2 株青貯玉米根際固氮菌的篩選鑒定及促生作用研究

孟超楠，趙玉潔，陳佳欣，張旖璐，王彥佳，馮麗榮，孫玉剛，郭長虹*

（1. 黑龍江省分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，黑龍江 哈爾濱 150000；2. 黑龍江國宏節能環保有限公司，黑龍江 哈爾濱 150028）

青貯玉米（Zea mays）是飼喂牛、羊等草食性家畜的優良飼草類作物[1］，具有產量高，粗蛋白、淀粉含量豐富等優點，是世界上最重要的牧草之一[2］。近年來，隨著畜牧業的發展，對青貯玉米的需求量在不斷增加，青貯玉米的種植面積也在逐年擴大。在生產實踐中，為了提高青貯玉米的產量而長期施加化肥，會導致土壤板結、土壤吸收水分和養分的能力下降，影響農作物的生長發育，甚至還會造成土地退化等不良后果[3］。植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR）具有固氮、溶磷、合成吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid， IAA）和產嗜鐵素等多種促生特性，可促進植物的生長發育，提高作物的產量和品質[4］。此外，PGPR 還可以增強土壤肥力，減少化肥的使用，促進農業可持續發展。

氮是植物生長所需的營養元素，是核酸、氨基酸和蛋白質的主要成分[5］，也是影響玉米產量和品質的重要養分之一[6］。固氮菌通過固氮作用為植物提供氮元素，促進植物生長。Castellano 等[7］從玉米根際分離出2 株促進植物生長的固氮菌，提高了植株的總氮量。Thanh 等[8］在玉米根際分離出2 株具有較強固氮能力的菌株，促進了植物根系生長。研究表明，不同植物對銨態氮和硝態氮的喜好不同[9］。玉米偏好吸收銨態氮，固氮菌分泌的銨態氮可為玉米的生長發育提供氮源[10］。目前已經有研究分離出一些具有泌銨能力的固氮菌，Adriana 等[11］從向日葵（Helianthus annuus）根際中分離出3 株具有泌銨能力的固氮菌，經鑒定是芽孢桿菌屬（Bacillus）的一個新種，命名為向日葵類芽孢桿菌（Paenibacillushelianthi）。李瓊潔等[12］從玉米根際土壤中分離到一株具有泌銨能力的固氮菌株Kosakonia radicincitans。但是，關于具有泌銨能力的固氮菌對青貯玉米促生作用的研究還鮮有報道。

本研究從青貯玉米根際土壤中分離篩選得到2 株固氮菌，通過細菌形態學、16S rDNA 序列分析及生理生化特征對其進行鑒定，并評價菌株的泌銨能力及促生特性。在盆栽條件下評價2 株固氮菌對青貯玉米的促生效果，同時對氮代謝和氨同化相關基因的表達進行分析，并在田間條件下評價接種固氮菌對青貯玉米產量和品質的影響，為開發可應用于青貯玉米的固氮微生物菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗在2019-2020 年進行。供試土壤樣品取自哈爾濱師范大學農園（45°51′ N，126°32′ E）生長的青貯玉米根際，土樣采集后放置于無菌袋中，帶回實驗室4 ℃保存，用于固氮菌的分離與篩選。

1.2 試驗所用培養基

LB（luria-bertani）培養基[13］、阿須貝氏（Ashby）培養基[14］、DF（dworkin and foster）培養基[15］、PVK（pikovskaya）培養基[16］、MKB（modified king’s B）培養基[17］、甲基紅培養基、葡萄糖蛋白胨培養基、發酵半固體培養基、檸檬酸鹽培養基、淀粉水解培養基、H2S 培養基、明膠液化培養基、脲酶培養基[18］。

