西臘肉的pH值顯著下降(P<0.05),腌制末期及晾曬階段pH值變化不顯著(P>0.05),pH值在腌制中期達到最低值5.51,這可能是因為在此過程中乳酸菌代謝產生了乳酸,最終導致pH值下降[14];在腌制末期,肉中的蛋白質、游離氨基酸等物質被分解產生了堿性物質,導致pH值上升至5.92;晾曬過程中,乳酸含量減少,堿性物質增多,導致pH值逐漸上升[14]。本研究結果與李澤眾等[14]報道的云南三川火腿在腌制與晾曬過程中pH值的變化趨勢一致。隴西臘肉最終pH值為6.08,與國內幾種腌臘肉制品的同時期對比屬于中等水平,其低于三川火腿[14]的pH值6.65和宣威火腿[15]的pH值6.22,高于如皋火腿[11]中的pH值5.75,這可能是由于采用的腌制配料以及晾曬條件的不同導致[15]。

圖1 隴西臘肉加工過程中pH值的變化Fig.1 Change of pH in Longxi bacon processing process

2.2 隴西臘肉加工過程中TBARS值的動態變化

TBARS值是指食品中的脂肪在氧化分解后產生的次級產物與硫代巴比妥酸在一定條件下反應的結果[16]。由圖2可知,隨著隴西臘肉加工過程的進行,TBARS值呈顯著上升的趨勢(P<0.05),原料肉中的TBARS值為0.06 mg/kg,腌制階段TBARS值逐漸上升至0.43 mg/kg;在晾曬過程中,溫度的升高和O2含量的增加均加速了脂肪的氧化程度[17],導致TBARS值逐漸上升至1.37 mg/kg,魏法山[11]報道的如皋火腿在加工過程中TBARS值呈顯著上升趨勢(P<0.05),與本研究變化趨勢一致,其最終含量為1.68 mg/kg,與本試驗結果接近。李暮春等[18]研究發現風干腸中的TBARS值呈顯著上升趨勢(P<0.05),與本研究變化趨勢一致,其最終含量為2.6 mg/kg,高于本試驗結果。

2.3 隴西臘肉加工過程中水分的動態變化

水分是保證肉制品化學反應得以進行的重要條件[16]。由圖3可知,在隴西臘肉加工過程中,水分呈顯著下降的趨勢(P<0.05),原料肉中水分含量為72.93%,在腌制過程中水分含量的變化為68.26%～64.59%,腌制期水分下降的主要原因是食鹽不斷滲透進入肉中,導致肉不斷失水[19];晾曬中期水分下降較快,晾曬末期由于食鹽已經基本滲透進肉中,臘肉中的水分下降速率減慢,在晾曬后期可以明顯看到臘肉表面已經干硬,最終水分含量為58.64%。李澤眾等[14]研究發現云南三川火腿原料肉中水分含量為74.45%,在腌制階段逐漸下降到63%,晾曬結束后水分含量為61%左右,與本試驗研究結果相似。耿翠竹等[20]報道宣恩火腿原料肉到腌制階段水分下降較快,晾曬末期下降速度相對較慢,與本研究結果一致。

圖3 隴西臘肉加工過程中水分的變化Fig.3 Change of moisture content in Longxi bacon processing process

2.4 隴西臘肉加工過程中亞硝酸鈉殘留量動態變化

亞硝酸鈉不僅是亞硝化反應的底物,還是肉制品發色和獨特風味形成的重要物質[20]。由圖4可知,亞硝酸鈉殘留量呈顯著下降趨勢(P<0.05),原料肉中亞硝酸鈉含量為0 mg/kg,腌制中期為15.47 mg/kg,腌制末期到晾曬末期這一階段,亞硝酸鈉殘留量變化為11.52～3.37 mg/kg,這可能是因為隨著加工過程的進行,一部分亞硝酸鈉通過轉化參與了亞硝胺的反應進程,另一部分亞硝酸鈉與肌紅蛋白中的血紅素鐵反應形成亞硝基血紅素,參與了肉色的形成,晾曬后期可以明顯看到肉色變紅[21]。魏法山[11]研究的如皋火腿在加工過程中亞硝酸鈉殘留量在腌制中期到晾曬末期呈顯著下降的趨勢(P<0.05),與本研究趨勢一致,其晾曬末期含量為8.99 mg/kg,高于本研究,這可能是因為加工條件和輔料添加量不同導致。

