生物有機肥施加對荒漠草原植被-土壤-微生物的影響

李俊瑤，蔣星馳，胡晉瑜，魏棟光，趙學勇，王少昆*

（1. 中國科學院西北生態環境資源研究院，甘肅 蘭州 730000；2. 中國科學院大學資源與環境學院，北京 101408；3. 中國科學院大學生命科學學院，北京 101408；4. 國營榆林市橫山區二石磕林場，陜西 榆林 719109；5. 巴彥淖爾市林業和草原資源保護中心，內蒙古 巴彥淖爾 015015）

荒漠草原是草原向荒漠過渡的生態系統，也是最干旱的草原生態系統。分布于蒙古高原中、北部的烏拉特荒漠草原在維持我國北方生態環境、社會經濟和生物多樣性方面發揮著重要作用，是我國北方綠色生態屏障建設的關鍵區域之一[1］。在內蒙古烏拉特荒漠草原，放牧是利用和管理草地最主要的形式之一，在帶來經濟利益的同時會破壞草原植被和表層土壤。在干旱等氣候變化的協同影響下，脆弱的荒漠草原生態系統進一步退化[2-6］。在荒漠草原退化過程中，植被蓋度、生物多樣性和生產力明顯降低，土壤養分流失和微生物活性降低[7］，生態系統的結構與功能遭到破壞[2，6-8］。

圍欄封育、植樹種草和施肥等措施可以有效恢復退化的草原生態系統[9-14］。近年來，施肥作為一種有效的退化土地恢復措施被應用在生態治理中，施加的肥料多為有機肥和氮肥[15-21］。土壤中發育的微生物群落在土壤養分循環等過程中起著重要作用，推動著生態系統中的物質循環和能量流動，與土壤肥力等密切相關[22-23］。生物有機肥作為一種新型肥料，能增加微生物數量、改善土壤理化性質并提升土壤肥力[24-29］。

利用農牧業有機冗余物加入高效纖維素分解菌有氧發酵制備出具有一定保水性、透氣性和肥力的生物有機肥（microbial organic fertilizers， MOF）是一種環境友好型肥料。在自然條件較好的科爾沁沙地進行的相關試驗表明，生物有機肥能以增加植被蓋度的方式對退化沙丘的植被恢復帶來積極影響，并以較好的保水性和抗風蝕性減弱惡劣環境對沙丘裸露創面的破壞[30］。目前，有關在荒漠草原開展的施肥試驗結果表明，施肥能促進荒漠草原植被生長，隨著施肥水平的增加，植被蓋度與生物量均有增加的趨勢[12，31-32］。但試驗僅單一關注施肥對土壤或植被的影響，在科爾沁沙地表現良好的生物有機肥在干旱區荒漠草原的應用也尚未見報道。因此，本研究選擇地處干旱區的烏拉特荒漠草原開展，研究施加生物有機肥對荒漠草原植被、土壤以及微生物的共同影響，為進一步認識生物有機肥在干旱區的作用功效及其推廣應用提供理論依據和數據基礎，以期為干旱區荒漠草原的生態修復提供科學依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于內蒙古巴彥淖爾市烏拉特后旗中部，屬于典型的大陸性干旱季風氣候，春、秋季短，夏季炎熱干燥，冬季寒冷干旱。年平均降水量為180 mm，降水主要集中在7、8 月，約占全年降水量的70%。年蒸發量遠高于降水量，可達降水量的10 倍以上。年平均氣溫為5.3 ℃，其中最高氣溫為37 ℃，最低氣溫為-34.4 ℃。主要的土壤類型為棕鈣土和灰棕漠土[33］。試驗地位于中國科學院烏拉特荒漠草原研究站（簡稱“烏拉特站”）長期定位試驗場內，主要的植物種類有紅砂（Reaumuria songarica）、駝絨藜（Krascheninnikovia ceratoides）、沙生針茅（Stipa glareosa）、駱駝蓬（Peganum harmala）、蒙古韭（Allium mongolicum）、豬毛菜（Salsola collina）和戈壁天門冬（Asparagus gobicus）等[34］。

