堿解法優化可溶性羽毛肽工藝研究*

吳承燕，何愛明，張焦南，胡兵，陳文韜*

（1.福建技術師范學院，福建 福清 350300；2.福建省特種水產配合飼料重點實驗室，福建 福清 350300）

我國家禽養殖業規模迅速擴大，廢棄羽毛數量也隨之增加[1]。禽類羽毛往往由富含二硫鍵的角蛋白組成，蛋白含量高達85%～90%，但是羽毛韌性高且機械強度大，表面覆蓋脂質降低了角蛋白的親水性，很難被常見的蛋白酶水解[2,3]。羽毛直接丟棄填埋也很難被土壤微生物分解，同時會對水體、空氣等環境造成污染，甚至滋生有害細菌及病毒，危及人體健康[4]。作為家禽加工的副產品，羽毛資源的開發利用具有較高的經濟價值，前景廣闊，可以作為新型的食品原輔料應用到食品加工行業中，對促進經濟的發展和環境的保護都具有很大的意義。

常用的羽毛肽提取方法包括酸解法、堿解法及酶解法，一般均需先破碎形成羽毛漿，之后制備羽毛粉，步驟繁瑣[5-7]。本研究利用堿解法制備可溶性羽毛肽，先將廢棄雞羽毛蓬松打碎，增大與提取液直接接觸面積，并通過單因素及正交實驗，探究氫氧化鈉溶液質量分數、水解時間、水解溫度、料液比對提取率的影響，以期為廢棄雞羽毛的高值化應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞羽毛：市售；氫氧化鈉、茚三酮、氯化亞錫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；濃鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（BS224S）：北京賽多利斯儀器系統有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-2）：國華電器有限公司；紫外分光光度計（UV754N）：上海佑科儀器儀表有限公司；精密pH計（PHS-3C）：上海儀電科學儀器股份有限公司；萬能高速粉碎機（DE-400）：浙江紅景天工貿有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（GZX-GF101-3-BS-Ⅱ）：上海躍進理療機械有限公司；電子調溫萬用電爐（DK-98-Ⅱ）：天津市泰斯特儀器有限公司；凱氏定氮儀（K8940）：濟南海能儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 羽毛肽的制備與測定

預處理：將雞羽毛洗凈，于45 ℃下烘干，放入粉碎機粉碎，收集蓬松的羽毛絨，置于干燥處備用。

氨基酸標準曲線的繪制：將0.2000 g賴氨酸溶于去離子水中，定容至100.00 mL。吸取10.00 mL賴氨酸溶液稀釋至100.00 mL，得200 μg/mL的氨基酸標準溶液。分別吸取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL氨基酸標準溶液，各加入茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液1 mL，混合均勻后置于沸水浴中加熱15 min，取出后置于冷水中降至室溫，定容至25.00 mL，靜置15 min后在570 nm下測定吸光度值。以所含氨基酸質量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線如圖1所示。

圖1 氨基酸含量標準曲線

羽毛肽制備與測定：取羽毛絨置于一定量氫氧化鈉溶液中，加熱堿解，堿解液旋蒸2 h后得濃縮堿解液。取10 mL濃縮堿解液加入50 mL去離子水及5 g活性炭脫色，加熱至沸并保持30 s。過濾后濾液用水定容至100.00 mL。加入茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液各1 mL，混合均勻后置于沸水浴中加熱15 min，冷至室溫，定容至25.00 mL，靜置15 min后在570 nm下測定吸光度值。利用茚三酮測量氨基酸法雞羽毛水解液中的氨基酸含量, 計算公式如式⑴所示。

式⑴中，c為氨基酸標準曲線上查的的氨基酸含量，μg/mL；K為樣品稀釋倍數；V為測定時取樣體積，mL。

1.3.2 單因素實驗

分別選取氫氧化鈉溶液質量分數（2%、4%、6%、8%、10%）、料液比（1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶14）、水解時間（2、4、6、8、10 h）、水解溫度（50、60、70、80、90 ℃）進行單因素實驗。水解后將pH值調至6.8～7.2，考查各因素對羽毛肽制備的影響。每組實驗設置3個平行。