1.3 固氮菌的分離與篩選

參照姜瑛等[14］的方法從青貯玉米根際土壤中分離固氮菌。取1 g 青貯玉米根際土，加入盛有玻璃珠和99 mL無菌水的錐形瓶中，搖床振蕩30 min （28 ℃，180 r·min-1），靜置30 min。采用稀釋涂布平板法[19］分離細菌：取上清液稀釋成10-2、10-3、10-4和10-5的濃度梯度，各取100 μL 稀釋液涂布于Ashby 固體培養基上，倒置于28 ℃恒溫培養箱培養。待長出較多單菌落時，挑取有透明水解圈、生長情況良好、形態不同的單菌落，進行平板劃線純化培養，直至獲得純菌種，挑取單菌落接種于LB 固體培養基，菌落長出后于4 ℃保存，并制備成甘油菌-80 ℃保存備用。

采用凱氏定氮法測定菌株的固氮能力[20］。將分離篩選得到的菌株菌懸液分別接種到Ashby 液體培養基中，搖床振蕩培養（28 ℃，180 r·min-1，7 d），消化管中加入一定量樣品和10 mL 濃H2SO4進行消煮（180 ℃，60 min；300 ℃，120 min）。消化管冷卻后，加入2 mL H2O2繼續消煮至樣品澄清，使用定氮儀（KDN-103F，上海纖檢儀器有限公司）進行測定，每個處理3 次重復。以等量滅活菌體和無菌水作為空白對照。

1.4 菌株鑒定

將分離菌株在LB 固體平板上純化，觀察菌落形狀、顏色。參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18］和《伯杰細菌鑒定手冊》[21］，對篩選出的菌株在LB 固體培養基上劃線培養，觀察菌落形態特征，以及對菌株的甲基紅、伏普、吲哚、葡萄糖、檸檬酸鹽、接觸酶、淀粉水解、硫化氫、明膠液化、脲酶及革蘭氏染色等生理特征進行測定。

采用CTAB/NaCl 方法提取細菌DNA[22］。用原核生物16S rDNA 保守序列通用引物F8（5'-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3'）和R1541（5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'）進行PCR 擴增，將所得PCR 產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行DNA 測序。使用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上的BLAST 軟件將所得DNA 序列提交至GenBank 數據庫，與數據庫中的已知序列進行比對，選擇出同源性較高的相似序列，運用軟件MEGA 4.1 構建系統進化樹，采用Neighbor Joining 法的Complete Deletion 模式建樹。

1.5 菌株泌銨及促生能力測定

1.5.1 泌銨能力 采用靛酚藍比色法測定菌株的泌銨能力[23］。于試管中依次加入銨態氮標準液0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 和100 μL，用水將其總體積補充至100 μL，分別加入溶液A（稱取1.0 g 苯酚，溶于80 mL蒸餾水，加入0.4 mL 的1.25%亞硝基鐵氰化鈉溶液，定容至100 mL）和溶液B（稱取0.5 g 氫氧化鈉、0.4 g 檸檬酸三鈉和0.7 mL 次氯酸鈉溶液溶于80 mL 蒸餾水中，定容至100 mL）各5 mL，充分混合后，放入37 ℃水浴顯色20 min，取出后用水冷卻至室溫，在637 nm 下測定吸光值，制作標準曲線[24］。將菌株在LB 液體培養基中過夜培養（28 ℃，180 r·min-1），轉接至Ashby 液體培養基中生長3 d，取100 μL，其他操作同標準曲線，每個處理3 次重復。

1.5.2 溶磷能力 采用鉬銻抗顯色法計算有效磷含量[25］。挑選菌株接種到LB 液體培養基，離心（10000 r·min-1，10 min）富集菌體，用無菌水制備成菌懸液，將菌懸液濃度調至1×108cfu·mL-1，將菌懸液按1%量接種在PVK 液體培養基中，以不接菌培養基為對照，每個處理3 次重復，搖床振蕩培養（28 ℃，180 r·min-1，72 h），取發酵液離心（4 ℃，10000 r·min-1，10 min），取上清液，加5 mL 鉬銻抗顯色液定容至50 mL，暗反應30 min，600 nm 處測定吸光值，并計算有效磷含量，減去對照的值即為溶磷量。