2.5 隴西臘肉加工過程中食鹽含量的動態變化

食鹽具有抑菌、防腐作用,能夠增加肉的持水性,有助于獨特風味的形成[22]。由圖5可知,隨著加工的進行,隴西臘肉中的食鹽含量呈顯著上升的趨勢(P<0.05),原料肉中的食鹽含量為0.58%,食鹽在腌制階段變化量為2.84%～5.01%,這可能是因為隨著加工過程的進行,食鹽不斷滲透進入肉中導致的食鹽含量升高[22];晾曬過程,臘肉中食鹽的含量逐漸趨于平衡,最終含量為6.05%。李澤眾等[14]研究發現三川火腿在腌制階段食鹽含量呈顯著上升趨勢(P<0.05),晾曬階段上升不明顯,與本研究結果一致,其最終的食鹽含量為3.5%左右,低于本研究。張遠等[15]研究發現宣威火腿在晾曬結束后食鹽含量為5.8%左右,與本研究結果接近。

圖5 隴西臘肉加工過程中食鹽含量的變化Fig.5 Change of salt content in Longxi bacon processing process

2.6 臘肉加工過程中TVB-N值的動態變化

TVB-N是指微生物和酶將食品中的蛋白質分解所產生的氨類以及胺類含氮物質的量,是表征肉制品新鮮程度的指標,TVB-N值越大,肉品腐敗程度越高[17]。由圖6可知,隨著加工過程的進行,隴西臘肉中的TVB-N值呈顯著上升趨勢(P<0.05),原料肉中TVB-N值為5.57 mg/100 g,腌制期間變化量為34.43～43.03 mg/100 g,在腌制過程中,食鹽不斷滲透,肉發生脫水,導致肉中的蛋白質水解速率下降,所以這一階段TVB-N值增長緩慢[18];晾曬階段TVB-N值呈顯著上升趨勢(P<0.05),這可能是因為微生物繁殖速率加快,且蛋白質水解程度升高,TVB-N值上升較快,最終含量為73.47 mg/100 g。本試驗趨勢與如皋火腿[11]中的TVB-N在腌制與晾曬階段的變化趨勢一致,陳露等[23]研究發現三川火腿中的TVB-N在腌制階段上升較緩慢,晾曬階段上升速率加快,與本研究結果一致,其TVB-N最終含量為70.54 mg/100 g,與本研究結果相似。

圖6 隴西臘肉加工過程中TVB-N值的變化Fig.6 Change of TVB-N in Longxi bacon processing process

2.7 隴西臘肉加工過程中亞硝胺的動態變化

2.7.1 十種亞硝胺的保留時間及標準曲線

分別以10種亞硝胺的不同濃度為橫坐標,該濃度下所對應的峰面積為縱坐標制作標準曲線,其線性關系如表3所示。結果顯示,各亞硝胺標準曲線的決定系數R2均大于0.999,各組化合物在2.5×10-9～1.0×10-7線性良好,可以滿足定量分析的需要。

