基于ERK5信號通路探討薯蕷健脾益智合劑對血管性癡呆大鼠海馬神經元凋亡的影響

劉煜　李鳴　吳永貴　楊瓊

摘要 目的：探討薯蕷健脾益智合劑對血管性癡呆（VaD）大鼠海馬神經元凋亡的影響以及相關作用機制。方法：采用改良雙側頸總動脈結扎（2－VO）法建立VaD大鼠模型，將120只大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組和治療組，每組30只。治療組予以10 mL/（kg·d）薯蕷健脾益智合劑灌胃，正常組、假手術組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，持續8周。觀察大鼠一般狀態，并于造模后第7天及造模后治療4、8周分別進行行為學檢測，蘇木精－伊紅（HE）染色觀察海馬神經元組織學改變，脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）染色觀察海馬神經元凋亡情況，免疫組織化學法檢測絲分裂原活化蛋白激酶K2（MEKK2）、絲分裂原活化蛋白激酶K3（MEKK3）和絲裂原激活蛋白激酶5（MEK5）、細胞外信號調節激酶5（ERK5）表達的變化，蛋白免疫印跡法檢測MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的蛋白表達。結果：與正常組及假手術組比較，模型組行為學表現差異顯著，變性神經元增加，神經元凋亡率增加（P＜0.01），MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的表達減少；與模型組比較，治療組行為學表現改善，變性神經元減少，神經元凋亡率降低（P＜0.05或P＜0.01），MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5表達增加。結論：薯蕷健脾益智合劑可能通過上調ERK5信號通路，抑制海馬神經元凋亡，促進海馬神經元的修復進而治療VaD。

關鍵詞 血管性癡呆；薯蕷健脾益智合劑；神經元凋亡；絲裂原激活蛋白激酶5，ERK5；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.012

Effect of Modified Shuyu Pill on Hippocampal Neuron Apoptosis in Vascular Dementia Rats Based on ERK5 Signaling Pathway

LIU Yu， LI Ming， WU Yonggui， YANG Qiong

Hubei Province Hospital of TCM， Wuhan 430061， Hubei， China

Corresponding Author LI Ming， E－mail： 385579@qq.com

Abstract Objective：To investigate the effect of modified Shuyu Pill on hippocampal neuron apoptosis in rats with vascular dementia（VaD）.Methods：The modified bilateral common carotid artery ligation（2－VO） was used to establish the VaD rat model.One hundred and twenty rats were randomly divided into normal group，control group，model group，and treatment group，with 30 rats in each group.The treatment group was given 10 mL/（kg·d） modified Shuyu Pill by intragastric administration.The normal group，control group，and model group were given the same volume of normal saline.The intervention lasted for 8 weeks.Behavior detection were performed at the 7th day after modeling，and 4 and 8 weeks，vespectively after treatment.Histological changes of hippocampal neurons were observed by hematoxylin－eosin（HE） staining.The apoptosis of hippocampal neurons was observed by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）－mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）.The expression of mitogen－activated protein kinase K2（MEKK2），mitogen－activated protein kinase K3（MEKK3），mitogen－activated protein kinase 5（MEK5），and extracellular signal－regulated kinase 5（ERK5） were detected by immunohistochemistry.The protein expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 were detected by Western Blot.Results：Compared with the normal group and control group，the behavior of the model group was significantly different，the degeneration of neurons increased，the apoptosis rate of neurons increased（P＜0.01），and the expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 decreased.Compared with the model group，the behavioral performance of the treatment group improved，the degeneration of neurons reduced，the apoptosis rate of neurons decreased（P＜0.05 or P＜0.01），and the expressions of MEKK2，MEKK3，MEK5，and ERK5 significantly increased.Conclusion：Modified Shuyu Pill may inhibit the apoptosis of hippocampal neurons and promote the repair of hippocampal neurons to treat VaD by up－regulating ERK5 signaling pathway.

