基于鐵死亡機制探究橘皮素對白內障模型大鼠眼晶狀體的保護作用

張建成 李萍 胡海慈 呂自新 陳文生

(1南陽市第一人民醫院眼科,河南 南陽 473000;2南陽市第二人民醫院眼科)

白內障是導致失明的眼部疾病重要原因之一,其發病率與年齡密切相關,伴隨年齡增長,其發病率呈上升態勢〔1〕。目前,有關白內障治療方法主要是通過手術摘除晶狀體后采用人工晶狀體替換,但是此方法容易導致角膜水腫和高眼壓等副作用〔2〕。因此,積極尋找白內障有效的治療方案及藥物對于改善白內障患者臨床癥狀具有重大意義。

白內障的主要病因與晶狀體氧化應激〔3〕、炎癥損傷〔4〕及細胞死亡〔5〕等相關。研究發現,鐵死亡參與白內障的形成。鐵死亡是一種鐵依賴性細胞程序性細胞死亡方式,是以細胞內鐵離子穩態被打破,進而導致活性氧及脂質過氧化產物增多,從而損害細胞內生物大分子,導致細胞死亡〔6〕。谷胱甘肽過氧物化酶(GPX)4是細胞內脂質過氧化反應的關鍵調節酶,GPX4表達降低會誘發活性氧產生增多,導致細胞脂質過氧化損傷,引起細胞鐵死亡發生〔7〕。既往多項研究發現,白內障發病過程中晶狀體上皮細胞中GPX4蛋白表達水平顯著降低,細胞內氧化應激水平顯著增加,且白內障患者鐵過載可導致白內障形成加快〔8,9〕。因此闡明鐵死亡與晶狀體損傷的關系可以為白內障預防提供新的思路。橘皮素(TAN)是柑橘類果皮中最豐富的多甲氧基黃酮之一,具有廣泛的藥理活性。多項研究表明,TAN具有抗炎、抗氧化、調節代謝及神經保護等藥理作用〔10,11〕。但有關TAN對白內障形成的影響尚不清楚。本研究基于鐵死亡機制探究TAN對D-半乳糖誘導白內障模型大鼠晶狀體的保護作用。

1 材料與方法

1.1動物 雄性SPF級Wistar大鼠60只,周齡6～8 w,平均體質量(200±10)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔SCXK(京)2020-0015〕,飼養于環境溫度24～26 ℃,相對濕度(60±5)%,12 h晝夜交替光照。本實驗經過醫院醫學倫理委員會審批(審查號:2021LLSC0003)。

1.2試劑 TAN(化合物純度≥99.7%,Target Molecule公司);D-半乳糖(純度≥99%,浙江一新制藥股份有限公司);鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1,Med Chem Express公司,貨號:HY-100579/CS-0019733);戊巴比妥鈉(德國Merck公司,貨號:4390-16-3);Fe2+檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號:20220014);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A001-3-2、A005-1-2、A003-1-2);轉鐵蛋白受體(TFR)1一抗、溶質載體家族7成員(SLC7A)11、GPX4一抗(碧云天生物技術,貨號:AF8136、AF7992、AF7020)。

1.3儀器 裂隙燈顯微鏡(上海涵飛醫療器械有限公司,型號:YZ5G);酶標儀(山東萊恩德智能科技有限公司,型號:LD-96A);離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司,型號:H-2050R-1);凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司,型號:Gel dox XR+);熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus,型號:CKX53)。

1.4白內障模型大鼠構建、分組及給藥 依據參考文獻〔1〕復制D-半乳糖誘導的白內障大鼠模型。50只Wistar大鼠適應性喂養1 w,隨機選取40只大鼠于皮下注射D-半乳糖(200 mg/kg),1次/d。另取10只大鼠為對照(control)組,給予等量生理鹽水,其余操作相同。4 w后,在裂隙燈照射下觀察大鼠晶狀體渾濁程度,若晶狀體出現渾濁則判定模型構建成功。將模型成功大鼠隨機分為模型(model)組、TAN低劑量(TAN-L)組、TAN高劑量(TAN-H)組及鐵死亡抑制劑(Ferrostatin-1)組各10只。TAN-L、H組分別以5、20 mg/kg的TAN灌胃給藥〔12〕,1次/d。Ferrostatin-1組腹腔注射2 mg/kg Ferrostatin-1〔13〕,1次/d。Control組和model組腹腔注射等量生理鹽水,1次/d。以上各組均連續給藥4 w。