1.5.3 合成IAA 能力 采用Salkowski 比色法測定菌株產IAA 能力[15］。供試菌株先在DF 培養基中培養（28 ℃，180 r·min-1，48 h），再取1 mL 轉入添加不同濃度色氨酸（L-Trp）的DF 培養基（含0、100、200 和500 μg·mL-1L-Trp）中繼續培養（28 ℃，180 r·min-1，48 h），取樣測菌液在600 nm 處的吸光值，其余菌液室溫下10000 r·min-1離心2 min，取500 μL 上清液，添加2 mL Salkowski 試劑，室溫培養20 min 后，在535 nm 處測吸光值，根據標準曲線計算菌液中IAA 含量。每個處理3 次重復。

1.5.4 產嗜鐵素能力 定量檢測參照王平等[17］的方法。將菌株接種于MKB 培養基中，搖床振蕩培養（28 ℃、180 r·min-1，48 h）；菌液離心，取3 mL 上清液，并加入3 mL CAS（chrome azurol sulphonate）檢測液，充分混勻，暗反應1 h，630 nm 處測吸光值（A），以去離子水與CAS 檢測液等體積混合測得的Ar 為空白對照，每個處理3 次重復，樣品中嗜鐵素的相對含量為A/Ar，該比值與產嗜鐵素能力成反比。

1.6 菌株對青貯玉米促生效果分析

1.6.1 盆栽接種試驗 供試青貯玉米種子“陽光一號”，由黑龍江省農業科學院草業研究所提供。挑取大小相似、顆粒飽滿的青貯玉米種子。75%的酒精表面消毒1 min，2%次氯酸鈉溶液表面滅菌2 min，無菌水洗滌3～5次。試驗設置：對照組：CK；處理組1：ZL-2；處理組2：ZL-13；菌懸液的制備：將活化后的菌株ZL-2 和ZL-13 分別接種于LB 液體培養基中培養（28 ℃、180 r·min-1，24 h），離心收集菌體，離心后重懸于無菌水中，利用血球計數板計數法[26］確定菌懸液濃度達到1×108cfu·mL-1，獲得的即為單一菌株的菌懸液。將種子分別浸入無菌蒸餾水（CK）、ZL-2 菌懸液、ZL-13 菌懸液中6 h，空氣干燥3 h。處理后的青貯玉米種子均勻播種于花盆中，每個花盆裝2.5 kg 農田土，每盆6 粒種子，3個重復。室溫培養，每天光照16 h，定期澆水。每隔7 d 用60 mL 菌懸液均勻澆灌于幼苗根部，對照組澆灌等量無菌水，共澆灌3 次。30 d 后測定青貯玉米的株高、根長、地上鮮重、地下鮮重、地上干重和地下干重等指標，并分別采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑TTC 法[27］、考馬斯亮藍染色法[28］、蒽酮硫酸法[28］測定根系活力、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量，參照《植物生物化學分析方法》[29］測定葉片銨態氮含量。

1.6.2 田間接種試驗 田間試驗于2020 年5 至10 月在哈爾濱師范大學農園進行。試驗設置：對照組：CK；處理組1：ZL-2；處理組2：ZL-13；處理組3：ZL-2+ZL-13；菌懸液的制備：單一菌株的菌懸液同盆栽條件下菌懸液的制備，將得到的無拮抗反應的單一菌株的菌懸液1∶1 混合，即獲得混合菌懸液。將種子分別浸入無菌蒸餾水（CK）、ZL-2 菌懸液、ZL-13 菌懸液及ZL-2+ZL-13 混合菌懸液中6 h，空氣干燥3 h。每個小區試驗地面積為33 m2，一壟為2.50 m×0.65 m，共20 壟，每壟種植10 株，四周設有保護行。在拔節期、大喇叭口期、抽雄期、吐絲期進行等量菌懸液灌根處理，110 d 收獲。采用5 點取樣法，測定青貯玉米株高、莖粗、鮮重和干重，并采用凱氏定氮法、釩鉬黃比色法測定粗蛋白含量、植株全磷含量[30-31］。

