質體ACCase Trp-1999-Leu 突變對小麥田菵草生長適合度的影響

白霜，呂慶浩，李怡慧，劉國平，羅小勇，李凌緒*

（1. 青島農業大學植物醫學學院，山東省植物病蟲害綠色防控工程研究中心，山東 青島 266109；2. 安丘市景芝鎮農業綜合服務中心，山東 濰坊 262119）

菵草（Beckmannia syzigachne）是我國常見的禾本科二倍體雜草，喜濕，在長江中下游地區、山東省微山湖地區的稻茬麥田發生尤為嚴重[1］。精噁唑禾草靈是小麥田苗后選擇性防除禾本科雜草的主要藥劑之一[2］，通過抑制禾本科雜草質體型乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl co-enzyme A carboxylase， ACCase）的活性影響脂肪酸的合成，導致植物死亡[3-4］。但是，越來越多的雜草已被報道對ACCase 抑制劑產生抗藥性，這種抗性往往與靶標基因變異有關。目前，已報道雜草ACCase CT 區域突變較多的氨基酸殘基位點是2041 和1781 位，最少的是2088 位。不同位點氨基酸變異的形式也存在多樣化，例如2041 位異亮氨酸（isoleucine， Ile）突變為天冬酰胺（asparagine， Asn）頻率較高，1781 位異亮氨酸（isoleucine， Ile）變為亮氨酸（leucine， Leu）頻率較高而變為纈氨酸（valine， Val）、蘇氨酸（threonine， Thr）頻率較低[5］。實驗室前期采集自江蘇丹陽的麥田菵草種群JS-26 已明確對ACCase 抑制劑精噁唑禾草靈、唑啉草酯、噁唑酰草胺、烯禾啶、氰氟草酯等均產生不同程度抗性，靶標酶質體型ACCase 1999 位點氨基酸變異（Trp 突變為Leu）是其對上述除草劑產生抗性的重要原因[6］?？顾幮噪s草一旦脫離除草劑的選擇壓力，其適應生存環境的能力可能會降低，即所謂的適合度代價[7-9］。菵草抗性機制的明確對其治理策略提供了理論基礎，但是在無除草劑選擇壓力下，抗性菵草在田間如何演化，群落如何演替等一系列與生產密切相關的問題還亟待解決，而對抗性菵草適合度的深入研究將有效解釋此類問題。因此，明確抗藥性雜草在無除草劑選擇壓力下的適合度變化對抗性雜草的治理意義重大[4］。目前，質體型菵草ACCase Ile-1781-Leu、Trp-2027-Cys、Tle-2041-Asn、Asp-2078-Gly、Gly-2096-Ala 突變型的適合度代價已被明確，例如Ile-1781-Leu 突變能提高菵草的相對生長速率及凈同化率，但對該基因型菵草的競爭力無顯著影響；Trp-2027-Cys 突變能降低菵草種子產量但對營養期生長無影響；Tle-2041-Asn 和Gly-2096-Ala 突變則對菵草營養期生長及競爭能力均無顯著影響；Asp-2078-Gly突變可降低菵草的生長速率及凈同化率，同時還會影響菵草的植株生物量、株高及結種量[7］。但是Trp-1999-Leu突變對菵草的生長特性、繁殖力和競爭力等適合度變化的影響未見報道。

對抗性菵草適合度的分析需要注意選擇與抗性菵草具有相似遺傳背景的材料作對照，因為不同遺傳背景下的種群往往表現出不同的生長特性。本研究的兩種基因型菵草均分離自JS-26 種群，參照之前的衍生酶切擴增序列多態性技術（derived cleaved amplified polymorphic sequences， dCAPS）方法[10］，通過錯配引入Hind III 的酶切位點（AAGCTT）擴增JS-26 菵草質體Accase CT 區片段，分析菵草質體ACCase 的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism， SNP）（G/T）。擴增產物經Hind III 內切酶消化后電泳檢測，野生型種群只有一條390 bp 條帶，純合突變型種群有一條可見的349 bp 條帶和一條不可見的41 bp 條帶，雜合型同時存在390 和349 bp 兩條條帶。根據dCAPS 分析結果，純合野生型和突變型種群被分別置于不同溫室培養，收取純合基因型菵草種子[11］。本研究以不存在遺傳背景差異的ACCase 1999 位突變純合體（Trp/Trp， RR）和1999 位純合野生型（Leu/Leu， SS）為研究對象，研究1999 位點Trp 突變為Leu 對菵草的生長特性及生態適合度的影響，以期為該基因型菵草的進化及治理提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗性菵草種群JS-26 采集自江蘇省丹陽市，其質體ACCase CT 區域1999 位氨基酸色氨酸（tryptophane， Trp）突變為Leu，通過dCPAS 法[10］從JS-26 種群中分離得到純化的RR 及SS 基因型。