Keywords vascular dementia; modified Shuyu Pill; neuron apoptosis; extracellular signal－regulated kinase 5， ERK5; experimental study

隨著人口老齡化問題加劇，癡呆癥的患病率預計將在未來幾十年內不斷增加［1］。血管性癡呆（vascular dementia，VaD）占癡呆病例的15%，是僅次于阿爾茨海默?。ˋD）的常見癡呆癥，主要因腦缺血損傷，而表現出認知障礙與行為損害的進行性下降［2］。有研究發現，15%～30%的病人在腦卒中發生幾個月后發展為癡呆，并且有20%～25%的病人發展為遲發性癡呆［3］。正是由于大腦的復雜協調，同時存在其他腦損傷原因，VaD病人認知功能的改變包含注意力、信息處理和執行功能的損傷等可能具有可逆性［4］。但針對VaD的治療缺乏特異性，很少有藥物被批準專門用于預防或治療VaD。因此，與AD相似，VaD的治療策略包括使用膽堿酯酶抑制劑和美金剛等，以及心理支持治療。中醫藥不僅能緩解VaD病人的臨床癥狀，還可以預防VaD的發生。在前期研究中已發現，薯蕷健脾益智合劑能明顯改善VaD病人臨床評分量表［5］，減少神經元凋亡，修復海馬神經元，改善記憶功能減退［6］，但其具體機制仍不清楚。因此，本研究采用改良雙側頸總動脈結扎（2－VO）法［7］建立VaD大鼠模型，觀察大鼠行為學、海馬病理改變以及相關信號傳導的變化，進而分析薯蕷健脾益智合劑改善VaD海馬神經元凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康無特定病原體（SPF）級Wistar大鼠120只，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（鄂）2015－0018，雄性，體質量（250±20）g。于SPF級動物房飼養，自由進食水，適應性飼養1周。嚴格遵守實驗室動物保護指導原則進行動物研究，實驗設計以及實驗流程均經過動物倫理委員會批準。

1.2 實驗藥物

薯蕷健脾益智合劑，由湖北省中醫院藥劑科制備（批準文號：鄂藥制字Z20150027，批號：20160913），組方：山藥30 g，熟地黃24 g，制何首烏24 g，黨參20 g，白芍20 g，當歸20 g，遠志12 g，石菖蒲14 g，川芎10 g，炒白術18 g，茯苓18 g，杜仲12 g，枸杞子18 g，五味子10 g。將方藥浸泡0.5 h后水煎3次，過濾合并，經物理方法將合并后的水煎劑濃縮至每毫升含原生藥量1.0 g，經120 ℃、400 kPa條件下消毒25 min，冷卻后4 ℃保存備用。

1.3 試劑與儀器

磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、甲醇均購自武漢谷歌生物有限公司（貨號分別為R20259、R21295、S30288）；兔多抗絲分裂原活化蛋白激酶K2（MEKK2）、鼠單抗絲分裂原活化蛋白激酶K3（MEKK3）、兔多抗絲裂原激活蛋白激酶5（MEK5）、鼠單抗細胞外信號調節激酶5（ERK5）均購自美國Santa Cruz公司（貨號分別為19607S、60291－1－Ig、18464S、19677－1－AP）；辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗大鼠二抗、HRP標記羊抗兔二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司（貨號分別為BA1058、BA1054）等。

MT－200Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統（成都泰盟科技有限公司）；臺式高速冷凍離心機Neofuge 15R（Thermo公司）；全自動石蠟切片機（德國美康公司，型號：HM355 S型）；Bio－plex電泳儀（Bio－Rad公司）；熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（上海宏石醫療科技有限公司）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）等。

1.4 模型制備

采用改良2－VO法制備VaD大鼠模型，乙醚吸入麻醉后，于手術臺上固定，在頸部正中偏左切開皮膚，逐層鈍性分離出左側頸總動脈，依次結扎頸總動脈的近心端和遠心端，用剪刀從中間剪斷后進行縫合。1周后對右側頸總動脈實施手術，方法同上。整個手術過程中進行電加熱，以維持大鼠體溫，保證生存。造模7 d后，用水迷宮檢測大鼠探索平臺的時間和通過平臺的次數，與未造模大鼠相比，探索時間明顯延長，通過次數顯著減少，顯示造模成功。