1.7 基因表達分析

以盆栽條件下青貯玉米幼苗的根、莖、葉為試驗材料。取青貯玉米的根、莖、葉，用自來水沖凈根部表面泥土，蒸餾水沖洗后用濾紙擦干，每種組織各稱取1.0 g，每個樣品3個重復。用錫紙將樣品包好，迅速放入液氮中速凍5 min，轉移至-80 ℃保存。采用TIANGEN 公司RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN DP432）試劑盒提取RNA，以青貯玉米根、莖、葉總RNA 為模板，使用TOYOBO 公司ReverTra Ace?qPCR RT Kit 反轉錄試劑盒進行反轉錄 得 到cDNA 貯 存 于-80 ℃冰 箱 備 用。利 用Primer Premier 5 設 計ZmAMTB、ZmAMT-4[32］、ZmGS1-3、ZmGOGAT2[33］基因引物。內參基因為GADPH[32］（表1）。采用Taq SYBR?Green qPCR 測試盒（來自TOYOBO公司）進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）。反應體系為： 10 μL 2×SYBR Premix ExTaqTM、0.8 μL 正向引物、0.8 μL 反向引物、0.4 μL 50×ROX Reference Dye、6 μL ddH2O，將反應體系混勻后加入2 μL 稀釋10 倍的cDNA 模板。反應程序為94 ℃ 30 s； 94 ℃ 5 s， 54 ℃ 15 s， 72 ℃ 31 s，循環40 次。采用2－ΔΔct法計算目標基因相對表達量[34］。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.8 數據處理

使用SPSS 26.0 統計分析軟件對試驗數據進行統計學分析。采用t檢驗法和單因素方差分析（ANOVA）進行不同處理組數據的比較分析。

2 結果與分析

2.1 固氮菌的分離與篩選

從青貯玉米根際土壤初步分離篩選出10 株在Ashby 固體培養基產生透明圈的固氮菌，分別記為ZL-1、ZL-2、ZL-4、ZL-7、ZL-9、ZL-10、ZL-13、ZL-15、ZL-16 和ZL-18。進一步對10 株菌株的固氮能力進行測定。結果表明，菌株ZL-2 和ZL-13 的固氮能力較強，菌株ZL-2 的固氮量為1.07 μg·mL-1，ZL-13 的固氮量為0.95 μg·mL-1（圖1）。

圖1 菌株的固氮能力Fig.1 Nitrogen fixation capacity of strains

2.2 菌株ZL-2 和ZL-13 的鑒定

菌株ZL-2 菌落呈淡黃色，邊緣整齊，不透明，革蘭氏染色為陰性；菌株ZL-13 菌落呈黃色，圓形，邊緣整齊，半透明，中心隆起，革蘭氏染色為陰性。提取細菌ZL-2 和ZL-13 的DNA，進行16S rDNA 序列PCR 擴增，菌株ZL-2 和ZL-13 擴增產物長度分別為1474 和1469 bp，ZL-2 的GenBank 登錄號為OQ852921，ZL-13 的GenBank 登錄號為MW577625。通過BLAST 進行比對，菌株ZL-2 與生癌腸桿菌（Enterobacter cancerogenus）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、桑樹腸桿菌（Enterobacter mori）、神戶腸桿菌（Enterobacter kobei）和霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）的同源性分別達99.11%、98.23%、98.02%、97.65%、99.02%；菌株ZL-13 與成團泛菌（Pantoea agglomerans）、Pantoea deleyi、布氏泛菌（Pantoea brenneri）、Pantoea anthophila、杓蘭泛菌（Pantoea cypripedii）和菠蘿泛菌（Pantoea ananatis）的同源性分別為98.70%、98.02%、98.26%、98.09%、95.65%、98.21%（圖2）?；?6S rDNA 和系統進化樹分析結果表明，菌株ZL-2 屬于腸桿菌屬（Enterobacter），菌株ZL-13 屬于泛生菌屬（Pantoea）。進一步通過生理生化試驗表明，菌株ZL-2 加入甲基紅指示劑后表現為黃色，呈陰性，菌株ZL-13 加入甲基紅指示劑后變為紅色，呈陽性；2 株菌株的伏普試驗現象均為紅色，均呈陽性；2 株菌株加入吲哚試劑后產生紅色，均呈陽性；菌株ZL-2 能利用葡萄糖，使指示劑變黃，為陽性，菌株ZL-13 不能利用葡萄糖，呈陰性；2 株菌株均可使檸檬酸鹽培養基由綠色變為深藍色，均能利用檸檬酸鹽，均呈陽性；滴加適量3% H2O2溶液，在30 s 內2 株菌株均產生大量氣泡，表明接觸酶為陽性；2 株菌株可以在淀粉培養基周圍出現無色透明環，均呈陽性；2 株菌株不能使H2S 培養基變黑，表明H2S 均呈陰性；2 株菌株均不能液化明膠；菌株ZL-2 可以使脲酶培養基變紅，脲酶反應呈陽性，菌株ZL-13 呈陰性；在顯微鏡下觀察2 株菌株的革蘭氏染色現象均為紅色，表明2 株菌株均為革蘭氏陰性菌（表2）。綜合細菌形態學、16S rDNA 序列分析和生理生化特征對篩選出的固氮細菌進行鑒定，確定菌株ZL-2 和ZL-13 分別為生癌腸桿菌和成團泛菌。

