N6-腺苷甲基化修飾及其對LINE-1的調控機制

張傲，岑山，李曉宇

綜 述

N-腺苷甲基化修飾及其對LINE-1的調控機制

張傲，岑山，李曉宇

中國醫學科學院&北京協和醫學院，醫藥生物技術研究所免疫生物學室，北京 100050

長散布元件-1 (long interspersed elements-1，LINE-1)是現今在人類基因組中唯一具有自主轉座能力的轉座子，其轉座會引起細胞基因組結構和功能的改變，是導致多種嚴重疾病的重要因素。在轉座過程中，LINE-1 mRNA是轉座中間體的核心，宿主細胞對其進行相關修飾直接影響轉座。N-腺苷甲基化修飾(m6A)是真核細胞RNA上最豐富且動態可逆的表觀遺傳修飾。目前發現m6A修飾也存在于LINE-1 mRNA上，參與LINE-1整個生命周期的調控，影響其轉座和基因組中LINE-1相鄰基因的表達，進而影響基因組穩定性、細胞自我更新與分化潛能，在人類發育和疾病中具有重要作用。本文介紹了LINE-1 m6A修飾的位置、功能以及相關機制，并總結了LINE-1的m6A修飾對其轉座調控的研究進展，以期為相關疾病發生發展的機制研究和治療提供新的思路。

m6A修飾；逆轉錄轉座子；LINE-1；基因組；基因組穩定性

長散布元件(long interspersed elements，LINE-1)是一種非長末端重復序列(non-long terminal repeats，non-LTR)逆轉錄轉座子。據統計大約45%的人類基因組衍生自轉座子(transposable elements，TEs)，其中LINE-1約占人基因組的17%，是目前人類基因組中唯一證實具有自主轉座活性的轉座子[1,2]。LINE-1以RNA為媒介進行轉座，是一種RNA轉座子[3]，全長約6 kb，其編碼的兩個蛋白ORF1蛋白(ORF1p)和ORF2蛋白(ORF2p)，在細胞質中與LINE-1 mRNA形成核糖核蛋白復合物(ribonu-cleoprotein complexes，RNPs)，后利用ORF2p核酸內切酶及逆轉錄酶活性，以LINE-1 mRNA為模板逆轉錄產生cDNA，形成RNA:DNA雜交體,該過程被稱為“靶點引導逆轉錄過程”(target-site primed reverse transcription，TPRT)[4,5]，是LINE-1復制的關鍵步驟?；蚪M中大多數LINE-1 5′ UTR區缺失或倒置，喪失轉座活性,僅80～100個LINE-1拷貝結構完整，是具有逆轉座活性的LINE-1 (retrotransposition-competent LINE-1s，RC-L1s)。從物種進化上來看，活躍的逆轉錄轉座子在生物進化、物種形成和胚胎發育、記憶形成等方面發揮生理學作用[6,7]，但對個體而言，轉座的發生會對宿主細胞基因組的結構和功能產生嚴重影響，LINE-1在基因組DNA中的插入、缺失和重組，會改變宿主基因的表達，導致衰老、癌癥、基因疾病、代謝性疾病、神經退行性疾病和自身免疫性疾病等多種疾病的發生[8～11]。此外，LINE-1還可以協助不具有自主轉座能力的非LTR轉座子短散布元件(short interspersed elements，SINEs) Alu和加工后的假基因進行轉座，進而誘發疾病[12]。因此宿主對正常體細胞中LINE-1的表達與轉座活性是嚴格控制的，而且這種調控是多層次、多方面的，包括表觀遺傳修飾[13,14]、非編碼小RNA[15,16]以及多種宿主限制因子[17～19]等調控。

