巨噬細胞DHA代謝表型在非酒精性脂肪性肝炎發病過程中的作用*

潘 勤,薛 芮 綜述,范建高 審校

近20年隨著肥胖、糖尿病、代謝綜合征日益加劇的全球化流行態勢,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的患病率不斷攀高,并已成為包括我國在內的全球第一大慢性肝臟疾病,與當前全球肝病并發癥及死亡人數增加密切相關[1]。NAFLD的疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)及其相關肝纖維化和肝硬化[1, 2]。NAFLD患者的疾病進程和預后主要取決于肝組織病理學表現類型。隨訪NAFL患者10～20年肝硬化發生率僅為0.6%～3.0%,而NASH患者10～15年肝硬化發生率可達15%～25%,NASH患者5 a和10 a生存率分別為67%和59%[1, 2]。因此,NASH處于NAFLD患者肝病進程的關鍵環節,也是臨床防治NAFLD的主要干預群體。如何做好分級管理,做到早發現高危人群,規范地隨訪,合理的檢測和檢查,及時發現可能存在的高脂血癥、高血壓、膽囊結石、代謝綜合征和心腦血管疾病,對改善預后非常重要。

NAFLD的“多重打擊”學說認為,肝臟經歷胰島素抵抗等“初次打擊”后發生NAFL,其對各類損肝因素的敏感性增加,并因肝細胞脂肪變性而為脂質過氧化提供了反應基質;進而在腸源性內毒素、酒精毒性、缺血再灌注損傷等“附加打擊”觸發下,因糖脂毒性和氧化應激相關脂肪性炎癥而進展為NASH[1, 2]。另一方面,臨床研究發現飲食治療和有氧運動等減肥的生活方式干預措施能夠減輕肝內炎癥反應,降低NAFLD活動度積分(NAFLD activity score,NAS)和脂肪變/炎癥活動/肝纖維化評分(steatosis, activity, and fibrosis (SAF) score),延緩甚至逆轉NASH進程[1, 3]。然而,既往針對NASH的基礎和臨床研究往往集中于抑制肝臟炎癥的發生和避免其持續進展,較少關注去除病因或危險因素后NASH的自然消退過程。由此導致NASH相關脂肪性炎癥的發病機制迄今為止仍不甚明了,臨床上NASH的無創診斷和新藥研發至今仍無突破性研究進展。

1 肝臟代謝性炎癥“激活-消退”是受單核巨噬細胞系統調控的主動過程,促炎癥介質/maresin的平衡在其中發揮關鍵作用

眾多研究表明,單核巨噬細胞系統在NASH等代謝性炎癥的發生和進展過程中發揮關鍵作用。脂毒性損傷的肝細胞既可分泌單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等細胞因子,也可通過肌醇需要激酶1α(inosital-requiring enzyme-1, IRE1α)/X-box結合蛋白1(X-box binding protein,XBP-1)/絲氨酸棕櫚酰轉移酶(serine palmitoyl-transferase,SPT)/神經酰胺信號途徑的激活引發促炎外泌體釋放,從而共同募集并誘導單核細胞來源的巨噬細胞,擴大肝臟巨噬細胞池的規模[4-6]。另一方面,脂毒性的肝細胞通過病原體相關分子機制(pathogen associated molecular pattern,PAMP)和危險相關分子機制(danger associated molecular pattern,DAMP)激活肝臟固有巨噬細胞(Kupffer細胞)和單核細胞來源性巨噬細胞的Toll樣受體(toll like receptor, TLR)依賴性先天免疫反應,增強其促炎表型,腫瘤壞死因子α (tumor necrotic factor α, TNF-α)、白細胞介素1α(interleukin 1α, IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18、IL-23等促炎細胞因子釋放增加,并產生一氧化氮、活性氧和活性氮自由基,伴抗原呈遞能力增強等[5,6]。在此基礎上進一步趨化中性粒細胞,促進1型輔助性T細胞(T helper cell 1, Th1)和Th17的免疫應答,最終引起NASH患者特征性的肝小葉內炎癥[6]。但單核巨噬細胞系統對肝臟炎癥消退的影響至今仍存在爭議。

