不同產地沃柑揮發性成分的差異分析

張耀海,陳細羽,王成秋,焦必寧

1(西南大學/中國農業科學院柑桔研究所,重慶,400712)2(農業農村部柑桔及苗木質量監督檢測測試中心,重慶,400712) 3(農業農村部柑橘類果品質量安全控制重點實驗室,重慶,400712)4(農業農村部柑桔產品質量安全風險評估 實驗室,重慶,400712)5(國家柑桔工程技術研究中心,重慶,400712)

柑橘是世界第一大水果,我國柑橘種植面積和總產量均居世界第一[1]。柑橘果實營養豐富,富含類黃酮[2]、酚酸[2]、香豆素[2-3]、類檸檬苦素[4]、類胡蘿卜素[5]、生物堿[6]、肌醇[7]和揮發性物質[8]等多種生物活性成分。近年來,由于沃柑、紅美人、春見、清見、不知火、W默科特、大雅柑等雜柑營養價值高,且兼具橙、橘和柚果的特點,發展迅速,深受消費者喜愛。沃柑是坦普爾橘與丹西紅橘的雜交種,由以色列培育而成,果肉濃橙色,肉質細嫩化渣,汁多味濃,高糖低酸,果實風味濃郁。該品種采收期長,可從12月底采收至來年的3月上旬,具有極高的生產價值,在廣西、云南、四川、重慶等柑橘產區被大量推廣種植[9]。由于地理位置、環境條件、生產方式不同,不同產地沃柑的特有生物活性成分具有差異。研究不同產地農產品特征差異,進而找出根本差異代謝物,能夠實現農產品從原料到產品每一步都有跡可循、有源可查[10]。農產品產地溯源,既可以采用現代信息技術進行全程監測和跟蹤,也可以尋找不同產地農產品的特異性差異物,通常包括有機成分[11-14]、礦物元素[15]、穩定性同位素[16]和DNA圖譜[17]等。

作為一種重要的有機成分,揮發性成分能夠客觀地反映不同水果品種的風味特點,是評價果實風味品質的重要指標。國內外對柑橘中揮發性成分的報道主要集中于不同品種果皮精油和果汁等之間的差異性分析[18],但不同產地同一品種中揮發性成分的差異分析及產地溯源研究較少。如SONG等[11]利用GC-FID和GC-MS比較了韓國和日本不知火雜柑果皮精油中揮發性成分,檸檬烯、醇類和醛類等主要成分均差異顯著。金潤楠等[12]采用頂空固相微萃取氣質聯用(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS),并結合氣味活度值和主成分分析(principal component analysis,PCA),對我國浙江、湖北、湖南3個產地的宮川和尾張2個溫州蜜柑品種果汁中香氣差異進行分析比較,結果表明,產地和品種對溫州蜜柑香氣成分均有顯著影響,選取產地特異性成分和品種產地特異性成分進行PCA,能夠很好地將樣品區分開。CENTONZE等[13]將HS-SPME-GC-MS與電子鼻聯用,結合化學計量學,用于區分來自意大利、南非和西班牙三地的甜橙品種。羅振玲等[14]分析了來自浙江省臺州黃巖、寧波象山、衢州衢江和麗水蓮都等4個不同產區的紅美人果皮中主要揮發性成分的差異性,利用揮發性成分可基本區分4個產區的紅美人。

本文通過HS-SPME-GC-MS技術,對4個主產地(四川、重慶、云南和廣西)的沃柑果皮中揮發性成分進行定性和半定量分析,并基于半定量結果分別建立四川和重慶、云南和廣西沃柑的正交偏最小二乘法(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)模型,進而采用s-plot圖并結合變量投影重要性(variable importance in the projection,VIP)值和分析比較成分間的顯著性差異,最終確定能夠區分不同產區沃柑的潛在生物標志物,旨在為沃柑的產地溯源和深加工提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沃柑具體采摘信息見表1所示。所有樣品均符合果形端正,較整齊,單果斑點不超過4個,無枯水,淺橙黃色且著色均勻。由于產地不同,成熟時間有一定差異,廣西和云南的沃柑采于2020年1月,四川和重慶的沃柑采于2020年3月。每份樣品不少于30個,將采摘的沃柑表面擦拭干凈,四分法切開得到果皮,打碎混勻。