除研究較多的DNA、組蛋白甲基化外，N-甲基化腺嘌呤(N-methylated adenine，m6A)陸續在細菌DNA、細菌和酵母的RNA和哺乳動物mRNA中被發現，m6A甲基化對RNA代謝和功能調控具有多樣性[20～23]。隨著對LINE-1轉座調控機制的深入研究，研究者們發現在LINE-1上存在的m6A修飾對其轉座調控也發揮著重要的作用。本文主要介紹m6A修飾的生物學功能，以及該修飾對LINE-1各階段的調控機制和LINE-1周圍染色質狀態、基因表達的影響，以期對m6A修飾的生物學功能研究擴展及宿主對LINE-1調控網絡的探究提供新的思路。

1 m6A修飾的生物學功能

m6A一般發生在RNA中腺苷酸的N位置上，是通過特定的甲基轉移酶進行的甲基化修飾(圖1)，在mRNA和其他類型核內RNA，如轉運RNA (transfer RNA，tRNA)、核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)、小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)均有分布。m6A甲基化具有RRACH共同識別序列(其中R表示A或G，H表示A、C或U)，受多種調控因子調控，通過“編碼器”m6A甲基轉移酶裝配，并可被“讀碼器”m6A結合蛋白識別或被“消碼器”去甲基化酶移除[24,25]。m6A主要在終止密碼子和3′非翻譯區(3′UTR)附近富集，在內含子和5′非翻譯區(5′UTR)也有低豐度的m6A。

m6A甲基化對RNA代謝過程的多個環節均具有重要的影響，包括RNA剪接[26,27]、核輸出[28]、降解[29,30]和翻譯[31,32]。在RNA剪接過程中，m6A被相應蛋白識別并結合，通過招募YTHDC1蛋白、抑制剪接因子或改變RNA局部構象來調節mRNA前體(pre-mRNA)選擇性剪接[26,27]。在核輸出過程中，m6A被YTHDC1蛋白識別，促進RNA與核輸出組分的相互作用，調控mRNA的亞細胞定位[28]。m6A還可以被YTHDF2蛋白識別進而降解m6A修飾的靶轉錄本[29,30]。此外，m6A對mRNA轉錄后調控也具有一定的作用，mRNA的翻譯方式與m6A在轉錄本的位置有關。正常生理條件下，m6A修飾主要位于RNA 的3′UTR區，被YTHDF1蛋白或YTHDF3蛋白識別，招募真核細胞翻譯起始因子eIF3，促進帽依賴性翻譯[31,32]。而在應激條件下，5′UTR區的m6A作為m6A誘導的核糖體進入位點(m6A-induced ribosome engagement site，MIRES)，促進mRNA進行帽非依賴性翻譯，這種m6A介導的帽非依賴性翻譯同樣需要m6A“讀碼器”eIF3的識別[33]。另有研究表明，mRNA上的m6A可影響轉錄本與tRNAs的相互作用進而抑制翻譯[34]。

圖1 腺苷酸甲基化修飾結構示意圖

RNA腺苷酸N位置的甲基化修飾通過m6A甲基轉移酶裝配，被m6A結合蛋白識別或被去甲基化酶移除。

m6A還參與哺乳動物多種病理生理學過程，包括胚胎發育[35]、神經發生[36]、晝夜節律[37]、應激反應[38]、腫瘤發生[24,39]和病毒感染[40]等。隨著m6A甲基化組學分析的發展，m6A在腫瘤發生發展的相關機制研究取得了主要突破。RNA m6A甲基化水平改變影響細胞的增殖、分化與自我更新[41]。m6A是腫瘤代謝的重要調節因子，腫瘤代謝應激反應可導致異常的m6A甲基化，調節代謝重組相關的信號通路、轉錄因子和代謝酶[42]。目前已有多項研究發現，m6A修飾異常與多種癌癥的發生發展相關，不同底物的m6A修飾會促進或抑制腫瘤的發展，具有促癌和抑癌的雙重作用，是一把雙刃劍[24]。機體對LINE-1的調控影響基因組穩定性，含有m6A修飾的LINE-1 mRNA具有宿主逃逸機制，被正向選擇并表達，從而促進疾病的發生發展。研究發現，是口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的原癌基因，其編碼的HNRNPA2B1蛋白可能作為m6A“讀碼器”促進LINE-1 mRNA翻譯，進而通過LINE-1/TGF-β1/Smad2/Slug信號通路靶向上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[43]。這提示m6A修飾的LINE-1可能與多種癌癥致病機制均相關，為癌癥預防及治療提供了新的思路。根據m6A修飾的不同位置，將其分為4個部分：具有轉座活性的LINE-1 5′ UTR、位于宿主基因內含子區域和形成R-環的LINE-1的m6A修飾，以及LINE-1 DNA的6mA修飾(圖2A)。近年來，研究人員發現m6A對LINE-1的整個復制周期均有調控作用，“編碼器”對各階段LINE-1進行m6A修飾，該修飾被“讀碼器”識別，或被“消碼器”移除，影響LINE-1的轉座活性及轉錄與翻譯水平(圖2B)。