傳統觀點認為,脂質過氧化損傷的肝細胞誘導IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子,抵抗素、瘦素等脂肪因子,以及白三烯(leukotriene,LT)、前列腺素(prostaglandins,PGs)、肝氧蛋白(hepoxilin)、氧化脂質(oxylipin)等花生四烯酸代謝產物產生和釋放增多,由此引發肝內代謝性炎癥及其相關肝纖維化和肝硬化[2,3,7～9]。肝臟炎癥消退則是多種促炎因素減弱、消失,進而降低上述促炎癥介質水平后發生的被動過程,不受機體主動調控。近期多項研究挑戰了上述觀點。

在ω-3 必需脂肪酸-二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)來源的巨噬細胞代謝產物中,已經分離并鑒定出maresin-1、maresin-2、maresin-L1、maresin-L2等一類含多羥和多不飽和共軛雙鍵分子[10,11]。maresin-1通過抑制髓細胞白血病序列-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表達,以caspase依賴方式誘導中性粒細胞凋亡;在清除免疫效應細胞的同時,避免焦亡和細胞外誘捕網形成(NETosis)可能引發的炎癥加劇[10-14]。此外,maresin-1和maresin-2等均可促使巨噬細胞向M2表型極化。在促炎表型消退的基礎上,M2型巨噬細胞由表達炎性細胞因子(IL-1β、IL-6等)和趨化因子(CXCL9、CXCL10等)為主,轉變為表達抑炎細胞因子(IL-10等)和趨化因子(CCL17、CCL18、CCL22、CCL 24等)為主[15,16]。不僅如此,maresin誘導的M2型巨噬細胞還能夠借助胞葬(efferocytosis)功能來清除炎癥部位凋亡的中性粒細胞[12,17]。攜帶胞葬體的巨噬細胞繼而通過遷移作用離開肝臟,向淋巴結、脾臟等淋巴組織歸巢[10,18]。多項研究報道顯示,maresin的作用與抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/核因子κB ( nuclear factor κB,NF-κB) 信號途徑,以及激活脂氧素A4受體(lipoxin A4 receptor,ALXR)/Akt信號途徑等機制有關[19-22]。

因此,肝臟代謝性炎癥的啟動、進展、消退是單核巨噬細胞系統受到促炎癥介質與以maresin為主的特異性促炎癥消退介質平衡調控的一系列主動過程。Maresin多環節激活中性粒細胞凋亡、誘導巨噬細胞向抑炎表型轉化、增強抑炎表型巨噬細胞清除凋亡的中性粒細胞、引導完成免疫細胞清除任務的巨噬細胞向肝外歸巢,從而成為啟動炎癥“程序性消退”階段的關鍵誘導因子。