表1 沃柑樣品信息Table 1 Sample information of Orah mandarin

NaCl(分析純),重慶川東化工集團有限公司化學試劑廠;環己酮(純度≥99.5%)、C5～C25正構烷烴(色譜純),德國Dr.Ehrenstorfer GmbH;α-蒎烯(純度98.0%)、月桂烯(純度≥75.0%)、3-蒈烯(純度>90.0%)、α-松油烯(純度>90.0%)、檸檬烯(純度95.0%)、γ-松油烯(純度>95.0%)、異松油烯(純度85.0%)、順式-3-己烯醇(純度98.0%)、正己醇(純度≥98.0%)、正辛醇(純度99.5%)、芳樟醇(純度98.0%)、正壬醇(純度98.0%)、4-松油烯醇(純度98.0%)、α-松油醇(純度98.0%)、香茅醇(純度98.0%)、橙花醇(純度97.0%)、香葉醇(純度97.0%)、紫蘇醇(純度90.0%)、辛酸甲酯(純度>99.0%)、丁酸己酯(純度>98.0%)、乙酸橙花酯(純度95.0%)、乙酸香葉酯(純度95.0%)、己酸己酯(純度>98.0%)、鄰苯二甲酸二乙酯(純度≥99.5%)、己醛(純度97.0%)、反式-2-己烯醛(純度98.0%)、2,4-己二烯醛(純度>95.0%)、苯甲醛(純度≥98.0%)、正辛醛(純度≥99.0%)、正壬醛(純度96.0%)、香茅醛(純度96.0%)、正十一醛(純度97.0%)、月桂醛(純度95.0%),阿拉丁試劑(上海)有限公司;β-丁香烯(純度≥98.0%)、反式-β-金合歡烯(純度≥98.0%)、香芹酮(純度≥95.0%)、醋酸辛酯(純度≥98.0%)、反,反-2,4-癸二烯醛(純度>90.0%),上海源葉生物科技有限公司;順式-β-金合歡烯(純度>98.0%)、大牛兒烯D(純度99.3%)、β-芹子烯(純度90.0%)、α-布藜烯(純度90.0%),加拿大TRC公司;檜烯(純度75.0%)、檸檬烯氧化物(純度≥95.0%),美國Sigma-Aldrich公司;丁香酚(純度99.0%),上海Macklin生物化學有限公司;辛酸己酯(純度≥99.0%),北京邁瑞達科技有限公司;α-金合歡烯(純度>99.9%),東京化成工業株式會社;巴倫西亞橘烯(純度93.4%),美國Chromadex公司。

1.2 儀器與設備

7890A/5975C氣相色譜一單四極桿質譜儀,美國Agilent公司,配Combi PAL自動進樣器(瑞士CTC公司);HP-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm id×0.25 μm),美國Agilent公司;二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/CAR/PDMS 50/30 μm),美國Supelco公司;Milli-Q Advantage A10超純水器,美國Millipore公司;XS205電子天平(感量0.01 mg)、PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g),瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 氣相條件

采取程序升溫,35 ℃保持5 min,以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min,再以5 ℃/min升至250 ℃,保持2 min;進樣口溫度250 ℃,不分流進樣;載氣為高純氦氣(純度均≥99.999%),1 mL/min。

1.3.2 質譜條件

離子化方式是EI,電子能量70 eV;傳輸線溫度280 ℃;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質量掃描范圍m/z35～450。

1.3.3 混合標準溶液配制

分別準確稱取50種標準品5.00 mg于10 mL棕色容量瓶中,用丙酮定容,搖勻,配制成500 mg/L標準母液,轉移到帶蓋棕色試劑瓶中,置于-50 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3.4 HS-SPME條件