1.2 種子萌發及培養

將菵草種子放在鋪有兩層濾紙的9 cm 培養皿中，加入5 mL 清水，將培養皿置于光照培養箱中催芽，每天更換一次水。培養箱溫度為白天20 ℃/晚上10 ℃，光照周期為12 h 晝夜交替。當幼苗長至1～2 cm 時，根據試驗要求將其移栽至相應大小的花盆中，花盆均為直徑22.5 cm×高15 cm。填盆基質為取自青島農業大學牡丹園未施用過除草劑的壤土，過2 mm 篩。除田間競爭試驗外，室內培養條件均為白天溫度（25±5） ℃，夜間（15±5） ℃。

1.3 早期生長特性對比

催芽后的RR 和SS 基因型菵草移栽于花盆中培養。每盆移栽5 株，每個基因型20 盆。分別于移栽后第10 和15 天測量株高及地上生物量，整體試驗重復兩次。

1.4 營養生長期生長特性對比

萌發后的菵草移栽至花盆中培養，菵草葉面積和地上干重于移栽后的第25 和53 天進行測量和記錄，每個基因型每次測量4 盆，取平均值。比較兩種基因型菵草相對生長速率（relative growth rate， RGR）[12］、凈同化率（net assimilation rate， NAR）和葉面積比（leaf area ratio， LAR）[13］的差異，整體試驗重復兩次。計算公式如下：

式中：t為時間，W為干物質量，w1、w2分別為t1、t2時間的干物質量。

式中：L為葉面積，L1、L2分別為t1、t2時間的葉面積。

1.5 成熟期生長特性對比

將RR 和SS 幼苗移栽入花盆中。在日光溫室中培養，按需定量澆水，自然光照，隨機擺放花盆并定期打亂，花盆大小、植株培養基質、培養條件如1.2 所述。觀察記錄菵草的分蘗數，評估每株植物的生殖生長情況。

從第一次成熟開始依次收集RR 和SS 植株的花序，將每一株植株的花序脫粒，分離種子，并對總種子質量進行量化。每棵菵草的種子產量（Sn）為：

式中：TSW為每株菵草產生的總種子重量，SW為每株菵草100 粒種子的重量。

根據Reekie 等[14］的方法估算每個基因型植物中分配給種子的資源的相對比例[即繁殖力（reproduction effort， RE）］。計算公式如下：

式中：Sb表示每株菵草所有種子的生物量，Tb表示每株植物產生的總生物量（根、莖、葉、花序和種子）。

1.6 室內條件下菵草的種間競爭力對比

在室內采用盆栽法比較兩種基因型菵草和小麥（Triticum aestivum）的種間競爭力。把出芽的菵草移栽入直徑24 cm×高12 cm 的花盆中，每盆4 株菵草。在種植菵草的花盆中植入小麥（寧麥13），使得盆中小麥密度依次為0、40、80、160、320、640 株·m-2?；ㄅ桦S機擺放并每2 d 隨機調整位置。在小麥成熟前，測定菵草的結種量、地上生物量[6］，每處理包含4 次重復。