1.3.3 正交試驗

在單因素實驗的基礎上，設置水解溫度(A)、水解時間(B)、氫氧化鈉溶液質量分數(C)和料液比(D)為主要影響因子，每個影響因素各取3個水平進行L9(34)正交試驗，試驗因素水平如表1所示。

表1 水解因素水平表

1.3.4 數據處理

采用Origin和SPSS軟件對數據進行繪圖和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 氫氧化鈉溶液質量分數對羽毛水解的影響

氫氧化鈉溶液質量分數對羽毛水解的影響如圖2所示。由圖2可知，羽毛水解后的氨基酸含量隨氫氧化鈉溶液質量分數呈現先上升后下降的趨勢，這是因為氫氧化鈉溶液質量分數較低時水解不完全，過高時則會破壞氨基酸結構，為4%時氨基酸含量最高，表明此時水解程度最大，因此水解羽毛的較佳氫氧化鈉溶液的質量分數為4%。

圖2 氫氧化鈉溶液質量分數對羽毛水解的影響

2.1.2 料液比對羽毛水解的影響

料液比對羽毛水解的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著料液比的降低，水解羽毛所得的氨基酸含量呈快速上升趨勢，在料液比為1∶12時達到最大值。這是因為隨著液體體積的增加，羽毛與氫氧化鈉接觸碰撞的機會降低，從而減慢反應速率，且體積的增大增加了處理成本。綜合考慮水解羽毛的較佳料液比為1∶12。

圖3 料液比對羽毛水解的影響

2.1.3 時間對羽毛水解的影響

時間對羽毛水解的影響如圖4所示。由圖4可知，前8 h羽毛水解出的氨基酸含量不斷升高，且反應速率較快，但8 h后水解速率增加放緩，可能是因為8 h時羽毛與氫氧化鈉添加量之間達到平衡。因此水解羽毛的較佳時間為8 h。

圖4 時間對羽毛水解的影響

2.1.4 溫度對羽毛水解的影響

溫度對羽毛水解的影響如圖5所示。由圖5可知，隨著溫度的升高，羽毛水解出的氨基酸含量也隨之增多。在低于70 ℃時，水解速率較快，這是因為升溫可提升羽毛與氫氧化鈉之間的碰撞頻率，在溫度高于70 ℃后，水解速率增加明顯放緩，因此水解羽毛的較佳溫度為70 ℃。

圖5 溫度對羽毛水解的影響

2.2 正交試驗結果分析

正交試驗結果如表2所示。由表2可知，以氨基酸含量為評價指標，最佳水解工藝為A3B3C3D2，即氫氧化鈉溶液質量分數為5%、料液比1∶12、水解時間9 h、水解溫度75 ℃。由表2數據進行方差分析，結果如表3所示，A、B、C、D均有顯著意義。按優選出的條件進行驗證試驗，平行3組，測得氨基酸含量分別為949.91、948.98及952.22 μg/g，平均含量為950.37 μg/g，RSD為0.18%，驗證中氨基酸含量均高于正交最高，具有較好重現性，表明此水解工藝條件穩定可行。

表2 羽毛水解工藝正交試驗設計表及結果

表3 多因素方差分析表

3 結論

本實驗以羽毛為原料，通過酶解法制備羽毛肽，通過單因素實驗及正交試驗對氫氧化鈉溶液質量分數、料液比、水解時間和水解溫度這4個因子進行優化，得到最佳工藝條件：氫氧化鈉溶液質量分數5%、料液比1∶12、水解時間9 h、水解溫度75 ℃。按最佳水解工藝進行驗證試驗，穩定性好，證明了該水解工藝的可行性，適合工業化大生產。