2 HDAC/12/15-LOX/maresin信號途徑紊亂引起促炎癥介質/maresin失衡,通過阻斷炎癥“程序性消退”誘發NASH

研究發現巨噬細胞表達組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)[23,24],并發揮重要的免疫調節功能。已知組蛋白乙?；饕l生在H3、H4 N端保守的賴氨酸ε氨基位置上,這有利于雙鏈DNA與組蛋白八聚體解離以及核小體結構松弛,從而使不同轉錄因子和協同轉錄因子能與DNA結合位點特異性結合,最終激活基因轉錄。HDAC催化的組蛋白去乙?；瘎t由于形成封閉的染色質構象,降低了轉錄因子的可及性和基因的轉錄活性。編碼脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的ALOX15被證實為HDAC調控的關鍵下游基因[25]。位于活化巨噬細胞膜磷脂雙分子層中的DHA能夠經磷脂酶A2的水解作用釋放入胞,進而通過LOX介導的氧化途徑合成多種maresin等特異性促炎癥消退介質[26]。不同物種ALOX15 基因編碼的 LOX 統稱為12/15-LOX,在以DHA為代表的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)代謝網絡中處于關鍵節點[27,28]。當代謝底物為 DHA時,12/15-LOX可將其催化為14-過氧化氫基二十二碳六烯酸(14S-hydroperoxy-docosa-hexaenoic acid,14S-HpDHA),并進一步環化形成13S, 14S-環氧化物中間體。這個環氧化物一方面可水解產生maresin-1,另一方面則通過可溶性環氧化物水解酶的作用生成maresin-2[10,11,27,28]。在此基礎上,12/15-LOX通過催化maresin合成,能夠實現對炎癥“激活-消退”過程的主動調控。

根據近年來的研究報道,無論高脂高果糖飲食和膽堿蛋氨酸缺乏飲食(methionine/choline deficient diet,MCDD)誘導的NASH模型,還是2型糖尿病合并的NAFLD小鼠肝臟均存在HDAC高表達以及組蛋白低乙?；降奶卣鱗28-30]。與之相應,肝臟巨噬細胞的12/15-LOX和maresin在代謝功能障礙相關的NAFLD患者中往往呈現出表達不足的特征,并與中央靜脈周圍炎癥以及門靜脈和肝竇部位的炎性細胞灶性浸潤伴隨發生[28-31]。一項針對124例NAFLD患者和116例對照人群的橫斷面研究顯示,NAFLD患者血清巨噬細胞來源性maresin-1水平顯著低于對照組,進一步的二分類Logistic回歸證實低水平maresin-1與NAFLD顯著相關。不僅如此,血清maresin-1還與血液AST和ALT水平呈負相關[31]。提示單核巨噬細胞系統的maresin低表達可能破壞了促炎癥介質與maresin之間的動態平衡,導致炎癥自限及消退機制受損,進而在炎癥慢性化的基礎上促進NASH進展。

與之相反,HDCA抑制劑干預、上調12/15-LOX水平、外源補充maresin或其前體等皆具有誘發和加速肝臟炎癥消退過程的作用[10,11,32,33]。采用基于ω-3 PUFA的全腸外營養可以誘導肝臟高表達maresin-1、maresin-2,進而刺激人單核細胞來源性巨噬細胞產生抑炎細胞因子(IL-10),并可避免CD4+T細胞釋放促炎細胞因子[34]。直接給予maresin-1治療,同樣可以抑制肝臟MCP-1和LTB4刺激所致的單核細胞遷移、粘附,減少肝內單核細胞來源的巨噬細胞浸潤數量;抑制活化巨噬細胞介導的先天免疫反應,并誘導其由促炎(M1)表型向抑炎(M2)表型極化[10,11,35]。最終,maresin顯著降低了肝臟髓過氧化物酶、誘導型一氧化氮合酶、環氧合酶2等炎癥標志物,以及血液TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子和轉氨酶的水平[18,19]。此外,借助其促進炎癥消退的作用,maresin-1還能夠改善TGF-β1/Smad2/3誘導的肝星狀細胞上皮-間質轉分化,從而阻斷甚至逆轉NASH引起的肝纖維化[10,11,35,36]。

綜上所述,HDAC/12/15-LOX/maresin是維持促炎癥介質與促炎癥消退介質maresin之間動態平衡的重要信號途徑。其功能紊亂引起的maresin缺乏,通過阻斷肝內炎癥“程序性消退”能夠誘發并加速NASH進展。補充外源性maresin能夠促進肝內炎癥消退,對NASH具有一定的治療作用。但其存在無法預防NASH發生、藥理作用缺乏肝靶向性、體內半衰期較短且血藥濃度較低等缺點。通過干預HDAC/12/15-LOX/maresin信號途徑來重塑單核巨噬細胞系統的DHA代謝表型,重建肝臟促炎癥介質/maresin平衡,則可望借助炎癥“程序性消退”促進NASH的緩解或逆轉。