2 m6A修飾在LINE-1復制周期不同階段的調控機制

2.1 具有轉座活性的LINE-1 5′ UTR的m6A修飾

最新的一項研究表明，LINE-1轉錄本是人類細胞中主要的m6A修飾RNA。與DNA和一些組蛋白甲基化的抑制作用相反，如組蛋白H3K9me3，RC-L1s的RNA m6A修飾可促進其表達與轉座。m6A偏向于修飾年輕的LINE-1，這些LINE-1結構完整，并具有豐富的RRACH序列。除了帽依賴性翻譯外，m6A還啟動LINE-1 RNA帽非依賴性翻譯。該研究發現，在LINE-1 5′ UTR第333位發生m6A獲得性突變后，形成m6A共識別序列，使得第332位腺苷上發生m6A修飾，eIF3識別該修飾位點后，提高ORF1的翻譯速率，刺激ORF2p合成，產生具有逆轉錄活性的LINE-1 核糖核蛋白RNP，促進LINE-1逆轉錄轉座[44,45]。LINE-1的5′ UTR m6A修飾是其產生逆轉錄轉座功能所必需的，只有具有完整5′ UTR，m6A修飾相關酶才可調控LINE-1的表達[46]。此外，m6A修飾可以改變RNA-蛋白相互作用或RNA二級結構，這可能影響LINE-1 ORF2p的酶活性[45]。目前已發現，m6A甲基化酶METTL3使LINE-1 m6A水平升高，促進其逆轉座[45]。相反，m6A去甲基化酶ALKBH5使LINE-1 m6A水平降低，抑制其逆轉座[45]。m6A甲基化酶METTL14和ZC3H13或其識別蛋白YTHDC1缺失將降低宿主中m6A標記的年輕LINE-1的水平[46]。雖然m6A修飾提高LINE-1 RNA的翻譯效率，但不改變LINE-1 RNA在細胞內定位[45]。此外，m6A僅對年輕LINE-1的表達和逆轉座活性有促進作用，在較老或低甲基化的LINE-1中有抑制作用，當m6A識別蛋白缺陷時，古老的LINE-1轉座活性反而增加[46]。

2.2 基因內含子中無轉座活性的 LINE-1 的m6A修飾

基因組中多數LINE-1 5′ UTR區域缺失或突變，失去逆轉座活性。研究發現，基因內含子中經m6A修飾后的無逆轉座活性的LINE-1 (m6A-marked intronic LINE-1s，MILs)是一種新的調控元件，優先駐留在長基因中，作為轉錄“障礙”阻礙宿主基因的表達，但具體機制尚不清楚[46]。這些長基因在DNA損傷修復(DNA damage repair，DDR)等生理過程中發揮關鍵作用。研究發現，m6A識別蛋白SAFB/SAFB2復合體以m6A增強的方式結合RC-L1s和MILs RNA來抑制其表達[46]。此外，SAFB/SAFB2還可糾正MILs對重要宿主基因的轉錄阻斷作用，以保護宿主基因的轉錄，但SAFB并不與m6A發生特異性結合，可能通過m6A改變局部RNA結構以實現RNA-RBP (RNA結合蛋白)相互作用(即“m6A開關”)，形成的LINE-1 RNA高級結構允許更強的L1-SAFB結合[46]。MILs通過影響長基因轉錄，使m6A調節的L1-宿主相互作用在基因調控、基因組完整性、人類發育和疾病中發揮廣泛作用[46,47]。