數據處理參照Vila-aiub 等[15］的方法，利用SigmaPlot 采用雙曲非線性模型計算評價兩種基因型菵草在室內盆栽條件下與小麥的競爭力，計算公式如下：

旅游作為消費者行為自古至今普遍存在，但醫療旅游、自然醫藥旅游、健康旅游等旅游的具體形式又因社會制度、發展階段、經濟水平、文化信仰等不同而存在巨大差異。

式中：x表示小麥密度，y表示菵草種子產量，a表示無小麥時菵草種子產量，b表示斜率。曲線坡度越大，表示與小麥的競爭力越弱。

1.7 田間條件下菵草的種間競爭力對比

為了驗證兩種基因型菵草和小麥的種間競爭力，分別于2019 和2020 年開展田間競爭試驗，試驗地分別位于山東省萊西市和青島市即墨區。田間小麥品種均為濟麥20，小麥行間距為18 cm，種植小麥后10 d，在小麥行間移栽三葉期菵草，菵草株間距為18 cm。小區設為1.5 m×1.2 m，每小區移栽20 株菵草，采用隨機區組設計，每基因型移栽4個小區作為4 次重復，共計8個小區[16］。整個生長周期人工除草，田間管理方式按照當地常規操作進行。次年菵草成熟后收集其種子，測定種子產量，并測定其株高、分蘗數和地上生物量。

1.8 數據處理

試驗結果均以平均值±標準誤表示，使用Excel 2010 軟件對數據進行統計、處理，采用IBM SPSS Statistics 26 軟件對數據進行獨立樣本t檢驗（α=0.05），并通過SigmaPlot 12.5 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 早期生長特性分析

為了明確兩種基因型菵草的早期生長差異，本研究測定了菵草移栽第10 和15 天時的株高、地上生物量。結果表明，在菵草移栽第10 天時，抗性菵草RR 與敏感型菵草SS 的生物量和株高均無顯著差異；但是在第15 天時，RR 型菵草的生物量和株高分別為2.05 g·株-1和86.65 mm，SS 型菵草的生物量和株高分別為2.73 g·株-1和97.92 mm，RR 植株的生物量和株高分別顯著低于SS 植株24.9%和11.5%（表1），由此說明早期生長階段抗性菵草RR的生長速率稍慢于SS 型菵草。

表1 不同基因型菵草早期生長階段植株生物量和株高對比Table 1 Comparison of biomass and plant height of different B.syzigachnegenotypes in early growing stage

2.2 營養生長期生長特性對比

為明確兩種基因型菵草在營養生長階段的生長差異，本研究測定了兩種基因型菵草在移栽后第25 和53 天時的地上生物量及葉面積，并分別測定了二者在移栽25～53 d 這一階段的相對生長速率、凈同化率和葉面積比。結果表明，兩種基因型菵草在25 和53 d 時地上生物量及葉面積均無顯著差異；然而在這一生長階段，RR 型菵草表現出了較低的相對生長速率（RGR）和凈同化率（NAR），分別比SS 型低18.2%和28.6%，但RR 型卻具有更高的葉面積比（LAR），比SS 型高14.0%（表2），這可能是導致二者在53 d 時具有相似地上生物量的原因。而且在這一階段，RR 和SS 型較早期生長差異有所減小。

表2 不同基因型菵草營養生長期階段的生長參數Table 2 Plant growth traits of different B. syzigachnegenotypesat the vegetative stage

2.3 成熟期生長特性對比

為了明確兩種基因型菵草在成熟期時的生長特性差異，在溫室條件下比較了兩種基因型菵草在成熟期時的分蘗數、平均植株總生物量、平均植株種子數、平均植株總種子重量和繁殖力。結果表明，兩種基因型菵草在植株成熟期時平均植株總生物量、分蘗數、平均植株種子數均無顯著差異（表3）。但是RR 型菵草在平均植株總種子重量、繁殖力方面表現出劣勢，與SS 型植株相比，RR 基因型平均植株總種子重量減少11.4%，繁殖力降低13.1%（表3）。

表3 不同基因型菵草植株繁殖力對比Table 3 Comparison of reproduction effort between different B. syzigachnegenotypes