1.2 試驗設計與研究方法

在烏拉特荒漠草原選擇地勢平坦的典型草地為研究對象，布設12個4 m×8 m 的試驗樣方，試驗區間距2 m，隨機選擇其中3個樣方作為對照（CK），另外分別選擇3個試驗區于2018、2019 和2020 年6 月中旬施加由烏拉特站自主研發的生物有機肥（MOF）（ZL 2014 10146127.4）[30］，施加量為1 kg·m-2。于2021 年8 月植物生長旺季進行植被調查和土壤取樣。試驗設計4個處理：對照（CK）、MOF 施加后恢復1（Y1）、2（Y2）和3 年（Y3），每個處理3個重復。

植被調查和土壤取樣：在每個4 m×8 m 的試驗區內布設一個1 m×1 m 的植被調查樣方，在植被調查樣方內直接數出不同的植物種類個數以及每種植物的個數作為植物物種數，通過卷尺測量植物高度，通過樣方框測量植被蓋度。在每個樣方內采用“S”形取樣法設置5個取樣點，在每個取樣點用直徑為3 cm 的土鉆采集0～20 cm 土壤，將每個樣方內的5 份土壤混勻后作為該樣方土壤樣本。每份土壤樣本過2 mm 篩后分為3 份，一份裝入土壤盒帶回實驗室測定土壤含水率，一份風干后用于測定土壤理化性質，一份裝入無菌自封袋中低溫（-20 ℃）保存，用于提取土壤總DNA 并進行土壤微生物高通量測序[35］。

土壤理化性質測定方法：土壤含水率（soil water content， SWC）采用烘干恒重法（105 ℃，24 h）測定，土壤粗砂、細砂和黏粉粒組成采用干篩法測定，土壤pH（水土比為2.5∶1）和電導率（electrical conductivity， EC）（水土比為5∶1）分別采用SX800 的pH 探頭（上海三信，杭州）和電導率探頭（上海三信，杭州）測定，土壤全碳（total carbon， TC）和全氮（total nitrogen， TN）利用元素分析儀（Elementar，德國）測定[34］。

土壤微生物測定方法：土壤微生物多樣性和群落組成采用擴增子高通量測序法。利用土壤DNA 提取試劑盒，按照說明提取土壤總DNA，然后對土壤總DNA 進行PCR 擴增，細菌（16S）和真菌（ITS）擴增分別采用通用引物515F-907R[36］和ITS1F-2043R[37］，將PCR 產物純化后分別對16S 中V3-V4 區域和ITS1 區域進行Miseq 擴增子測序。測序數據經過拼接、質控、去接頭達到優化效果，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic units， OTU）聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU 的代表序列與OTU 豐度表，其代表序列分別對應Silva 和Unite 數據庫注釋細菌和真菌門水平的系統分類[34］。

1.3 數據分析

土壤微生物的α 多樣性采用Ace 指數（公式1 和2）、Shannon 多樣性指數（公式3）以及PD 系統發育多樣性指數（公式4）衡量。β 多樣性基于物種多度的Bray-curtis 指數進行計算并通過主坐標分析（principal co-ordinates analysis， PCoA）進行可視化[38］。

式中：Ace 指數以個體數目作為標準，將個體數目≤10 的劃分為稀有種，個體數目＞10 的劃分為常見種。γAce為稀有物種變異系數，Sa為常見種物種數，Sr為稀有種物種數，n1為一個物種的所有個體數，nr為所有稀有種個體數，F1為只有一個個體的物種數。S1為只有一個個體的物種數，S2為只有兩個個體的物種數，S為數量豐度。

式中：Shannon 多樣性指數是反映群落個體屬于何種物種的不確定性的物種多樣性指數。S為物種數，Pi為第i種個體占總個體數的比例，H'為Shannon-Wiener 多樣性指數。

式中：C 為連接系統發育樹上所有物種的最短路徑上的所有分支之和，c 為連接節點的一段分支，Lc 為c 的分支長度。

差異性分析采用One-way ANOVA 和LSD 檢驗，進行Pearson 相關性分析，顯著水平為P＜0.05?？梢暬鲌D主要使用R 包ggplot 2[39］，UpSet 圖使用R 包UpSetR，PCoA 相關分析和繪制采用R 包vegan，結構方程模型計算使用R 包piecesise SEM[40］。