1.5 動物分組及給藥方法

將120只大鼠采用隨機數字表法分為正常組、假手術組、模型組和治療組，每組30只。正常組不予造模，正常飼養；假手術組作為對照，于頸部切開皮膚，分離出頸總動脈，既不結扎也不剪斷，暴露5 min后直接縫合皮膚；模型組和治療組均采用改良2－VO法進行模型制備。造模后第7天開始，根據前期給藥劑量相關研究［8］，薯蕷健脾益智合劑成人（體重60 kg）推薦劑量為1.6 g/kg，按成人臨床推薦劑量與人鼠換算公式，予以等劑量折算，即大鼠給藥劑量＝人給藥劑量×換算系數＝1.6 g/（kg·d）×6.3≈10 g/（kg·d），可得治療組予以薯蕷健脾益智合劑煎劑10 g/（kg·d）灌胃，按照大鼠體質量及薯蕷健脾益智合劑水煎劑濃縮濃度，治療組給予薯蕷健脾益智合劑10 mL/（kg·d）灌胃，正常組、模型組和假手術組給予生理鹽水10 mL/（kg·d）灌胃，持續8周。

1.6 檢測指標及方法

各組大鼠行斷頸處死，取大鼠海馬組織，一部分放入4%多聚甲醛溶液中，常溫或者4 ℃保存，另一部分放入1.5 mL滅菌的EP管中，并快速置入－80 ℃超低溫冰箱，以備待測。

1.6.1 一般情況與行為學檢測

從實驗開始每天觀察大鼠的形態、皮毛色澤、排泄物、精神情緒變化、活動程度以及飲食進水狀況水平。

Morris水迷宮測試包含空間探索實驗和定位航行實驗，定位航行實驗檢測大鼠空間學習能力（逃避潛伏期）。將池分為4個象限，放置圓形平臺在水池第3象限，每次根據第1象限、第2象限、第3象限、第4象限的順序將大鼠放入池中，記錄大鼠尋找到平臺的時間，持續5 d?？臻g探索實驗，是在第6天撤離平臺，大鼠從第2象限放入，觀察90 s內大鼠穿越平臺次數和在第3象限停留時間。實驗利用逃避潛伏期、通過平臺的次數、目標象限停留百分比評價大鼠學習和記憶的能力。各組大鼠造模后1周（治療前）、藥物干預后第4周和第8周進行Morris水迷宮檢測。

1.6.2 蘇木精－伊紅（HE）染色法評估海馬形態變化

各組大鼠斷頸處死后迅速取海馬組織，中性固定液固定，石蠟包埋，切片（0.4 μm），二甲苯、乙醇梯度脫蠟并用蘇木精、伊紅染液染色，最后依次進行脫水、透明、封片，然后經37 ℃烤箱烘干置于切片盒中，常溫保存，并使用顯微鏡和成像系統獲取圖像。

1.6.3 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記（TUNEL）法評估海馬神經元凋亡水平

DNA核苷酸末端轉移酶介導的脫氧尿苷三磷酸（dUTP）生物素末端標記法切口。按Bowringmann公司（德國）凋亡原位檢測試劑盒程序。二甲苯脫蠟石蠟切片，37 ℃，20 mg/L蛋白酶K消化30 min，PBS洗滌3次，TUNEL反應液滴加，37 ℃，60 min，PBS震洗后洗滌加入轉烷基苯酚（AP），37 ℃，60 min，最后加入顯色底物滴加5－溴－4－氯－3－吲哚磷酸鹽（BCIP）/硝基四氮唑藍（NBT），10 min終止反應，脫水，透明，封片，分析。結合CMIAS系列病理圖像分析系統（4.0）凋亡分析模塊，量化海馬凋亡細胞數。

1.6.4 免疫組織化學法檢測大鼠海馬MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5表達水平

取大鼠海馬組織進行脫水、石蠟包埋、切片，然后脫蠟和水化、抗原修復、消除內源性過氧化物酶活性、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色、復染、脫水、透明和封片。每組取10張切片，隨機選擇5個不同視野，運用Image－Pro Plus 6.0軟件對MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5的表達進行累計光密度分析，計算平均光密度值。