圖2 m6A修飾對LINE-1的影響

A：LINE-1的結構。LINE-1由開放閱讀框ORF0、ORF1、ORF2和非編碼區5′UTR、3′UTR構成，5′UTR 有兩個啟動子，是雙向的：正義啟動子活性可轉錄 ORF1、ORF2，反義啟動子(ASP)能夠啟動與LINE-1方向相反的轉錄物轉錄。B：m6A修飾酶影響LINE-1復制周期模式圖。①LINE-1 DNA可能富集6mA甲基化修飾，抑制mRNA轉錄；②LINE-1 mRNA與ORF1p、ORF2p結合生成LINE-1 RNP復合物，入核后進行“TPRT”生成cDNA，插入宿主基因組；③在細胞質中，翻譯起始因子eIF3與m6A特異性相互作用，提高翻譯水平；④METTL3、YTHDC1促進LINE-1逆轉座，ALKBH5、SAFB/SAFB2抑制LINE-1逆轉座；⑤SAFB/SAFB2可糾正MILs對重要宿主基因的轉錄阻斷。

2.3 LINE-1 RNA:DNA雜交分子(R-環)的m6A修飾

R-環普遍存在于高轉錄基因中，并在重復序列中積累，其中包括逆轉錄轉座子LINE-1[48]。LINE-1逆轉錄轉座過程中，RNP剪切基因組DNA雙鏈，形成由LINE-1 RNA:DNA雜交分子和未配對單鏈DNA組成的R-環，R環在細胞分裂S期達到頂峰，參與了從轉錄調控到DNA修復等諸多重要生物學過程[49]。Abakir等[50]發現，在人多能性干細胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)RNA:DNA雜交體中有大量m6A修飾，m6A修飾存在于RNA:DNA雜交體的RNA鏈上，含有m6A的R環在細胞周期G2/M期積累，在G0/G1期耗盡。在正常生理條件下，R-環在基因啟動子區和終止區富集，參與mRNA轉錄起始和終止，調控基因表達。當R-環沒有被正常分解時，其積累會導致DNA損傷和/或復制叉停滯，破壞基因組的穩定性[51～53]。m6A修飾可調控R環的積累，不同的m6A結合蛋白識別R環，維持基因組的穩定性。目前已發現甲基轉移酶METTL3、識別蛋白HNRNPA2B1、促進mRNA翻譯的YTHDF1以及促進mRNA降解的YTHDF2均與富集R環的位點相互作用[50]。已有研究表明，YTHDF2可阻止含有m6A的LINE-1 RNA:DNA雜交體積累，有助于修復哺乳動物中R-環依賴性DNA損傷，維護基因組穩定性[50]。

2.4 LINE-1 DNA的6mA修飾

DNAN-甲基化腺嘌呤(6mA)修飾在原核生物中廣泛分布，而在哺乳動物細胞中豐度極低[54,55]。早期研究人員利用SMRT-ChIP在小鼠胚胎干細胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)中發現6mA修飾，證明6mA修飾與LINE-1轉座子的進化年齡呈負相關，在年輕、完整的LINE-1元件中強烈富集。與LINE-1 RNA的m6A甲基化沉積位置相似，6mA大多數富集在年輕全長LINE-1的5′ UTR和ORF1上。在6mA去甲基化酶ALKBH1缺陷的細胞中，DNA 6mA水平增加導致轉錄沉默。6mA修飾與LINE-1轉座子及其鄰近增強子和基因的表觀遺傳沉默相關，在胚胎干細胞分化過程中抵抗基因激活信號[56]。與其他常染色體相比，較年輕的全長LINE-1在X染色體上強烈富集，經6mA修飾后沉默位于X染色體上的基因[56,57]。不同于6mA在其他生物基因中的激活作用，它在哺乳動物進化中表現出表觀遺傳沉默的新作用。然而，該研究結果存在很大爭議，其他研究者對真核生物中DNA 6mA的存在表示懷疑，認為已有方法受污染源的影響容易產生假陽性結果。故作者使用6mASCOPE方法對6mA定量去卷積，結果排除非特異性偏倚后，不支持HEK293中年輕LINE-1具有6mA富集特點[54]。但這項研究仍存在局限性，需要進一步優化檢測方法。