2 結果與分析

2.1 MOF 施加后不同恢復年限植被變化特征

MOF 施加促進了荒漠草原植被的生長。隨著施肥后恢復年限的增加，植物個數、植被蓋度、植物高度和植物物種數均高于對照（CK）（圖1）。其中，施肥后恢復1（Y1）、2（Y2）和3 年（Y3）的植被蓋度均顯著高于未施肥對照（CK）（圖1a）；施肥恢復1 年后，植物個數、植物高度和植物物種數均高于對照，但是差異不顯著（P＞0.05），恢復2（Y2）和3 年（Y3）的植物個數（圖1b）、植物高度（圖1c）和植物物種數（圖1d）顯著高于對照（CK）（P＜0.05）?？梢?，施加MOF 可以有效促進荒漠草原退化植被的恢復，并在施加MOF 兩年后顯著提升了荒漠草原植物的生長。

圖1 施肥后不同恢復年限植被特征Fig.1 Vegetation characteristics in different restoration years after fertilization

2.2 MOF 施加后不同恢復年限土壤理化性質變化特征

MOF 施加對荒漠草原土壤理化性質產生了不同的影響（表1）。施肥后恢復3 年（Y3）土壤黏粉粒（silt and clay，SC）含量較CK 顯著升高。施肥后恢復1 年（Y1）土壤含水率（SWC）較CK 顯著增加；施肥后恢復3 年（Y3）土壤含水率（SWC）較Y1與Y2顯著減少。土壤pH 值呈堿性，MOF 施加降低了荒漠草原土壤pH 值，施肥后恢復2 年（Y2）土壤pH 值顯著降低。施肥后隨著恢復年限的增加，土壤電導率（EC）逐漸升高。MOF 施加后，土壤全碳（TC）含量在施肥后恢復2 年（Y2）顯著高于對照（CK），并隨著恢復年限的增加逐年升高。土壤全氮（TN）含量在施肥后恢復3 年（Y3）顯著高于對照（CK）。MOF 施加后，土壤碳氮比（C/N）在施肥后恢復3 年（Y3）和對照（CK）有顯著差異?？傮w來說，施加MOF 改善了荒漠草原土壤理化性質，施肥恢復3 年（Y3）后，土壤理化性質發生了顯著變化。

表1 不同施肥處理荒漠草原土壤理化性質特征Table 1 Physical properties of desert steppe soil in different fertilization treatments

2.3 MOF 施加對荒漠草原土壤微生物群落組成的影響

MOF 施加豐富了荒漠草原土壤微生物群落物種組成。施肥后，隨著恢復年限的增加，土壤細菌OTU 總數逐漸增加，表現為CK（對照）＜Y1＜Y2＜Y3（圖2a）；土壤細菌在門水平上的物種豐富度也有不同程度的變化（圖3a），其中，在基于門水平的Kruskal-Wallis 秩和檢驗后共有11個門類有顯著性差異（P＜0.05），分別為酸桿菌門（Acidobacteriota）（18.4%～40.2%），裝甲菌門（Armatimonadota）（18.7%～53.6%），擬桿菌門（Bacteroidota）（18.4%～19.0%），藍藻菌門（Cyanobacteria）（15.9%～73.0%），纖維桿菌門（Fibrobacterota）（1.5%～26.0%），厚 壁 菌 門（Firmicutes）（9.1%～43.6%），鹽 厭 氧 菌 門（Halanaerobiaeota）（0～15.3%），Methylomirabilota（24.3%～49.1%），NB1-j（0～21.4%），Sumerlaeota（11.9%～14.0%）（圖3）。施肥后，隨著恢復年限的增加，土壤樣品中的真菌OTU 總數均高于未施肥對照（CK），表現為CK＜Y2＜Y1＜Y3（圖2b）；不同門類的真菌豐度也有不同程度的改變（圖3），在基于門水平的Kruskal-Wallis 秩和檢驗后，僅壺菌門（Chytridiomycota）有顯著性差異（P＜0.05）（7.2%～23.9%）?？傮w而言，MOF 處理使得土壤中微生物種類和數量增加，荒漠草原土壤微生物的多樣性上升，豐富了微生物群落組成。