稱取3.00 g樣品,置20 mL螺口樣品瓶中,加入3.00 mL飽和NaCl溶液和2.00 μL環己酮(內標物),用聚四氟乙烯隔墊密封,在50 ℃孵化器中加熱平衡20 min。用萃取頭頂空吸附50 min后,將萃取頭插入GC進樣,解析5 min。每份樣品各3個平行。

1.4 定性和半定量分析

利用Flavour 2.0和NIST 08質譜庫,篩選出匹配度≥90%的物質,同時結合標準物質保留時間進行定性。在1.3.1節中相同的程序升溫條件下,獲得C5～C25正構烷烴的保留時間,結合各成分的保留時間,按照公式(1)計算樣品中各成分的保留指數(retention index,RI)。

RI=100×Z+100×(tx-tz)/(t(z+1)-tz)

(1)

式中:Z和Z+1分別為目標化合物(X)流出前后的正構烷烴所含碳原子的數目;tx、tz、t(z+1)分別為目標物及碳數為Z,Z+1正構烷烴的保留時間,且有tz

用內標物環己酮對揮發性成分進行半定量,半定量按公式(2)計算:

RC=Ax×m環己酮/(A環己酮×m樣品)

(2)

式中:RC,目標物的相對含量;Ax和A環己酮分別為目標物和環己酮的峰面積;m環己酮和m樣品分別為環己酮和樣品的質量。

1.5 數據處理

將得到的以樣品編號、揮發性成分名稱以及50種揮發性成分半定量數據的原始數據矩陣導入SIMCA-P 14.1軟件(Umetrics,瑞典)進行統計學分析。首先利用PCA對不同產地48個樣品分布進行整體解釋,再采用OPLS-DA對PCA結果進行分組并建模。最后根據建模篩選出的成分進行獨立樣本t檢驗,根據顯著性分析,篩選潛在生物標志物。

2 結果與分析

2.1 定性和半定量分析

根據HS-SPME-GC-MS檢測結果,檢索圖譜庫(Flavour 2.0和NIST 08)篩選匹配度≥90%的物質,同時結合標品保留時間進行定性,在重慶、四川、廣西、云南沃柑果皮中累計檢測出萜烯類、醇類、酮類、酯類、醛類和其他類50種物質,其中萜烯類18種、醇類11種、醛類10種、酯類8種、酮類1種、其他類2種,具體見表2。

表2 沃柑果皮揮發性成分定性結果Table 2 Qualitative results of volatile components in the peel of Orah mandarin

續表2

半定量結果見表3所示。4個產地沃柑之間揮發性物質組成和含量均有差異。檸檬烯是主要的揮發性物質,月桂烯、α-蒎烯、芳樟醇、正辛醇、正辛醛、香茅醇、己醛、反式-2-己烯醛、檜烯、香芹酮和α-松油醇等次之。其中,峰面積占比,檸檬烯平均為89.06%,月桂烯、α-蒎烯、芳樟醇、正辛醇、正辛醛、香茅醇、己醛、反式-2-己烯醛、檜烯、香芹酮和α-松油醇分別為4.03%、0.98%、0.92%、0.73%、0.68%、0.38%、0.34%、0.32%、0.30%、0.26%和0.23%,這與文獻基本吻合[19-21]。

表3 沃柑果皮揮發性成分半定量結果Table 3 Semiquantitative results of volatile components in the peel of Orah mandarin

續表3

2.2 模型的構建和驗證

將4個產地48個樣品的50種揮發性成分半定量結果組成的數據矩陣導入SIMCA-P 14.1。為了查看樣品大致分布情況,首先進行無監督的PCA(圖1)。

圖1 不同產地沃柑揮發性成分非監督PCA模型Fig.1 The unsupervised PCA model of Orah mandarin in different origins