1.5白內障形成評估 給藥干預4 w后,1%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用0.5%托吡卡胺和2.5%鹽酸去氧腎上腺素混合滴眼液加入各組大鼠眼球進行散瞳,觀察白內障形成及晶狀體渾濁程度。

1.6組織病理學染色 將各組左眼晶狀體組織磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后放置于4%的多聚甲醛溶液中固定,經梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚度約3 μm),之后進行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組織病理學變化。

1.7晶狀體渾濁程度評估 實驗結束后,1%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠,采用0.5%托吡卡胺和2.5%鹽酸去氧腎上腺素混合滴眼液加入各組眼球進行散瞳,裂隙燈顯微鏡下觀察晶狀體渾濁程度。渾濁程度等級:0、1、2、3、4,等級越高表示晶狀體渾濁程度越高。

1.8可溶性、不可溶性蛋白含量測定 依據參考文獻〔14〕檢測方法,采用蛋白質檢測試劑盒對各組晶狀體中可溶性蛋白和不可溶性蛋白含量進行測定。

1.9Fe2+、MDA含量及SOD、GSH-Px活性測定 依據檢測試劑盒說明書,分別對各組大鼠晶狀體中Fe2+、MDA含量及SOD、GSH-Px活性進行測定。

1.10Western印跡檢測晶狀體中TFR1、SLC7A11和GPX4蛋白表達 將晶狀體組織勻漿裂解,離心后得到上清液,測定蛋白質濃度。之后按照每組蛋白上樣量為30 μg,計算各自的上樣體積;凝膠電泳約120 min,之后進行濕轉轉膜將目的蛋白從凝膠上轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%的脫脂牛奶進行封閉非特異性抗體,洗膜,每次3 min,共5次;4 ℃條件下,孵育對應一抗抗體(TFR1、SLC7A11、GPX4、β-actin,稀釋比例為1∶1 000)16 h;磷酸鹽緩沖溶液洗滌PVDF膜3次,每次5 min;室溫條件下,孵育一抗抗體對應的二抗1 h;去除二抗,滴加顯影液顯影,最后對顯影照片采用Image Pro Plus6.0軟件進行蛋白相對表達定量。

1.11統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1TAN對白內障大鼠形成的形態學影響 control組晶狀體結構清晰,清澈透明;model組晶狀體出現典型的白內障,且晶狀體渾濁程度等級顯著增加,透明度明顯降低。與model組相比,TAN-L、TAN-H、Ferrostatin-1組白內障嚴重程度明顯減輕,且晶狀體渾濁程度等級降低,透明度明顯增加。與TAN-L組相比,TAN-H組白內障改善程度更為顯著。見圖1。

圖1 TAN對D-半乳糖誘導大鼠白內障形成的影響

2.2TAN對白內障大鼠晶狀體組織病理學的影響 control組晶狀體組織結構完整,上皮細胞排列有序,無空泡。model組晶狀體組織結構損壞嚴重,上皮細胞數目明顯減少,排列紊亂,且晶狀體后極出現大量空泡。與model組相比,TAN-L、TAN-H、Ferrostatin-1組晶狀體病理性損傷得到明顯改善,僅TAN-L組晶狀體纖維化有輕微腫脹。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體組織損傷程度進一步減輕。見圖2。

圖2 各組晶狀體組織病理學(HE染色,×200)

2.3TAN對白內障大鼠晶狀體組織渾濁程度的影響 與control組相比,model組晶狀體渾濁程度明顯增加(P<0.05)。與model組相比,TAN-L、TAN-H和Ferrostatin-1組晶狀體渾濁程度均明顯降低(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體渾濁程度明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.4TAN對白內障大鼠晶狀體可溶性和不可溶性蛋白含量的影響 與control組相比,model組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯增加,可溶性蛋白含量明顯降低(P<0.05)。與model組相比,TAN-L、TAN-H和Ferrostatin-1組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯降低,可溶性蛋白含量明顯增加(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組晶狀體不可溶性蛋白含量明顯降低,可溶性蛋白含量明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組晶狀體渾濁程度及可溶性、不可溶性蛋白含量比較