圖2 不同施肥處理荒漠草原土壤菌群基于OTU 水平的Upset 圖Fig.2 Upset map of soil microbes in desert steppe under different fertilization treatments based on OTU level

圖3 施加MOF 對荒漠草原土壤微生物群落的影響（基于門水平）Fig.3 Effects of MOF addition on soil microbial community in desert steppe （based on phylum level）

2.4 MOF 施加對荒漠草原土壤微生物多樣性的影響

2.4.1 α 多樣性 MOF 施加提高了荒漠草原土壤微生物的α 多樣性。隨著施肥后恢復時間的增加，土壤細菌Ace 指數逐漸增加，施肥后恢復2 年（Y2）和恢復3 年（Y3）的細菌Ace 指數均極顯著（P＜0.01）高于對照（CK）（圖4a）。施肥后恢復1 年（Y1）、恢復2 年（Y2）和恢復3 年（Y3）的真菌Ace 指數均顯著（P＜0.05）高于對照（CK）（圖4b）?？梢娛┓侍幚碛兄谠黾油寥罉悠肺⑸锏腛TU 數。施肥后恢復的3 年中，細菌Shannon 指數無顯著組間差異（圖4c）。施肥后恢復2 年（Y2）的真菌Shannon 指數與對照（CK）和恢復3 年（Y3）的真菌Shannon 指數均差異顯著（圖4d）。隨著施肥年限的增加，細菌PD 指數逐漸增加，施肥后恢復1 年（Y1）顯著（P＜0.05）高于對照（CK），施肥后恢復2 年（Y2）和恢復3 年（Y3）極顯著（P＜0.01）高于對照（CK）（圖4e）。施肥后恢復3 年（Y3）的真菌PD 指數顯著（P＜0.05）高于對照（CK）（圖4f）。說明施加MOF 有助于增加土壤微生物α 多樣性。

圖4 施肥后不同恢復年限土壤微生物α 多樣性Fig.4 Soil microbial α diversity in different restoration years after fertilization

2.4.2 β 多樣性 土壤細菌和真菌PCoA 結果表明，施加MOF 明顯改變了土壤細菌與真菌的β 多樣性（圖5）。土壤細菌和真菌PCoA 結果中，PCoA1 軸、PCoA2 軸分別解釋了細菌和真菌群落總變異的39.17%、17.71%和30.71%、13.50%，ANOSIM（P=0.001）分析結果表明不同處理的土壤細菌和真菌β 多樣性差異顯著。施肥處理后的土壤細菌和真菌群落均能較好地聚在一起，且均與CK（對照）群落分離明顯；隨著恢復年限的增加，土壤微生物群落結構向未施肥（CK）方向聚集；圖中兩種分布情況說明施加MOF 顯著改變了土壤細菌和真菌的群落組成，隨著施肥后恢復年限的增加，微生物群落組成逐漸與對照（CK）趨于一致。

圖5 MOF 施加對土壤微生物β 多樣性的影響Fig.5 Effects of MOF application on soil microbial β diversity

2.5 MOF 施加對植被-土壤-微生物的直接和間接影響

采用分段結構方程模型分析MOF 施加對植被、土壤和微生物的直接和間接影響。結果表明：MOF 的施加對植被特征、土壤理化性質和微生物多樣性均產生了一定影響（圖6）。其中，MOF 施加直接增加了土壤黏粉粒含量（SC）、土壤全氮含量（TN）、土壤電導率（EC）、細菌多樣性、真菌多樣性、植被蓋度和植物物種豐富度，直接降低了土壤pH 值。此外，MOF 施加雖然對于土壤含水率并未產生顯著影響，但通過土壤含水率對植被蓋度和物種豐富度產生了間接的影響，MOF 施加和土壤含水率共同解釋了植被蓋度的92%。MOF 施加、土壤含水率和土壤電導率共同解釋了物種豐富度的84%。

3 討論

3.1 生物有機肥施加對荒漠草原植被的影響

本研究通過測量植物個數、植被蓋度、植物高度和植物物種數，發現荒漠草原植被的生長隨著MOF 施加年限的增加而增加。說明施肥可以增加土壤中的養分并促進植被生長，該結論與前人的研究結果一致[15-16，18，20］。施肥恢復后植被高度增加，而第3 年有所下降，該現象可能與肥料用量及效力有關，可通過后續試驗進行驗證。