圖2 菌株16S rDNA 序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains 16S rDNA sequence

表2 菌株ZL-2 和ZL-13 生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strains ZL-2 and ZL-13

2.3 菌株泌銨能力及促生特性分析

對2 株固氮菌的泌銨、溶磷、產嗜鐵素和合成IAA的能力進行測定。結果表明，菌株ZL-2 和ZL-13 的泌銨能力分別為2.59 和2.11 μg·mL-1（圖3A）；有效磷含量分別為330.79 和368.91 μg·mL-1（圖3B）；嗜鐵素合成量（A/Ar 值）分別為0.61 和0.78（圖3C）。IAA 測定結果顯示，菌株ZL-2 和ZL-13 均具有合成IAA 的能力，其IAA 合成量隨L-Trp 濃度的增大而增加，當L-Trp 濃度為500 μg·mL-1時，IAA 合成量分別高達26.44 和23.50 μg·mL-1（圖3D）。

圖3 菌株ZL-2 和ZL-13 泌銨、溶磷、產嗜鐵素及合成IAA 能力Fig.3 Ammonium secretion， phosphorus solubilization， iron carrier and IAA production abilities of strains ZL-2 and ZL-13

2.4 固氮菌對盆栽青貯玉米促生能力的影響

接種菌株ZL-2 和ZL-13 的青貯玉米株高較對照分別增加了46.16%和37.14%（P＜0.05），根長分別增加了40.26%和54.28%（P＜0.05），地上鮮重、干重分別增加55.10%和50.73%、54.89%和47.74%（P＜0.05），地下鮮重、干重分別增加51.03%和53.93%、46.63%和47.75%（P＜0.05）（表3）。試驗結果表明，在盆栽條件下，接種固氮菌顯著促進了青貯玉米的生長（P＜0.05）。

表3 接種菌株ZL-2 和ZL-13 對青貯玉米幼苗生物量的影響Table 3 Effect of strains ZL-2 and ZL-13 inoculated on the biomass of silage maize seedlings

與對照相比，接種固氮菌ZL-2 和ZL-13 根系活力分別提高了33.90%和37.97%（P＜0.05）（圖4A），可溶性糖含量分別提高了56.90%和44.66%（P＜0.05）（圖4B），葉片銨態氮含量分別提高了369.94%和260.12%（P＜0.05）（圖4C），可溶性蛋白含量分別提高了77.67%和76.59%（P＜0.05）（圖4D）。

圖4 接種菌株ZL-2 和ZL-13 對青貯玉米生理特性的影響Fig.4 Effect of strains ZL-2 and ZL-13 inoculated on the physiological characteristics of silage maize