2.4 室內條件下菵草與小麥的競爭力對比

為了明確兩種基因型菵草與小麥的種間競爭力差異，在室內條件下，利用盆栽試驗比較了兩種基因型菵草對不同密度的小麥的競爭反應。結果表明，隨著小麥密度的增加，兩種基因型菵草的長勢、結種量均受到抑制，但是RR 基因型菵草表現出更弱的競爭能力。在40、80、160、320、640 株·m-2的小麥密度下，RR 型菵草的地上生物量比SS 型分別降低了29.6%、35.2%、41.5%、46.6%、42.4%（圖1）；平均種子產量比SS 型分別降低了46.6%、51.5%、48.2%、64.9%、55.9%（圖2）。

圖1 RR 和SS 基因型菵草在不同小麥密度下的地上生物量Fig. 1 Aboveground biomass of RR and SS genotypes B.syzigachne at different wheat densities

圖2 RR 和SS 基因型菵草在不同小麥密度下的平均種子產量Fig. 2 Average seed yield of RR and SS genotypes B.syzigachne at different wheat densities

2.5 田間條件下菵草的種間競爭力對比

為了進一步驗證室內兩種基因型菵草與小麥競爭力差異的結果，在田間條件下比較了在小麥競爭下的兩種基因型菵草的株高、分蘗數、地上生物量和種子產量。田間試驗分兩年兩地進行，菵草生長期間未施用任何除草劑。兩地試驗結果均表明，經過8個月的生長，兩種基因型菵草株高、分蘗數差異不顯著；但RR 基因型菵草與SS 型相比其地上生物量和種子產量分別減少了17.6%、21.1%（即墨），30.2%、34.7%（萊西）（表4）。這表明RR 基因型菵草在地上生物量和種子產量方面表現出一定的適合度代價，這與室內盆栽試驗結果一致。

表4 不同基因型菵草在田間競爭壓力下的生長參數Table 4 Growth traits under competitive pressure in the field of different B. syzigachnegenotypes

3 討論

衡量個體或種群在不同環境下的適應程度，或者是個體對群體基因庫的相對貢獻程度即所謂的適合度，也是指特定基因型個體在同種生物群體中生存和繁衍后代的能力[17-19］。具有抗性基因存在的雜草在無除草劑選擇壓力下的適合度變化對預測其進化動態至關重要，也可以為利用其產生的適合度代價進行抗性雜草的治理提供參考。對抗性雜草適合度的分析需要選擇遺傳背景相似的試驗材料作對照，本研究的兩種基因型菵草不存在遺傳背景差異。

本研究中，在菵草早期生長階段，RR 基因型菵草生物量積累效率較低，僅在種植后的10～15 d，RR 型菵草的地上生物量和株高分別比SS 低24.9% 和11.5%（表1）。含有5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸酯合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphase synthase， EPSPS）雙位點突變（Thr-102-Ile/Pro-106-Ser）的草甘膦抗性牛筋草（Eleusine indica）在早期生長階段也表現出了較慢的生長速率[20］，這說明在沒有除草劑的選擇壓力下，ACCase Trp-1999-Leu 變異可能影響植株在早期生長階段的生物量積累效率。在菵草營養生長階段，RR 基因型菵草的相對生長速率和凈同化率均低于SS 型（表2），這表明RR 型在捕獲光、吸收二氧化碳或儲存光同化物方面弱于SS植株[21］。但是RR 型具有較高的葉面積比，這也有可能是造成RR 和SS 在53 d 時具有相近生物量積累的原因。在抗ACCase 抑制劑類除草劑的硬直黑麥草（Lolium rigidum）中，ACCase Asp-2078-Gly 突變會導致其營養生長階段RGR、NAR 降低，但是對LAR 沒有明顯影響，最終抗性植株表現出較低的生物量積累[22］。在抗ACCase 抑制劑類除草劑的菵草中，Asp-2078-Gly 突變導致菵草RGR、NAR、LAR 均有所降低，Ile-2041-Asn、Gly-2096-Ala突變則對菵草的RGR、NAR 和LAR 沒有顯著影響[21］。在抗性棒頭草（Polypogon fugax）和大穗看麥娘（Hordeum glaucum）中，ACCase Ile-2041-Asn 突變同樣沒有影響植株的營養生長[23-24］。但是對乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase， ALS）抑制劑產生抗性的播娘蒿（Descurainia sophia），Pro-197-Leu、Pro-197-His、Pro-197-Thr、Asp-376-Glu、Trp-574-Leu 等基因突變可顯著降低播娘蒿的生物量積累[25］?；谝陨习咐治?，相同基因的相同位點突變會因雜草種類或種群不同表現出不同的生長效應，同一種群雜草也會因相同基因的不同位點突變或同一位點的不同突變形式表現出不同的生長狀態，可見基因突變對雜草生長的影響受雜草種類、種群不同而呈現多效性。

