轉錄因子HNF1α基因c.493T>C位點突變對其蛋白質水平的影響

梁淑杰，彭乙華，雷佳紅，賈艾敏，蔣紅，蔡燕1,,,5

研究快報

轉錄因子基因c.493T>C位點突變對其蛋白質水平的影響

梁淑杰4，彭乙華2，雷佳紅3，賈艾敏3，蔣紅3，蔡燕1,3,4,5

1. 川北醫學院附屬醫院遺傳與產前診斷中心，南充 637000 2. 川北醫學院附屬醫院內分泌科，南充 637000 3. 川北醫學院附屬醫院風濕免疫研究所，南充 637000 4. 川北醫學院檢驗醫學院，南充 637000 5. 川北醫學院轉化醫學研究中心，南充 637000

肝細胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α，HNF1α)作為一種轉錄因子在維持胰腺β細胞功能、肝臟脂質代謝等過程中發揮著重要的調控作用。該基因突變是導致青少年起病的成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)3型的致病原因，目前已報道的該基因的突變位點眾多，如P291fsinsC、P112L等常見的突變位點，但其具體的分子機制尚不清楚。本研究對前期工作中發現的1例攜帶有基因c.493T>C位點突變的MODY3患者，通過應用Mutation Surveyor軟件分析突變位點的致病性，構建野生型和突變型真核表達質粒，采用Western blot檢測兩種質粒表達的HNF1α蛋白質的量和穩定性變化，結果發現Mutation Surveyor軟件分析提示c.493T>C位點突變可能為致病性變異基因，Western blot顯示突變型真核質粒表達的HNF1α蛋白質的量和穩定性均明顯降低，差異均具有統計學意義(<0.05)。上述結果表明c.493T>C (p.Trp165Arg)變異顯著影響HNF1α的表達量及穩定性，可能為其導致疾病發生的原因，為后續深入探究MODY3的分子致病機制提供了新的方向。

MODY；HNF1α；基因突變

青少年起病的成人型糖尿病(maturity onset diabetes of the young，MODY)是一種以β細胞功能障礙和非胰島素依賴為特征的單基因糖尿病，常被誤診為1型和2型糖尿病，具有常染色體顯性遺傳、發病年齡早于25歲等臨床特點[1]。MODY的發病率約占糖尿病病例的1%～5%，約占兒童糖尿病的1%～6%[2]。其中肝細胞核因子1α (hepatocyte nuclear factor 1α，)突變導致的MODY3型是最常見的類型[3]。HNF1α是轉錄因子家族中的一員，在肝、胰腺、胃腸、腎中高表達，是一種以同源或異源二聚體形式發揮功能的轉錄調節因子，可以調控肝臟多種特異性蛋白的表達，影響肝臟中葡萄糖、蛋白質及脂質的代謝[3,4]。Shih等[5]研究也發現，HNF1α缺失導致了胰島發育與代謝相關基因的異常，最終小鼠因胰島素分泌功能受損而發展成了糖尿病，表明HNF1α是維持胰腺β細胞功能的重要轉錄因子。

隨著基因測序技術的普及，基因新突變位點的發現不斷增多，目前報道基因突變以錯義、移碼、剪接突變、啟動子區突變、缺失等形式多見[6]，仍有大量突變尚未明確其致病性，因此需要進一步的研究工作來解釋突變位點的確切功能。本課題組在前期工作中發現了1例攜帶有基因c.493T>C位點突變的MODY3患者，家族中多人具有早發型糖尿病表現。本研究通過生物信息學分析、基因表達載體構建、Western blot檢測等方法，探討了該位點突變對HNF1α蛋白表達水平的影響，以期解釋該突變的可能致病性機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、菌株和質粒

HepG2細胞、293T細胞由川北醫學院風濕免疫研究所保存，大腸桿菌DH5α、載體質粒pcDNA3.1-HR-Flag-H由川北醫學院雷佳紅博士提供。

1.1.2 培養基

DMEM高糖培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，LB培養基購自英國OXOID公司。

1.1.3 主要試劑

RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、無縫克隆試劑盒、高保真DNA聚合酶購自南京諾維贊生物有限公司，膠回收試劑盒購自北京擎科生物科技股份有限公司，I酶購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)，無內毒素質粒小提中量試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司，轉染試劑Lipo2000購自北京聚合美生物科技有限公司，SDS-PAGE凝膠試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，兔抗人HNF1購自英國Abcam公司，β-actin購自杭州華安生物技術有限公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購自北京中山金橋公司，環己酰亞胺購自美國AbMole公司。ECL超敏型試劑盒購自合肥白鯊生物科技有限公司，引物合成和序列測定均由浙江有康生物科技有限公司完成。

