miR-34a調控PI3K/AKT通路對口腔癌細胞生物學行為的影響及機制

梅冰馨 劉克華 張太陽

(贛南醫學院第一附屬醫院口腔科,江西 贛州 341000)

口腔癌是一種預后較差的頜面部惡性腫瘤之一〔1,2〕?？谇话┎∫蚣鞍l病機制還未完全揭示,人們公認口腔衛生差、吸煙、酗酒等因素均可導致口腔癌發病〔3〕。雖然目前關于口腔癌的臨床治療已獲得重大進步,然而該疾病患者5年生存率仍不足65%,給人類生命健康帶來巨大的打擊〔4〕。故探究口腔癌病因及發生機制已成為研究人員關注的重點課題之一。大量研究顯示,微小RNAs(miRNAs)可通過發揮腫瘤基因或腫瘤抑制基因的作用進而參與腫瘤細胞增殖、分化、侵襲等相關環節〔5〕。miR-34a已被證實在肺癌〔6〕、結腸癌〔7〕等多種實體瘤中的表達異常下調,提示其可能是作為潛在的腫瘤抑制基因發揮作用。據報道,磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路是和細胞增殖、侵襲及遷移等密切相關的信號途徑,在腫瘤起病及演變過程中扮演關鍵角色。然而目前關于miR-34a調控PI3K/AKT通路對口腔癌細胞生物學行為的影響及機制研究較少,因此本研究對其進行探究。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 人口腔角質形成細胞HOK及人口腔癌細胞Tca8113、OEC-M1、OC3購于晶萊生物公司。細胞培養于DMEM培養基(含10%胎牛血清)中,然后置于細胞培養箱中孵育并傳代。

1.2主要試劑 Trizol試劑(北京啟衡星生物公司);聚偏氟乙烯(PVDF)膜(北京諾博萊德科技公司);PI3K、p-PI3K抗體(上海臻科生物公司);AKT、p-AKT抗體(深圳市豪地華拓生物公司);噻唑藍(MTT)細胞增殖檢測試劑盒(沈陽萬類生物公司);0.25%胰蛋白酶(武漢普諾賽生命科技公司);放射免疫沉淀(RIPA)試劑(蘇州近岸蛋白質科技公司);磷酸鹽緩沖液(PBS)粉劑(上海信帆生物公司);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(北京凱詩源生物公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(長沙艾碧維生物公司);聚合酶鏈反應(PCR)引物(武漢時勝生物公司)。

1.3細胞分組 將Tca8113細胞分為NC組、miR-34a NC組、miR-34a組,其中NC組不進行任何處理,然后分別將miR-34a模擬物對照物、miR-34a 模擬物染至miR-34a NC組、miR-34a組,轉染完成后24 h進行后續實驗。

1.4逆轉錄(RT)-PCR法檢測細胞中miR-34a及PI3K/AKT相關因子相對表達量 取細胞通過Trizol試劑進行裂解處理,提取細胞總RNA并進行檢測,隨后經逆轉錄試劑盒合成cDNA,逆轉錄反應條件:25 ℃ 10 min,48 ℃ 30 min,95 ℃ 5 min。將逆轉錄合成后的cDNA進行PCR,總反應體積為20 μl,反應條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min,預變性后,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,40個循環。將GAPDH作為內參,相對表達量公式為2-△△Ct。引物序列由武漢時勝生物公司合成。引物序列為:miR-34a:上游5′-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3′,下游5′-CAGTGCGTGTC-GTGGAGT-3′;PI3K上游5′-GCGTGACATGTAGGCTCTCAG-3′,下游5′-CTATACGGCCCGCACTGTAA-3′;AKT上游5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′,下游5′-TT-GTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′;GAPDH上游5′-TCAAGAAGGT-GGTGAAGCAGG-3′,下游5′-TCAAAGGTG-GAGGAGTGGGT-3′。

1.5MTT法檢測細胞增殖能力 取細胞植于96孔板,同時調整細胞密度為5×107個/ml,隨后將其放入細胞培養箱中培養。分別于轉染后24、48、72 h時取20 μl MTT溶液加入96孔板,4 h后將原有的培養基去除,并加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),使其充分混勻后通過酶標儀在490 nm處檢測每孔的吸光度。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡能力 將細胞植于6孔板并調整細胞密度為1×105個/ml,然后放入細胞培養箱中孵育,經0.25%胰蛋白酶消化后以2 000 r/min的速度離心10 min,去除上清液后通過PBS沖洗。經400 μl結合緩沖液重懸后加入5 ml膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC),充分混勻后置于流式細胞儀進行測定。

1.7劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取細胞植于6孔板并調整細胞密度為1×105個/ml,通過10槍尖在垂直于孔板底部畫直線,然后通過PBS沖洗3次,每次5 min,在室溫下孵育24 h后拍照并對細胞進行計數。

1.8Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 實驗前2 h需將小室濕化處理,2 h后將200 μl細胞懸液置于上室中,并于下室中加入細胞培養液(含10%胎牛血清),然后將Transwell小室置于培養基中孵育。24 h取PBS對小室進行沖洗并放入4%多聚甲醛中浸泡30 min。經結晶紫染色后置于顯微鏡下觀察計數。

1.9Western印跡檢測細胞PI3K/AKT相關蛋白表達 取RIPA裂解液裂解培養細胞并對細胞總蛋白進行提取,然后通過考馬斯亮藍染色法(Bradford)對所提取的總蛋白進行定量。將30 μg蛋白樣品置于各個通道,經SDS-PAGE分離蛋白質并進一步轉至PVDF膜,電轉完成后采用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉處理1 h,加一抗并于4 ℃環境下過夜;加二抗置于室溫下孵育1 h,隨后于曝光儀中曝光處理,經ImageJ分析目標蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表達量,以β-actin作為內參。