2.5 固氮菌在田間條件下對青貯玉米產量和品質的影響分析

與對照相比，單接種固氮菌株ZL-2、ZL-13 及雙接種ZL-2 和ZL-13 青貯玉米株高分別提高了11.91%、10.83% 和13.72%（P＜0.05），莖粗分別增加了13.89%、13.43% 和15.86%（P＜0.05），鮮重分別增加了20.34%、15.82%和23.73%（P＜0.05），干重分別增加了22.41%、16.38%和29.31%（P＜0.05）（表4）。表明，無論是單接種固氮菌ZL-2 或ZL-13，還是雙接種ZL-2 和ZL-13 對青貯玉米植株均有明顯促生作用，提高了青貯玉米的產量，雙接種效果更顯著。

表4 接種固氮菌對田間青貯玉米生物量的影響Table 4 Effect of nitrogen-fixing strains inoculated on the biomass of silage maize in the field

與對照相比，單接種菌株ZL-2、ZL-13 及雙接種ZL-2 和ZL-13 粗蛋白含量分別提高了63.81%、80.31%和173.50%（P＜0.05）（圖5A），全磷含量分別提高了10.59%、14.69%和26.73%（P＜0.05）（圖5B）。由此可以看出，田間條件下單接種固氮菌ZL-2、ZL-13 及雙接種ZL-2 和ZL-13 均提高了青貯玉米的品質，且雙接種效果更好。

2.6 接種固氮菌對青貯玉米的氮代謝和氨同化相關基因表達的影響分析

由圖6 可以看出，接種菌株ZL-2 和ZL-13 的青貯玉米，轉銨基因ZmAMTB在根、莖、葉中相對表達量顯著上調，且接種菌株ZL-2 的玉米ZmAMTB的相對表達量顯著高于接種菌株ZL-13（P＜0.05）（圖6A）。接種固氮菌的青貯玉米，與銨吸收相關基因ZmAMT-4的相對表達量只在根系中顯著上調（P＜0.05）（圖6B）。接種菌株的青貯玉米，氮代謝相關基因ZmGS1-3和ZmGOGAT2，只在葉中顯著上調表達，接種ZL-2 和ZL-13 的葉中ZmGS1-3基因相對表達量達到了對照組的1.97 和1.57 倍（圖6C），ZmGOGAT2基因相對表達量達到了對照組的1.95 和1.87 倍（P＜0.05）（圖6D）。

3 討論

氮是植物生長發育過程中重要的營養元素[35］。固氮菌是一種可進行固氮作用的微生物，通過自身分泌的銨態氮為植株提供氮源，促進植物生長、提高作物產量、改善作物品質，并減少化肥的使用，有利于促進農業的可持續發展[36］。國內外已有研究報道，具有泌銨能力的固氮菌有斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等[37］。本研究從青貯玉米根際土壤中篩選出2 株具有較強泌銨能力的固氮菌株ZL-2 和ZL-13，根據菌落形態、16S rDNA 序列分析和生理生化特征確定菌株ZL-2 為生癌腸桿菌和ZL-13 為成團泛菌。菌株ZL-2 和ZL-13 對青貯玉米有較強的促生效果，具有研制青貯玉米微生物菌劑的潛力，同時也豐富了固氮菌種資源。

有研究表明，固氮菌通過多種促生機制來刺激植物生長，包括泌銨、溶磷、植物激素（IAA）和鐵載體的產生[38］。固氮菌分泌的銨態氮和土壤中的銨態氮均可為植物提供充足的氮元素，NH4+參與植物體內的氮代謝以及氨同化，接種固氮菌后提高了玉米蛋白含量[10］。Islam 等[39］報道接種具有固氮能力的假單胞菌（Pseudomonas）對辣椒（Capsicum annuum）的株高和干重均有顯著影響。黃書超等[40］研究發現，添加固氮菌可促進萵筍（Lactuca sativavar.asparagina）生長、提高可溶性蛋白和可溶性糖含量。本研究篩選出的2 株固氮菌株，在盆栽條件下均顯著提高了青貯玉米的生物量、葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量。在田間條件下，接種固氮菌株ZL-2、ZL-13 及雙接種ZL-2 和ZL-13 均顯著提高了青貯玉米的產量。以上結果表明，固氮菌可顯著促進青貯玉米生長，提高玉米的生物量。