1.2 生物信息學Mutation Surveyor軟件分析突變位點的致病性

從NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載基因的mRNA序列，找到突變位點及其上下游的堿基序列，截取包含突變位點在內約10個堿基輸入到生物信息學軟件Mutation Surveyor在線分析網站(http://www.mutationtaster.org/)進行功能預測。

1.3 構建突變型和野生型HNF1α真核表達載體

1.3.1 構建pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α野生型真核表達質粒載體

培養HNF1α高表達的HepG2細胞提取總RNA，并進行逆轉錄，以逆轉錄產物為模板，PCR擴增基因編碼區全長。上游引物：5′-CCCAA GCTTATGGTTTCTAAACTGAGCCAGC-3′，下游引物：5′-CGGAATTCTTACTGGGAGGAAGAGGCCATCT-3′。產物大小為1903bp。膠回收PCR產物，通過I酶進行酶切消化去除質粒模板DNA，采用無縫克隆試劑盒與線性化的pcDNA3.1-HR-Flag-H載體連接，將重組載體轉化DH5α感受態細胞。挑取單克隆進行菌落鑒定，將陽性的重組質粒送公司進行測序鑒定。

1.3.2 構建pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α突變型真核表達質粒載體

設計定點突變引物，上游引物：5′-GTACACC TGGTACGTCCGCAAGCAGCGAGAGGTGGCGC-3′，下游引物：5′-CGGACGTACCAGGTGTACAGGGCG GCCCGCTTCTGC-3′。以野生型真核表達載體為模板進行PCR擴增，膠回收PCR產物，同樣通過I酶進行酶切消化，取酶切后產物轉化DH5α感受態細胞。挑取單克隆進行菌落鑒定，將陽性的重組質粒送公司進行測序鑒定。

1.4 Western blot檢測c.493T>C位點突變對HNF1α蛋白表達的影響

選取內源性低表達HNF1α的293T細胞作為研究對象，培養條件：DMEM高糖培養基，添加10%胎牛血清，在濕度培養箱中保持37℃和5%CO2的恒定條件進行培養。分別提取野生型和W165R突變重組質粒備用。轉染前一天，將細胞以每孔20萬個細胞的密度接種在6孔板中。用Lip2000分別轉染野生型和突變型的真核表達質粒，每孔轉染4μg重組DNA和10μL Lip2000。

1.4.1 Western blot檢測HNF1α蛋白表達量的變化

收集轉染后24 h及1～4天的兩組細胞提取總蛋白，用BCA蛋白測定法進行蛋白定量。10%SDS- PAGE電泳，每孔蛋白上樣量為30μg。電泳完畢后，濕轉膜250mA，2 h。PVDF膜室溫封閉2h，抗人HNF1α重組單克隆抗體(1∶3000) 4℃搖床孵育過夜，PBST洗膜，辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗室溫孵育1.5h，采用全自動凝膠成像系統進行顯影，使用Image J.JS對條帶進行歸一量化。內參采用β-actin (1∶3000)。

1.4.2 Western blot檢測HNF1α蛋白穩定性的變化

步驟同前，293T細胞經轉染48 h后，每孔加入50μg/mL環己酰亞胺(Cycloheximide，CHX)于培養基中。CHX是一種真核生物蛋白質合成抑制劑，可以抑制蛋白的生物合成。收集轉染野生型與W165R重組質粒經CHX處理不同時間(0h、4h、8 h、12h)的細胞，并分別提取細胞總蛋白。采用Western blot方法檢測HNF1α蛋白穩定性的變化，步驟同前。對CHX處理不同時間的野生型和W165R突變型條帶進一步歸一化為0h處理的HNF1α條帶。

1.5 數據統計

數據采用平均值±標準差顯示。統計分析使用GraphPad Prism 8.0.1軟件進行了統計分析，采用非配對檢驗，以<0.05確定差異具有統計學意義。

2 結果與討論

研究表明，MODY3型在歐洲、北美洲最常見，但在中國的發病率相對較低，小于1%[7]，目前基因診斷尚未完全普及，關于MODY的報道仍較少，難以統計完整的發病率。自1974年Tattersall等[8]發現以來，如何正確診斷MODY一直是困擾臨床醫生的問題。雖然不同類型的糖尿病具有高度的異質性：2型糖尿病的特征為胰島素抵抗和胰島素相對缺乏，但不存在自身免疫性抗體，是遺傳與環境兩個危險因素的相互作用的結果[9]；1型糖尿病的特征是自身免疫性抗體導致β細胞的破壞，進而導致β細胞的衰竭、胰島素的絕對缺乏，與2型糖尿病相比，其更具有遺傳性[10,11]；而MODY與2型糖尿病最大的不同在于年齡，2型糖尿病一般發生在成年以后，而MODY的發病年齡常早于25歲，還具有非胰島素依賴的伴有常染色體顯性遺傳的家族史，且不存在自身免疫破壞，但其臨床表現又有一定交疊[4]，這極大地阻礙了疾病的正確診斷。