非監督PCA模型中,第1主成分解釋了20%,第2主成分解釋了10.7%,可見總的方差解釋率不高。四川和重慶,能夠較為明顯的區分開,只有小部分相交,但云南和廣西不能明顯區分,源于兩地的地理、氣候環境相差不大。因此,分別對四川和重慶、云南和廣西采用有監督的OPLS-DA分析,可以剔除樣本中的無關因素,使組間的差異最大化,以找到不同產地間的潛在標志物。四川和重慶的OPLS-DA模型見圖2。如圖2-a所示,四川和重慶的沃柑在OPLS-DA模型上被完全區分開,模型能夠解釋X方向95%的信息(R2X=0.95),Y方向98.6%(R2Y=0.986),由Q2=0.953得知,四川和重慶模型的預測能力為95.3%,大于0.5,所建模型良好。為驗證模型是否過擬合,設置假設檢驗的次數為200,檢驗結果如圖2-b所示,其中R2代表模型能夠解釋Y矩陣的信息,Q2代表通過交叉驗證計算得到的模型的預測能力,最右邊值為真實值,左邊值為模擬得到的值。所有R2和Q2的左邊點都低于最右邊點,代表其檢測值都低于真實值,Q2的回歸線截距為-1.16,小于0.5,且R2和Q2的回歸線的斜率大于1,證明此模型沒有過擬合。

a-SC、CQ;b-R2、Q2

如圖3-a所示,廣西和云南的沃柑在OPLS-DA模型上能夠被完全區分開,模型能夠解釋X方向98.5%的信息(R2X=0.985),Y方向95.7%(R2Y=0.957),由Q2=0.745得知,廣西和云南模型的預測能力為74.5%,大于0.5,所建模型良好。同樣,為驗證模型是否過擬合,設置假設檢驗的次數為200,如圖3-b所示:所有R2和Q2的檢測值都低于真實值,Q2的回歸線截距為-1.23,小于0.5,且R2和Q2的回歸線的斜率大于1,也證明此模型沒有過擬合。

a-GX、YN;b-R2、Q2

2.3 潛在生物標志物篩選

s-plot圖代表變量在模型的貢獻大小。s-plot圖中,位于兩端的變量在模型的貢獻率較大,可能為所尋找的生物標志物。此外,VIP值可以評價變量的貢獻大小,通常選用VIP>1的變量。利用SIMCA-P 14.1軟件,可以得到2個模型的VIP預測值。四川和重慶兩地,VIP>1的有檸檬烯、芳樟醇、月桂烯、香茅醇。廣西和云南兩地,VIP>1的有檸檬烯、醋酸辛酯和α-松油醇,因此,可以分別篩選出4個變量和3個變量,結果如圖4所示。

a-四川和重慶;b-廣西和云南

再根據SPSS獨立樣本t檢驗,篩選出P<0.05的標記物,結果如表4和表5所示。

表4 四川、重慶沃柑潛在生物標志物Table 4 Potential biomarkers of Orah mandarin in Sichuan and Chongqing

表5 廣西、云南沃柑潛在生物標志物Table 5 Potential biomarkers of Orah mandarin in Guangxi and Yunnan

3 結論

采用HS-SPME-GC-MS技術對四川、重慶、云南和廣西4個主產地沃柑果皮中揮發性成分進行測定,4個產地沃柑之間揮發性成分組成和含量均有差異,其中萜烯類物質最為豐富,其次為醇類、醛類、酯類和酮類等?；趽]發性成分半定量結果,結合統計學分析,建立了四川和重慶、云南和廣西沃柑的2個OPLS-DA模型,篩選出的潛在生物標志物分別較好地區分了四川和重慶、云南和廣西沃柑。本文的沃柑產地判別模型,只利用了譜庫和現有標品鑒定的數據,會造成部分成分缺失,可能會影響潛在生物標志物的確定,因此可以進行非靶向篩查。沃柑果皮中所含揮發性成分繁多,除產地外,還有樹齡、栽培方式、管理模式等影響因素,未來應加大樣本量、擴大揮發性成分范圍,為產地溯源構建更加精準的預測模型。此外,后續也可以結合氣相色譜-嗅辨儀和感官評定來進一步研究分析不同產地沃柑揮發性成分的差異。