磷是植物生長發育所需的僅次于氮的第二大營養元素[41］，磷在土壤中大多以難溶磷酸鹽形式存在，植物無法直接利用，而具有溶磷能力的菌株可將難溶的磷酸鹽轉化為植物可以直接利用的形式。趙衛松等[42］從番茄（Solanum lycopersicum）的根圍土壤中篩選具有溶磷特性的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），接種該菌株顯著增加了番茄生物量和植株有效磷含量。在缺鐵營養液中添加難溶性鐵及具有產嗜鐵素能力的菌株發酵濾液，可顯著增加黃瓜（Cucumis sativus）幼苗的株高、根長、葉長和鮮重[43］。研究表明，根際細菌產生IAA 與植物生長促進有關，特別是根系起始和伸長[44］。將分泌IAA 的Pseudarthrobactersp. 接種到水楊梅（Geum aleppicum）上可以刺激根系發育，促進水楊梅的地上和根的生長[45］。Zhang 等[46］從木薯（Manihot esculenta）中分離獲得一株具有合成IAA 和溶磷能力的固氮菌，接種該菌株促進了木薯的生長，表明這不僅是菌株固氮作用的結果，而且與固氮菌合成IAA 和溶磷能力有關。在本研究中，盆栽青貯玉米接種ZL-2 和ZL-13 后，幼苗的地上干鮮重、地下干鮮重顯著高于對照組（P＜0.05）。同時，在大田條件下單接種菌株ZL-2、ZL-13 及雙接種ZL-2 和ZL-13 均增加青貯玉米的全磷和粗蛋白含量。接種固氮菌顯著提高青貯玉米的生物量和品質，這可能是由于該固氮菌株具有較強的泌銨、合成IAA、產嗜鐵素和溶磷的能力。

氮在植物的生命過程中發揮著重要的作用，氮同化是植物利用氮素的一個中心環節，其中銨態氮同化是氮同化中最為關鍵的一步[47］，銨處在整個氮同化代謝的重要位置[48］。李紅梅等[33］對玉米轉銨蛋白家族進行分析發現ZmAMT-4在玉米的根中表達，可能在根對銨根離子吸收中發揮重要的作用。徐曉鵬等[47］提出植物體內銨態氮同化機制都是通過谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（glutamine synthetase/glutamate synthetase，GS/GOGAT）途徑進行。玉米吸收NH4+進入植物體后，一部分NH4+直接參與氮同化代謝過程；另一部分NH4+與植物體內谷氨酸結合，在谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的調控下參與氨同化過程，進而參與氮同化代謝過程[49-50］。本研究發現青貯玉米接種ZL-2 和ZL-13 后，ZmAMT-4基因在根部顯著上調表達，ZmAMTB基因在根莖葉中均顯著上調表達（P＜0.05），說明ZmAMTB基因可能與銨根離子在各個組織中的分布有關。ZmGS1-3基因和ZmGOGAT2基因集中在葉顯著上調表達（P＜0.05），這可能是青貯玉米葉片銨態氮含量增加的原因。這從分子水平上進一步證明了，接種固氮菌提高了青貯玉米的氮代謝和氨同化能力，進而提高青貯玉米的品質。

4 結論

從青貯玉米根際土壤中篩選出2 株具有泌銨和多重PGPR 特性的固氮菌，分別為生癌腸桿菌和成團泛菌。盆栽試驗結果表明，接種2 株固氮菌均可促進青貯玉米的生長。田間試驗結果表明，單接種固氮菌ZL-2、ZL-13及雙接種ZL-2 和ZL-13 均可促進青貯玉米的生長，提高青貯玉米的產量和品質。接種固氮菌ZL-2 和ZL-13 還可以促進青貯玉米的氮代謝和氨同化相關基因的表達。固氮菌ZL-2 和ZL-13 可作為開發微生物制劑的優質菌種資源。