目前已經確定了14種基因突變與MODY相關，其中MODY3、MODY2、MODY1和MODY5約占所有MODY的90%[12,13]。MODY2是由葡萄糖激酶的雜合突變導致，而MODY1和MODY5分別由同為轉錄因子的HNF4α和HNF1β編碼的基因變異引起。雖然MODY3、MODY1與MODY5的臨床表現相似，MODY3與MODY1一樣，其特征是β細胞分泌胰島素的進行性減少。但MODY3患者早期可出現尿糖陽性早于血糖升高表現，與之相比，MODY1一般腎糖閾正常，且尿糖陽性少見，但二者均可服用磺酰脲類藥物控制血糖。而MODY5患者對磺酰脲類藥物常無反應，通常需要胰島素進行治療，可能與其產生胰島素抵抗和高胰島素血癥相關，此外患者腎臟常伴有囊性改變，還可能伴有陰道或子宮畸形與血脂異常[14]。不同亞型的臨床表現存在異質性，這使得糖尿病類型的臨床診斷更加困難。

本研究在臨床工作中發現了基因存在c.493T>C(p.Trp165Arg，W165R)錯義突變，結合文獻并進行生物信息學分析，目前該位點國內尚未見報道，Mutation Surveyor在線分析軟件預測結果顯示基因c.493T>C位點突變可能導致疾病發生(Prediction disease causing: probably deleterious)，其中可能性接近1(pro:0.9999)，提示該突變導致臨床表型的可能較大。為深入研究c.493T>C突變位點的功能，本研究通過同源重組系列實驗，成功構建了突變型和野生型pcDNA3.1-HR-Flag-HNF1α真核表達載體。經測序驗證并與NCBI數據庫中的人序列比對分析，結果顯示序列一致(圖1A)。Western blot蛋白檢測結果表明：(1)與未轉染質粒載體的293T細胞對照組相比，轉染野生型和突變型質粒均成功表達HNF1α蛋白，轉染突變型的蛋白表達量明顯低于轉染野生型的蛋白表達量(<0.05)(圖1，B和C)；(2)隨著轉染時間的延長，野生型與突變型的HNF1α蛋白表達水平的差距逐漸增大，表明蛋白表達水平存在明顯差異，即突變型蛋白表達量明顯低于野生型(圖1，D和E)；(3)與未加入CHX處理的0 h組相比，野生型與突變型表達的HNF1α蛋白均呈現下降的趨勢，但突變型蛋白的半衰期明顯快于野生型蛋白，表明加入CHX處理細胞后，293T細胞表達的突變型HNF1α蛋白的穩定性明顯低于野生型(<0.05)(圖1，F和G)。

根據ClinVar數據庫，已經報道了798個基因突變，其中278個突變被認定為致病性或可能致病性?；蚨ㄎ挥谌旧w12q24.31區域，包含10個外顯子[15]。HNF1α蛋白包括3個功能域：一個N端二聚體結構域(1～32)，一個DNA結合結構域(83～279)和一個C端反轉錄激活結構域(281～ 631)[16]?；蛲蛔兛梢园l生在任何一個結構域，但缺乏突變熱點，其中以第4外顯子(p291fsinsc)的突變最為常見[17]。Vaxillaire等[18]發現，76%與MODY3相關的錯義突變發生在DNA結合結構域。這表明DNA結合結構域比其他結構域對單個氨基酸的改變更敏感。而DNA結合結構域又包括POU特異性結構域(POUs)、POU同源結構域(POUh)以及一個核定位信號，有研究者發現POU結構域在維持蛋白質穩定性方面起著至關重要的作用[19]。

本研究發現的c.493T>C錯義突變，位于DNA結合結構域中的POU亞結構域中，通過軟件分析提示致病性可能大。本實驗結果顯示與野生型的HNF1α蛋白比較，c.493T>C突變后HNF1α蛋白的表達量和穩定性明顯降低。Kind等[16]發現基因POU結構的P112L變異在穩態條件下的表達水平低于野生型蛋白，本研究結果與其相符，W165R突變也會導致HNF1α蛋白的表達減少。