2.5TAN對白內障大鼠氧化應激及Fe2+水平的影響 與control組相比,model組Fe2+、MDA水平明顯升高,SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)。與model組相比,各干預組Fe2+、MDA水平明顯降低,SOD、GSH-Px活性明顯增強(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組上述指標明顯改善(P<0.05)。見表2。

2.6TAN對白內障大鼠提死亡相關蛋白表達的影響 與control組相比,model組TFR1蛋白表達明顯升高,SLC7A11、GPX4蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與model組相比,各干預組TFR1蛋白表達明顯降低,SLC7A11、GPX4蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與TAN-L組相比,TAN-H組上述蛋白表達明顯改善(P<0.05)。見表2、圖3。

表2 各組晶狀體中Fe2+、MDA含量和SOD、GSH-Px活性及TFR1、SLC7A11、GPX4蛋白相對表達比較

1～5:control組、model組、TAN-L組、TAN-H組、Ferrostatin-1組

3 討 論

白內障是誘發失明的主要原因之一,與晶狀體的氧化應激性損傷相關,主要表現為晶狀體渾濁、視力障礙及光散射等。研究發現,全球范圍內大約40%的失明患者是由白內障引起,且多發于老年人群,而氧化應激狀態是導致白內障患者晶狀體嚴重受損的重要機制〔15〕。因此,深入探究白內障晶狀體損傷的病變機制并對其防治具有重要意義。本研究表明,白內障大鼠模型構建成功。TAN是從果實橘皮中提取得到的一種天然活性單體化合物,具有廣泛的藥理學作用〔16〕。

鐵死亡是白內障晶狀體損傷的新機制,主要是由于細胞內抗氧化系統的失衡,導致谷胱甘肽(GSH)合成不足及GPX4失活引發細胞脂質過氧化物代謝受阻〔17〕。在此基礎上,細胞內不穩定鐵池儲存的大量Fe2+會釋放至細胞內,并通過芬頓(Fenton)反應產生大量活性氧,促進脂質過氧化物產生增多,最終細胞膜機構改變,誘發細胞死亡〔18〕。本研究結果表明,TAN能夠通過降低Fe2+水平,改善白內障大鼠晶狀體損傷。鐵死亡也被認為是一種氧化應激性損傷,MDA是紙質過氧化產物,氧化應激后受自由基影響而顯著升高,其含量高低是反映細胞氧化應激損傷的關鍵指標〔19〕。SOD、GSH-Px是抗氧化性損傷關鍵調節酶〔20〕。既往研究證實,TFR1、SLC7A11和GPX4被認為是細胞鐵死亡的關鍵調控蛋白。TFR1能夠通過將細胞外Fe2+轉運至細胞內,導致細胞鐵超載,進而誘發Fenton反應,導致細胞發生脂質過氧化反應,誘導細胞死亡〔21〕。SLC7A11通過介導胱氨酸/谷氨酸轉運系統合成GSH所需胱氨酸,而抑制SLC7A11表達后會顯著抑制GSH生物合成,進而導致GPX4蛋白表達下調,抗氧化能力減低,并最終導致鐵死亡發生〔22〕。多項研究已證實,鐵死亡參與白內障形成,被認為是晶狀體損傷的重要病理機制〔23,24〕。本研究結果表明,TAN能夠通過抑制細胞鐵死亡,進而減輕白內障大鼠晶狀體損傷。Liu等〔25〕研究發現,脂多糖能夠誘導人支氣管上皮細胞鐵死亡,給予鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1處理后能夠逆轉脂多糖誘導的人支氣管上皮細胞鐵死亡。本研究結果表明,鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1能夠抑制白內障大鼠上述指標變化,改善晶狀體損傷,從而發揮與TAN同向的保護效應。

綜上,TAN能夠改善白內障大鼠模型晶狀體損傷,其機制與抑制細胞鐵死亡相關。但本研究也存在一定的局限性,未在細胞層面上揭示TAN對晶狀體損傷的影響。后續將通過體外培養晶狀體上皮細胞,揭示TAN對氧化應激誘導晶狀體上皮細胞鐵死亡的影響。