3 LINE-1的m6A修飾對染色質狀態和基因表達的調控

LINE-1上修飾的m6A不僅調控其自身的復制過程，對其相鄰基因的表觀遺傳調控、塑造基因組結構和維持基因組穩定性方面也具有廣泛的作用。染色體相關調控RNA (chromat-in-associated regulatory RNAs，carRNAs)上的m6A修飾可以全局調控染色質狀態和轉錄，依賴于METTL3甲基化的carRNAs包括啟動子相關RNA、增強子RNA和重復序列RNA(如LINE-1)。carRNAs m6A修飾可以維持基因間區域染色質濃縮，而YTHDC1識別m6A后，通過核外泌體靶向(nuclear exosome targeting，NEXT)復合物促進carRNAs降解。m6A甲基化缺失導致染色質開放和轉錄本富集，這與活性組蛋白H3K4me3和H3K27ac修飾增加相關，后續招募表觀遺傳因子如組蛋白乙酰轉移酶(EP-300)來維持開放的染色質構象和下游轉錄。此外，carRNAs中“重復序列RNA”在m6A高甲基化和轉錄下調之間表現出強相關性，其中LINE-1受影響最大，影響細胞自我更新和分化潛能[58～60]。

另有研究發現，識別蛋白YTHDC1通過多種機制參與逆轉錄轉座子的調控和染色質修飾。在mESCs中，YTHDC1與m6A修飾的LINE-1轉錄本結合，募集組蛋白甲基轉移酶SETDB1、TRIM28和核仁素(nucleolin，NCL)，共同形成沉默復合物，促進H3K9me3的富集，沉默逆轉錄轉座子[59,60]。此外，YTHDC1識別細胞核中LINE-1 RNA上的m6A，招募轉錄調控因子KAP1，并調控LINE1-NCL復合物的形成和KAP1在染色質上的募集，形成LINE1-NCL-KAP1復合物，抑制2細胞期(two-cell stage，2C)胚胎特異性轉錄的主要激活因子Dux，關閉2C基因表達程序。同時，LINE1-NCL-KAP1復合物可與核糖體DNA(rDNA)結合，促進rRNA合成和mESCs自我更新[59,61]。KAP1在LINE-1上的富集同樣也促進H3K9me3沉積，導致在mESCs和內細胞團(ICM)細胞中組蛋白修飾位點的轉錄沉默，降低染色質開放狀態，有助于識別mESCs并促進胚胎發育，調節mESCs從2C樣狀態退出[62]。另一項研究發現，在mESCs中發現肥胖蛋白FTO是LINE-1 m6A去甲基化酶，促進LINE-1相鄰基因位點的染色質開放。FTO與LINE-1 RNA和LINE-1 RNA-DNA相互作用的消失導致染色質濃縮、抑制性組蛋白標記富集，順式調控相鄰基因，降低相鄰基因表達。有趣的是，與YTHDC1作用相反，FTO敲除后，LINE-1 RNA反式調節不相鄰的2C基因，使2C基因去抑制，導致類似2C狀態發生和mESCs狀態丟失，使得多功能性基因的表達減少，細胞分化和自我更新受損，因此FTO-LINE-1軸對于胚胎發育是必不可少的[63,64]。