3.2 生物有機肥施加對荒漠草原土壤的影響

本研究通過測量土壤粗砂、細砂和黏粉粒含量、土壤含水率、pH 值、土壤電導率以及土壤全碳和全氮含量，發現施加生物有機肥后，土壤黏粉粒含量、電導率以及全碳和全氮含量均增加，且與施加年限呈正相關，說明生物有機肥的施加能夠改善土壤理化性質，提高土壤養分。該結論與前人關于土壤黏粒與土壤養分間呈正相關性，在長期添加有機肥的情況下全氮含量上升的結論相一致[41］。土壤pH 值在施加生物有機肥后有所下降，可能是由于初始土壤已為強堿性土壤，pH 值的降低更有利于植被的生長。因此，本試驗采用的生物有機肥（MOF）可能對鹽堿化土地具有一定的改良作用，后期應開展鹽堿化土壤改良方面的試驗進一步驗證。此外，較多土壤理化性質均從施肥恢復后逐漸改變，恢復第3 年時改變顯著，與植被情況相一致，因此土壤理化性質改變規律仍與肥料用量及效力相關。

3.3 生物有機肥施加對荒漠草原土壤微生物的影響

本研究通過對土壤樣品中細菌與真菌OTU 數據進行分析，發現生物有機肥的施加顯著增加了土壤中微生物的種類和數量，同時提高了土壤菌群的α 多樣性和β 多樣性，與前人研究相一致[42］。生物有機肥的添加對于土壤微生物群落結構能產生顯著影響，為土壤理化性質的改良提供了一定的條件，改善了退化土壤的微生物活性。

3.4 生物有機肥施加對荒漠草原生態系統的影響

本研究通過結構方程模型對生物有機肥施加后植被-土壤-微生物之間的變化進行分析，發現施肥對于微生物群落的影響顯著，土壤細菌與真菌群落多樣性增加。微生物是土壤養分周轉的主要驅動因素，與土壤肥力和作物產量密切相關[43］。微生物菌群多樣性是衡量土壤質量、維持土壤地力和作物生產力的一個重要指標[27］。微生物種類與數量的增加意味著生態系統功能和服務能力的增加[28-29，44-45］。微生物生命活動規律與土壤中物質和能量的轉化、土壤肥力和植物生長均存在聯系[22］。本研究結果表明，施加MOF 后，土壤黏粉粒和全氮含量增加、強堿性土壤狀況下pH 值下降以及土壤電導率上升，這與前人研究結果相一致[46-47］。說明施加生物有機肥能恢復荒漠草原土壤肥力，促進植被生長。結果中微生物多樣性并未與植被蓋度、植物物種豐富度直接相關，原因可能為導致多樣性提高的微生物肥料更多作用于土壤養分提高，間接為植被提供了營養物質。結果中電導率上升影響植被種類可能由于土壤本身含鹽量較高，鹽濃度超過了某些植物的生長范圍。此外，試驗發現土壤含水率未在施加生物有機肥后產生顯著變化，但其引起了植被種類與蓋度的增加。原因可能為每年降水量不同，無法僅通過施加生物有機肥體現土壤持水力變化情況。研究還發現土壤細菌群落相較于土壤真菌群落更容易受到施肥處理的影響，該結果與前人研究結果一致[40，48］。

4 結論

由于干旱和放牧等氣候變化和人類活動的影響，內蒙古烏拉特荒漠草原發生了不同程度的退化，如何有效促進退化草地的快速恢復成了干旱荒漠草原生態恢復面臨的重要問題。本研究采用施加生物有機肥的方法實現了退化草地植物-土壤-微生物系統的快速恢復，施加生物有機肥顯著提高了植物蓋度和物種多樣性、改善了土壤養分和土壤質地、增加了土壤微生物多樣性、改善了微生物群落組成。施加生物有機肥有助于荒漠草原植被-土壤-微生物的整體恢復，為干旱區荒漠草原退化生態系統的快速恢復提供了新的思路和方法。