1.6.5 蛋白免疫印跡法檢測大鼠海馬MEKK2、MEKK3、MEK5、ERK5蛋白表達水平

取大鼠海馬組織，提取蛋白，將制備的蛋白樣品通過制膠、上樣、電泳、轉膜、染色、一抗孵育、二抗孵育，顯色后，應用全自動熒光與可見光凝膠成像分析系統曝光。以β－actin作為內參，運用分析軟件對蛋白灰度值進行檢測，以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

1.7 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。首先對定量資料進行正態性、方差齊性檢驗，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD－t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀態

造模前，各組大鼠一般情況正常，精神狀態良好，反應靈敏，皮膚黏膜光滑紅潤，皮毛發亮有光澤，鼻頭眼角無分泌物，耳廓色澤淡粉，糞便成形，干稀適中。正常組大鼠在整個實驗過程中一般情況均無明顯變化。假手術組于術后3 d內出現輕度的毛發臟亂和枯黃不順、精神萎靡，其余一般情況良好。經正常飼養后，一般情況逐漸基本恢復，與正常組比較差異不明顯。模型組大鼠于造模后，開始出現不同程度的毛發臟亂和枯黃不順、懶動時常倦臥、厭食厭水、眼裂減小、唇甲紫暗、腹部脹滿、四肢逐漸消瘦甚至逐漸死亡。予以藥物灌胃后，與模型組比較，治療組一般情況有明顯改善。

2.2 Morris水迷宮實驗結果

2.2.1 各組不同時間逃避潛伏期比較

造模后第7天（治療前），模型組和治療組逃避潛伏期較正常組、假手術組明顯延長，差異有統計學意義（P＜0.05）；造模后治療4、8周，治療組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2.2 各組不同時間跨越平臺次數比較

治療前，模型組和治療組跨越平臺次數較正常組、假手術組明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；治療組在造模后治療4、8周跨越平臺次數較治療前明顯增加（P＜0.05）；造模后治療8周，治療組跨越平臺次數較模型組明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 海馬神經元病理學結果

海馬HE染色后顯示，與正常組相比，模型組大鼠錐體細胞排列稀疏不規則，細胞間距變寬，細胞核體積變小，染色加深，核仁欠清，部分細胞壞死。與模型組比較，治療組大鼠海馬錐體排列整齊，細胞稍緊密，形態輪廓清晰，核仁清晰。詳見圖1。

2.4 TUNEL染色檢測海馬神經元凋亡結果

治療前，模型組、治療組大鼠海馬神經元凋亡率較正常組、假手術組明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；在造模后治療4、8周，治療組大鼠海馬神經元凋亡率較模型組明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。詳見圖2、圖3、表3。

2.5 海馬組織中MEKK2、MEKK3和MEK5、ERK5的表達

2.5.1 免疫組織化學實驗結果

在造模后治療4周，治療組海馬神經元中MEKK2、MEK5陽性細胞光密度值較模型組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。在造模后治療8周，模型組海馬神經元中MEKK3陽性細胞光密度值較假手術組明顯降低，治療組海馬神經元中MEK5陽性細胞光密度值較模型組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖4、表4、表5。

2.5.2 蛋白免疫印跡實驗結果

在造模后治療4周，模型組海馬神經元中MEK5蛋白表達較正常組、假手術組明顯減少，治療組MEK5蛋白表達則較模型組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。在造模后治療8周，與假手術組比較，模型組海馬神經元中MEKK3蛋白表達較假手術組明顯減少，治療組MEKK3蛋白則較模型組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖5、表6、表7。

3 討 論

VaD是以認知和行為缺陷，并伴有相關神經血管損傷體征為特征的神經退行性病癥［9－10］，其發病機制復雜，發病率逐年增長，嚴重威脅著老年人的身心健康，給社會和家庭帶來沉重的負擔。據報道，這些認知損傷主要由慢性腦灌注不足繼發神經退行性變、神經細胞凋亡和神經炎癥［11－12］。因此，本研究以神經細胞凋亡為切入點進行相關信號傳導研究。