圖1 HNF1α重組質粒測序和Western blot檢測蛋白質表達

A：重組質粒測序結果；B：野生型(wild type)、突變型(W165R)過表達質粒轉染293T細胞的HNF1α蛋白表達情況；C：圖B蛋白條帶對內參進行歸一化處理后的HNF1α蛋白表達差異；D：野生型與突變型過表達質粒轉染293T細胞1～4天后HNF1α蛋白表達情況；E：圖D各時間點蛋白條帶對內參進行歸一化處理后的HNF1α蛋白表達差異；F：野生型與突變型過表達質粒轉染293T細胞24 h后加入CHX 0、4、8、12 h 檢測HNF1α蛋白表達情況；G：圖F各時間點蛋白條帶對0 h條帶進行歸一化處理后的HNF1α表達差異。**：<0.01；***：<0.001。

不同突變位點的臨床表現與功能改變也有所不同。Li等[17]發現突變發生于二聚體結構域與DNA結合結構域的患者的發病年齡較低，而發生截短突變的患者發病年齡小于發生錯義突變的患者；同時發現MODY3患者的基礎胰島素水平和胰島素對高糖刺激的反應也存在差異，患者的空腹血糖或正?；蛎黠@升高；與血糖正常人群相比，MODY3患者的基礎胰島素分泌較低，但高糖刺激后胰島素分泌增加，但程度不盡相同。這種差異可能是不同突變的結果，也提示了對于高糖刺激胰島素分泌可能發揮直接調節作用。研究表明，不僅參與調控胰島素的轉錄，還直接調控參與胰島素分泌的重要基因，如葡萄糖轉運蛋白2和肝細胞核因子4α、丙酮酸激酶[20]。有研究發現[21]基因POU結構的T260M致病性變異會導致靶基因表達減少。與都是轉錄因子調控網絡中的重要組成部分，已被證實具有相互調節的作用，可以激活的表達與轉錄活性，而直接通過蛋白質相互作用下調介導的轉錄激活，還可以減弱自身的表達與激活。具有調控胰島β細胞的功能，從而通過調節等靶基因來調控β細胞的功能和生長。Haque等[22]也證明了DNA結合位點發生突變可能會導致啟動子活性下調干擾其表達，并破壞轉錄網絡，從而影響其下游靶基因的表達，導致β細胞功能障礙進而發展為糖尿病。這些研究進一步強調了基因正常表達的重要性，本課題組也將完成后續功能實驗進行驗證。

綜上所述，本研究探討了c.493T>C位點突變對HNF1α蛋白表達的影響，結果表明c.493T>C變異能明顯影響的表達，提示該變異可能是導致青少年起病的成人型糖尿病發生的原因，為后續深入研究MODY3的分子機制提供了一定的理論基礎。

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Effect of mutation at c.493T>C locus of transcription factorgene on its protein level

Shujie Liang4, Yihua Peng2, Jiahong Lei3, Aimin Jia3, Hong Jiang3, Yan Cai1,3,4,5

Hepatocyte nuclear factor 1α (HNF1α) is a transcription factor that is crucial for the regulation to maintain the function of pancreatic β-cell, hepatic lipid metabolism, and other processes. Mature-onset diabetes of the young type 3 is a monogenic form of diabetes caused bymutations. Although several mutation sites have been reported, the specific mechanisms remain unclear, such hot-spot mutation as the P291fsinsC mutation and the P112L mutation and so on. In preliminary studies, we discovered one MODY3 patient carrying a mutation at the c.493T>C locus of thegene. In this study, we analyzed the pathogenic of the mutation sites by using the Mutation Surveyor software and constructed the eukaryotic expression plasmids of the wild-type and mutant type ofto detect variations in the expression levels and stability of HNF1α protein by using Western blot. The analyses of the Mutation Surveyor software showed that the c.493T>C site mutation may be pathogenic gene and the results of Western blot showed that both the amount and stability of HNF1α protein expressed by the mutation type plasmid were reduced significantly compared to those by the wild type plasmid (<0.05). This study suggests that thec.493T>C (p.Trp165Arg) mutation dramatically impacts HNF1α expression, which might be responsible for the development of the disease and offers fresh perspectives for the following in-depth exploration of MODY3's molecular pathogenic process.

maturity onset diabetes of young; hepatocyte nuclear factor 1α; mutation

2023-11-07;

2024-01-12;

2024-01-18

川北醫學院附屬醫院第一批臨床研究課題(編號：2021LC009)和川北醫學院博士啟動基金項目(自然科學類)(編號：CBY22-QDA28)資助[Supported by the First Batch of Clinical Research Topics of the Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College (No. 2021LC009), and the PhD Launch Fund of North Sichuan Medical College (Natural Science) (No. CBY22-QDA28)]

梁淑杰，碩士研究生，專業方向：基因突變功能研究。E-mail: liangsj16@163.com

蔡燕，主任技師，研究方向：基因突變功能研究。E-mail:caiyandd@163.com

10.16288/j.yczz.23-274

(責任編委: 孟卓賢)