3 腸菌源性丁酸重塑單核巨噬細胞系統DHA代謝表型,通過促炎癥介質/maresin再平衡,促進炎癥“程序性消退”和NASH的自然緩解

多項最新研究顯示,結腸等部位的益生菌群(擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、真桿菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬等)通過分解膳食纖維素,產生可溶性短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA)等腸菌代謝產物[37]。較之細胞內脂肪酸氧化形成的少量內源性SCFA,腸菌代謝產生的外源性SCFA是體內SCFA的主要來源。SCFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等不多于 6 個碳原子的有機酸,其中丙酸和丁酸豐度相對較高[37,38]。業已發現,腸道內的丁酸主要由酪酸梭菌(ClostridiumButyricum)、普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、羅斯氏菌(Roseburia)、霍式真桿菌(E.hallii)、直腸真桿菌(E.rectale)、丁酸弧菌(Butyrivibrio)等厭氧菌群通過縮合乙?；o酶A形成,并在SCFA中展現出最強的免疫調節活性[39]。真桿菌屬(Eubacterium)、羅斯氏菌、普拉梭菌利用菊粉等果聚糖的代謝產物,也可生成丁酸[40]。上述產丁酸菌群來源的丁酸經腸粘膜吸收入血后,主要通過門靜脈流入肝臟。肝臟因其“首過效應”而成為丁酸作用的關鍵靶器官。

除作為結腸上皮細胞的能量來源、維持上皮粘膜屏障等生物學效應之外,丁酸還被發現具有廣譜的HDAC抑制作用,能夠導致I類(HDAC-1、-2、-3、-8)、II類(HDAC-4、-5、-7、-9)、III類(SIRT 1-7)和IV類(HDAC-11)等絕大多數HDAC失活,并可能下調其表達水平[41-47]。通過廣泛抑制HDAC及其催化的組蛋白H3和H4乙?；?丁酸(鈉)可恢復肝內固有巨噬細胞(Kupffer細胞)和單核細胞來源性巨噬細胞的12/15-LOX表達[26,48]。12/15-LOX水平上調后,在促進DHA生成maresin的基礎上可能進一步誘導肝內炎癥由持續激活轉向主動消退。課題組前期分別采用酪酸梭菌移植和丁酸(鈉)灌胃來治療高脂高膽固醇飲食誘導的NASH模型小鼠。證實兩者在誘發HDAC失活的基礎上,均能夠促使肝內炎性因子的表達模式趨向正常,肝小葉內炎癥程度較NASH模型組顯著減輕,NAS積分明顯下降[49,50]。然而,NASH患者和模型動物結腸及肝內丁酸含量常因腸道菌群紊亂而明顯降低,并可能成為HDAC/12/15-LOX/maresin信號途徑功能紊亂和炎癥“程序性消退”受阻的始動因素[51,52]。

總之,肝臟代謝性炎癥“激活-消退”可能是免疫系統受機體精細調控的主動過程,PUFA代謝產生的以maresin為主的特異性促炎癥消退介質在炎癥消退階段可能發揮關鍵的誘導作用。腸道菌群紊亂所致的丁酸缺乏通過激活肝臟HDAC依賴性組蛋白乙?；?、下調12/15-LOX表達、減少maresin產生,干擾了HDAC/12/15-LOX/Maresin信號途徑,從而可能在促炎癥介質與促炎癥消退介質(maresin)失衡的基礎上,阻斷代謝性炎癥的“程序性消退,“導致NASH的發生和發展。借助腸菌來源性丁酸重塑免疫系統的PUFA代謝表型,可能恢復促炎癥介質與maresin平衡,進而通過促進炎癥“程序性消退”誘導NASH緩解并降低NASH相關肝纖維化、肝硬化和肝癌發病風險。