研究證明，薯蕷健脾益智合劑能有效抑制海馬神經元凋亡，從而緩解VaD認知功能障礙［6］。本研究發現，經改良2－VO法造模后的大鼠存在明顯的認知障礙，包括較長的逃避潛伏期和較短的目標象限時間，以及不同程度的毛色臟亂枯暗、唇甲紫暗、精神萎靡、睡眠增多等一般狀態，證實2－VO法制作VaD模型的可行性。薯蕷健脾益智合劑能減輕2－VO誘導的行為學改變、海馬神經元形態學改變，減少海馬神經元凋亡，最終改善認知功能。說明薯蕷健脾益智合劑能有效保護VaD模型認知功能。

本研究結果顯示，模型組海馬神經元凋亡率均高于正常組，且MEKK2、MEKK3、MEK5和ERK5表達下降，由此可見，大鼠的海馬神經元凋亡與ERK5信號傳導等因子的減少有關。有研究表明，ERK5可在海馬與嗅球成年神經發生［13］。ERK5對氧化應激敏感，并調節氧化應激組織中的細胞凋亡和炎癥，尤其是心腦血管系統中的細胞凋亡和炎癥［14］，且ERK5信號級聯對正常心腦血管發育和血管完整性至關重要［15－16］。此外，體外實驗研究表明，在正常內皮細胞中，ERK5是防止凋亡、介導剪切應力信號、調節缺氧和細胞遷移所必需的［17］。ERK5是MEK5已知的唯一靶點，因此為信號整合創造了一個獨特的軸［18］。反過來，上游MEKK2和MEKK3經磷酸化后，MEK5的激活被觸發［19－20］。而ERK5介導的信號傳導是由多種細胞外刺激引起的，包括氧化應激、滲透應激、缺氧缺血條件、促炎細胞因子［21］。因此，在腦缺血損傷期間激活ERK5可防止缺血大鼠海馬CA1區的細胞凋亡［22］，與本研究結果相符。本研究結果提示，治療組ERK5信號傳導等因子水平明顯上調，顯示薯蕷健脾益智合劑可能通過調節ERK5信號傳導等因子的升高，起到抗凋亡的作用，進而保護VaD大鼠神經元。

薯蕷健脾益智合劑是由湖北省中醫院已故名醫呂繼端教授所創立，主要由經典名方薯蕷丸化裁而來。全方由熟地黃、枸杞、杜仲、何首烏等具有補腎益腦、填精益髓、化痰祛瘀等功效的藥物組成，諸藥合用，使臟腑氣血得生，陰陽得平，可從健脾益髓、開竅益智等方面有效緩解認知功能障礙?，F代藥理學研究證實薯蕷健脾益智合劑中多種藥物存在有效藥理成分，芍藥中芍藥苷具有調節蛋白質、調節神經遞質、保護神經元的作用，能有效降低促凋亡因子，阻止神經細胞凋亡［23－25］。石菖蒲揮發油亦可有效抑制神經細胞凋亡［26］，通過降低腦組織興奮性遞質，從而改善癡呆大鼠學習記憶能力［27］。黨參中人參皂苷能提高學習和記憶功能，其機制可能與促進腦組織蛋白有關［28］。由此可見，薯蕷健脾益智合劑可通過多種有效成分，多方面阻止并逆轉神經元凋亡，緩解臨床癥狀。

綜上所述，薯蕷健脾益智合劑能有效抑制VaD大鼠海馬神經元凋亡，改善VaD大鼠的認知功能障礙，其具體機制可能與升高ERK5相關信號傳導蛋白的表達，抑制神經元凋亡的作用相關。

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（收稿日期：2022－09－27）

（本文編輯郭懷?。?/p>

基金項目 國家中醫藥管理局基金項目（No.JY/CACM002－2019）；湖北省自然科學基金重點項目（No.2015CFA089）

通訊作者 李鳴，E－mail：385579@qq.com

引用信息 劉煜，李鳴，吳永貴，等.基于ERK5信號通路探討薯蕷健脾益智合劑對血管性癡呆大鼠海馬神經元凋亡的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（1）：68－74.