表3 十種亞硝胺保留時間、標準曲線Table 3 Retention time and linear equation of 10 nitrosamines

2.7.2 隴西臘肉加工過程中亞硝胺的動態變化

由表4可知,隴西臘肉加工過程中共檢出6種亞硝胺,分別是:NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NDPHA。未檢測到NMOR、NPIP、NDPA、NDBA、NDIPA,其中NDBA一般是由橡皮袋中遷移過去的,隴西臘肉并未見用橡皮袋包裝且未檢測到NDBA;NPIP多見于添加胡椒粉的油煎培根中,隴西臘肉并未添加胡椒粉,不滿足NPIP生成的條件,并未檢測到[24]。隴西臘肉原料肉中未檢測出亞硝胺。由表4可知,隴西臘肉腌制階段亞硝胺總量呈顯著上升趨勢(P<0.05),晾曬階段上升不顯著(P>0.05)。腌制階段亞硝胺總量變化為3.64～5.61 μg/kg,晾曬階段亞硝胺總量變化為6.57～7.06 μg/kg。其中NDMA呈顯著上升趨勢,其總量變化為0.58～1.05 μg/kg,;NMEA含量從腌制中期0.51 μg/kg增長到晾曬中期1.79 μg/kg,最后下降到晾曬末期1.59 μg/kg;NDEA由腌制中期0.39 μg/kg上升到腌制末期1.38 μg/kg,之后下降到晾曬末期0.39 μg/kg;NPYR、NDPHA在整個加工階段呈顯著的上升趨勢(P<0.05),其總量變化分別為1.73～2.72 μg/kg、0.43～1.31 μg/kg。

表4 隴西臘肉加工過程中10種亞硝胺的動態變化 單位:μg/kg

肉制品在加工過程中,亞硝胺的生成受到眾多因素影響[如溫度、亞硝酸鈉的添加量、水分含量、加工時間、亞硝胺的前體物質(胺類物質、游離氨基酸等),微生物、酶類、抑制劑的添加,pH值等]。在腌制階段,由于肉中的微生物活動所產生的酶類及脂肪氧化所產生的醛類物質的增加,肉制品腐敗所產生的胺類物質、pH值的變化,均為亞硝胺前體物質的形成提供了有利條件,導致亞硝化反應得以快速進行。朱清清[7]研究的臘肉中NDMA、NDEA、NPYR在腌制階段均呈顯著上升趨勢(P<0.05),李暮春等[18]研究的風干腸中NDPHA在腌制階段呈現顯著的上升趨勢,劉璐璐等[25]研究的重組培根在腌制過程中NMEA、NPYR含量呈顯著上升趨勢(P<0.05),均與本研究結果一致,表明腌制階段有利于亞硝胺的生成;在晾曬過程中,臘肉的水分含量下降,食鹽含量不斷升高,進而抑制了部分微生物的活動[22],導致亞硝化反應速率降低,亞硝胺總量增加較少,魏法山[11]報道的如皋火腿在晾曬過程中亞硝胺NDMA含量由0.11 μg/kg上升到0.31 μg/kg,NDEA含量由0.37 μg/kg逐漸下降至0.07 μg/kg,除理化反應因素之外,可能是由于NDEA具有光解作用,在紫外線照射下會發生分解[7],這是導致晾曬過程中NDEA減少的原因之一,與本研究趨勢一致。朱清清[7]研究表明,臘肉在晾曬階段NPYR含量逐漸上升,這可能是由于內源酶作用導致的與NPYR合成有關的胺類物質含量增加,導致晾曬階段NPYR含量上升[7],與本研究結果一致。李暮春等[18]研究的風干腸中NDPHA在晾曬階段呈現顯著上升趨勢,與本研究結果一致。由此可見,在隴西臘肉加工過程中,微生物污染、各種理化指標的作用、以及加工方式都會對隴西臘肉中亞硝胺的形成產生影響。

2.8 隴西臘肉加工過程中理化指標與亞硝胺相關性分析

由表5可知,在隴西臘肉加工過程中,6種亞硝胺與pH值之間均無顯著相關性(P>0.05),這可能是因為隴西臘肉加工過程中pH值的變化范圍不大,對亞硝胺前體物質的形成影響較小,未對產胺微生物和酶活性產生顯著影響[26]。朱清清[7]研究表明臘肉中NDMA、NDEA、NPYR與pH值無顯著相關性(P>0.05),魏法山[11]研究的如皋火腿在加工過程中pH值與NDEA、NPYR、NDMA的形成均無顯著正相關性,與本研究結論一致。