4 結語與展望

m6A修飾對LINE-1的調控機制目前正在深入研究中，一些問題仍需要進一步探究闡述，如LINE-1 RNA上的m6A被YTHDC1識別后促進抑制性組蛋白富集，抑制基因表達。但另有研究發現，m6A“讀碼器”YTHDC1協同轉錄使組蛋白H3K9me2去甲基化，促進基因表達[65]。多種表觀遺傳信號共同調節基因的表達，故仍需進一步探究LINE-1不同表觀轉錄組修飾間的相互影響，以及與染色質修飾的相互作用關系。此外，LINE-1 DNA 6mA是否具有顯著性富集特點也有待進一步探討。若LINE-1 DNA 上6mA修飾富集且抑制其活性，而LINE-1 RNA m6A修飾促進其轉座，那么兩者是否在發育或疾病中相互干擾，以及如何介導LINE-1活性或宿主基因表達，是未來研究的重要內容。此外，LINE-1 m6A修飾調控組蛋白修飾，阻止染色質開放狀態及相鄰基因的表達。但由不同m6A相關酶介導調控的2C基因表達作用相反，出現這種差異是由于m6A調控相關蛋白具有特異性還是其他調控系統參與其中仍不可知。另外，值得注意的是，m6A對不同的逆轉錄轉座子家族具有截然相反的影響：YTHDC1識別某些TEs上m6A修飾后破壞其穩定性，如IAPs[60]；m6A通過招募YTHDF家族縮短IAP mRNA半衰期[66]。這表明在TEs可能發生了額外的依賴于m6A的調控，如依賴于其他m6A甲基轉移酶(METTL5、METTL16和ZCCHC4)或識別結合蛋白的活性，這些蛋白可以通過翻譯后修飾或與其他分子相互作用進行調控[60]。隨著高通量測序等新技術的發展，研究人員對m6A的研究有望發現新的生物調節系統，LINE-1的m6A修飾也有望成為未來疾病治療與診斷的新靶點。

在腫瘤疾病研究方面，LINE-1可作為診斷癌癥的生物標志物和潛在的治療靶點[67]。其中，LINE-1 DNA或組蛋白的大量低甲基化，被認為是大多數惡性轉化的標志，是一種很有前途的癌癥發展的候選生物標志物[8]。而LINE-1雖通常被認為具有促癌功能，但在急性髓系粒細胞白血病(AML)中發揮抑癌作用[68]。這是宿主不同調控機制的作用結果。LINE-1 m6A甲基化修飾研究的突破性進展或許將有助于解開LINE-1相關疾病研究的許多未解之謎。

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N-adenosine methylation and the regulatory mechanism on LINE-1

Ao Zhang, Shan Cen, Xiaoyu Li

Long interspersed elements-1(LINE-1) is the only autonomous transposon in human genome，and its retrotransposition results in change of cellular genome structure and function, leading occurrence of various severe diseases. As a central key intermediated component during life cycle of LINE-1 retrotransposition, the host modification of LINE-1 mRNA affects the LINE-1 transposition directly.N-adenosine methylation(m6A), the most abundant epigenetic modification on eukaryotic RNA, is dynamically reversible. m6A modification is also found on LINE-1 mRNA, and it participants regulation of the whole LINE-1 replication cycle, with affecting LINE-1 retrotransposition as well as its adjacent genes expression, followed by influencing genomic stability, cellular self-renewal, and differentiation potential, which plays important roles in human development and diseases. In this review, we summarize the research progress in LINE-1 m6A modification, including its modification positions, patterns and related mechanisms, hoping to provide a new sight on the mechanism research and treatment of related diseases.

m6A modification; retrotransposon; LINE-1; genome; genome stability

2023-11-10;

2023-12-28;

2024-01-19

國家自然科學基金面上項目(編號：31870164)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31870164)]

張傲，碩士研究生，專業方向：LINE-1與腫瘤維持機制的研究。E-mail: za1632649341@163.com

岑山，博士，研究員，研究方向：病毒學。E-mail: shancen@hotmail.com

李曉宇，博士，研究員，研究方向：病毒學。E-mail: xiaoyulik@hotmail.com

10.16288/j.yczz.23-248

(責任編委: 宋旭)