本研究發現Trp-1999-Leu 純合突變型菵草（RR 型）和純合野生型菵草（SS 型）在成熟期的分蘗數、平均植株總生物量和種子數量未見顯著差異，但是Trp-1999-Leu 純合突變型菵草平均植株總種子重量和繁殖力顯著低于野生型菵草，這說明ACCase Trp-1999-Leu 基因突變使菵草在生殖生長方面產生明顯的適合度代價。其他抗性雜草因除草劑靶標基因突變導致種子產量適合度降低也有類似的報道。例如對比抗ACCase 抑制劑類除草劑的硬直黑麥草ACCase Ile-1781-Leu 突變型和野生型的繁殖力發現，抗性突變個體產生的種子千粒重要低于野生型個體[26］。在ALS Trp-574-Leu 突變導致的抗ALS 抑制劑的早熟禾（Poa annua）中也發現了這種適合度代價，該突變導致抗性植株種子產量降低、分蘗減少[27］。而ACCase Ile-2041-Asn 突變則不會影響棒頭草的繁殖力[24］。這說明，除草劑靶標基因抗性突變對抗性植株繁殖力的適合度影響是多樣的。但是靶標基因抗性突變使植株產生繁殖力的適合度代價對雜草治理十分有利，如若發現靶標基因突變降低抗性種群繁殖力的雜草種群，不施用除草劑或許更有助于抗性雜草的治理。

本研究同樣比較了Trp-1999-Leu 純合突變型菵草和純合野生型菵草與小麥競爭能力的差異。分別在室內和田間條件下展開試驗。室內競爭試驗表明，RR 和SS 型菵草的結種量和地上生物量均隨小麥密度增加而降低，而RR 型菵草結種量和地上生物量，均顯著低于SS 型菵草。田間試驗與室內結果基本一致：Trp-1999-Leu 突變對菵草植株的株高和分蘗數均影響不大，但結種量和地上生物量均受到顯著影響，在即墨和萊西地塊均得到了一致的試驗結果（表4）。因此，ACCase Trp-1999-Leu 突變可降低菵草與小麥的競爭力，尤其在繁殖和生物量積累方面使菵草表現出明顯的適合度代價。本試驗結果可說明，在有小麥競爭的條件下，抗性菵草在田間傳播、擴散能力更弱。相似的結果在其他雜草中也有報道，例如ALS Ala-122-Asn 突變的抗性稗草（Echinochloa crus-galli）在存在種間競爭和非競爭條件下抗性植株均發育遲緩[28］。ACCase Trp-2027-Cys 突變型菵草結種量減少；Asp-2078-Gly 突變型菵草的生物量、結種量均顯著降低[7］。綜上說明，除草劑靶標基因的變異或許會降低某些雜草的種間競爭力。這種適合度代價對抗性雜草的治理十分有利，競爭力降低的抗性雜草在無除草劑的選擇壓力下，種群自然進化可能朝著減少的趨勢發展。如若抗性雜草存在靶標基因變異但生長未受影響，這無疑會加大抗性雜草的治理難度。

4 結論

本研究以質體ACCase 等位基因純合突變引起抗性的菵草及純合野生型菵草為研究對象，探討了Trp-1999-Leu 突變對菵草生長、繁殖及競爭力的影響。結果表明該基因突變可減緩菵草在早期階段的營養生長。但是在生長的中期，RR 與SS 地上生物量積累差異并不顯著。在存在小麥種間競爭條件下，ACCase Trp-1999-Leu 基因突變雖不影響菵草的株高及分蘗，但會顯著降低菵草的繁殖力和地上生物量，產生明顯的競爭力適合度代價，這種代價在無除草劑競爭壓力下可降低該基因型菵草的治理難度。