表5 隴西臘肉加工過程中理化指標與亞硝胺相關性分析Table 5 Correlation analysis of physical and chemical indexes and nitrosamines in Longxi bacon processing process

NDEA、NPYR與TBARS無顯著相關性(P>0.05),NDMA與TBARS值呈極顯著正相關(P<0.01),NMEA、NDPHA與TBARS值呈顯著正相關(P<0.05),這可能是因為脂肪氧化的產物丙二醛等與NDPHA、NMEA、NDMA的形成具有密切聯系[19]。魏法山[11]研究發現如皋火腿中NDEA與TBARS值無顯著相關性(P>0.05),與本研究結果一致,李暮春等[18]研究的風干腸中NDEA與TBARS值均無顯著相關性(P>0.05),NDPHA與TBARS值呈顯著正相關(P<0.05),與本研究結果一致。

NDMA、NDEA與水分無顯著相關性(P>0.05),NDPHA與水分呈極顯著負相關(P<0.01),NPYR、NMEA與水分呈顯著負相關(P<0.05),這可能是因為隨著水分含量逐漸下降,導致亞硝酸鈉、胺類物質和游離氨基酸等物質濃度相對增大,前體物濃度增多從而有利于亞硝胺的生成[17]。李暮春等[18]研究表明風干腸中的NDEA與水分無顯著相關性(P>0.05),與本研究結果一致。

在加工過程中,6種亞硝胺與亞硝酸鈉殘留量之間均無顯著相關性(P>0.05),這可能是因為亞硝酸鈉參與了亞硝胺的形成,殘留的亞硝酸鈉并不參與亞硝胺的形成過程。魏法山[11]研究發現如皋火腿中NDMA、NDEA與亞硝胺均無相關性,與本研究結果一致。李暮春等[18]研究的風干腸中也得到了此結論。

NDMA、NDEA與食鹽含量無顯著相關性(P>0.05),NPYR、NMEA、NDPHA與食鹽呈顯著正相關(P<0.05),這可能是因為食鹽中的氯離子能夠加速亞硝胺的反應進程,一定條件下,氯離子含量越多,生成的亞硝胺含量越多[17]。魏法山[11]研究的如皋火腿中也得到了此結論。

NMEA、NDEA與TVB-N無相關性,NDMA、NDPHA與TVB-N呈極顯著正相關(P<0.01),NPYR與TVB-N呈顯著正相關(P<0.05),這可能是因為肉中的蛋白質在降解過程中產生的胺類物質等是亞硝胺的形成提供前體物質[19],會促進亞硝胺的形成。魏法山[11]研究表明如皋火腿中NDEA與TVB-N值呈極顯著正相關(P<0.01),李暮春等[18]研究表明風干腸中NDPHA與TVB-N值呈極顯著正相關(P<0.01),與本研究結論一致。

3 結論

隨著加工過程的進行,隴西臘肉中的亞硝胺含量逐漸上升,最終NMEA、NPYR含量較高,分別為1.59、2.72 μg/kg;TBARS值、食鹽含量、TVB-N值呈顯著的上升趨勢(P<0.05),水分含量與亞硝酸鈉殘留量呈顯著下降趨勢(P<0.05),pH值先下降后上升。NDMA與TBARS值呈極顯著正相關(P<0.01),NDPHA與水分呈極顯著負相關(P<0.01),NPYR、NMEA、NDPHA與食鹽呈顯著正相關(P<0.05),NDMA、NDPHA與TVB-N呈極顯著正相關(P<0.01),5種亞硝胺與亞硝酸鹽殘留量、pH值均無顯著相關性(P>0.05)?？傊?隴西臘肉中亞硝胺的生成與TBARS、食鹽、TVB-N具有一定的相關性,可在隴西臘肉加工過程中通過控制這些理化指標的大小來減少亞硝胺的形成。本研究結果揭示了隴西臘肉中亞硝胺的生成與理化指標的相關性,也為控制隴西臘肉中亞硝胺的生成提供理論支持。