1.10統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行SNK-q檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1miR-34a在不同細胞中的表達量比較 miR-34a在Tca8113、OEC-M1、OC3細胞中的表達(0.13±0.01、0.40±0.09、0.22±0.02)較HOK(1.00±0.15)明顯減少(P<0.05)。

2.2轉染后各組細胞miR-34a表達比較 miR-34a組細胞miR-34a表達(8.43±0.59)較NC組(1.00±0.01)明顯升高(P<0.05)。NC組細胞miR-34a表達與miR-34a NC組(1.05±0.01)差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組不同時間點細胞增殖能力比較 在24、48、72 h時,miR-34a組細胞增殖率較NC組明顯減少(P<0.05)。NC組細胞增殖率與miR-34a NC組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4各組細胞凋亡能力比較 miR-34a組細胞凋亡率較NC組明顯增加(P<0.05)。NC組細胞凋亡率與miR-34a NC組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組細胞凋亡能力

2.5各組細胞遷移及侵襲能力比較 miR-34a組細胞遷移及侵襲細胞數均較NC組明顯減少(P<0.05)。NC組遷移及侵襲細胞數與miR-34a NC組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

表1 各組增殖率凋亡率、遷移與侵襲細胞數及PI3K、AKT mRNA表達比較

圖2 各組細胞遷移及侵襲(結晶紫染色,×200)

2.6各組細胞PI3K/AKT通路相關蛋白及mRNA表達 miR-34a組細胞PI3K、AKT mRNA及p-PI3K、p-AKT蛋白表達均較NC組明顯減少(P<0.05)。miR-34a NC組細胞PI3K、AKT mRNA及p-PI3K、p-AKT蛋白表達與NC組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、表2、圖3。

表2 各組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白達表達比較

圖3 各組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達

3 討 論

口腔癌是世界范圍內六大常見惡性腫瘤之一,其可誘發語言、呼吸等功能異常,給患者及家庭帶來沉重的負擔〔8〕。盧怡等〔9〕報道顯示,口腔癌形成與吸煙、飲酒、飲食結構、遺傳等因素有關。目前臨床針對口腔癌的診斷及治療取得了進展,且患者臨床表現得到一定程度改善,然而患者臨床預后并未出現實質性變化,其5年生存率在既往的2～3年中處于不變的情況,生存周期較短〔10,11〕。大量報道顯示,口腔癌形成及進展過程中涉及多基因、多因素相互影響〔12〕,然而關于其具體作用機制還未完全揭示,故揭示口腔癌形成及進展機制對口腔癌臨床診斷及治療尤為重要。近年來miRNAs成為腫瘤研究領域關注的熱點及重點,有報道顯示miRNAs在腫瘤形成及演變相關環節中扮演促癌因子或抑癌因子的角色,其可通過上調或下調靶基因表達進而參與腫瘤形成及進展過程〔13〕。miR-34a在低等生物至人類機體中均存在表達,其主要受腫瘤抑制基因p53控制,其已被證實在多類型實體瘤中表達量明顯下調,可參與調控胃癌、肝癌細胞等生物學行為〔7,14〕。郝小軍等〔7〕采用慢病毒轉染的方式建立miR-34a過表達結腸癌細胞系,發現miR-34a可通過抑制上皮-間質轉化進而抑制結腸癌細胞增殖、侵襲及遷移,可為結直腸癌患者臨床治療提供分子靶點。有研究〔15〕結果顯示,miR-34a、miR-127-3p等6種miRNA均可分辨人乳頭狀瘤病毒陽性及陰性患者。但關于miR-34a在口腔癌發生過程中的作用機制研究較少,本研究結果說明,miR-34a可能是作為口腔癌候選腫瘤抑制基因發揮作用。由于miR-34a在Tca8113細胞中表達最低,且相較于其他口腔癌細胞,Tca8113細胞是一種低分化的腫瘤細胞系〔16〕,楊霞等〔17〕報道顯示,腫瘤細胞增殖及凋亡失調在腫瘤形成及演變過程中具有重要作用。Iwamoto等〔18〕表明,口腔癌細胞增殖率較凋亡率明顯增加,故抑制腫瘤細胞增殖并誘導腫瘤細胞凋亡在口腔癌治療過程中作用顯著。本研究結果證實,miR-34a可顯著阻斷口腔癌細胞增殖并誘導細胞凋亡,在阻斷腫瘤細胞增殖及進程中發揮重要作用,這與王康浴等〔19〕報道基本一致。Hong等〔20〕研究顯示,腫瘤細胞侵襲及遷移是導致患者預后不理想的主要原因。尹克等〔21〕證實,80%左右的腫瘤患者癌細胞發生侵襲及遷移,故在臨床治療需降低腫瘤細胞侵襲及遷移。本研究結果說明,miR-34a可顯著抑制口腔癌細胞遷移及侵襲能力。這與單連啟等〔13〕報道基本一致。PI3K/AKT通路是細胞生存的途徑之一,研究證實其在肺癌、肝癌等諸多實體瘤中異常激活〔22,23〕。在生長因子、激素等因素刺激下PI3K通路可被激活,其中AKT是該通路中極為重要的下游分子,當其被激活后可通過磷酸化諸多轉錄因子、酶等進而參與控制細胞增殖、凋亡等生物學行為〔24〕。本研究結果說明,miR-34a可抑制PI3K/AKT信號通路激活進而作用于口腔癌細胞生物學進展。miR-34a在口腔癌細胞中呈低表達,上調其表達可抑制口腔癌細胞增殖、侵襲及遷移能力并促進口腔癌細胞凋亡,其作用機制可能是通過抑制PI3K/AKT通路實現的。