玻璃化冷凍時間對凍胚移植妊娠結局的影響

屈瀟瀟,哈靈俠,杜玉冬,王金娟

近年來,玻璃化冷凍胚胎移植(FET)技術在輔助生殖過程中的應用越來越普遍。221家生殖中心的ART數據顯示,2019年常規IVF周期全胚冷凍率可達50.68%,ICSI周期全胚冷凍率可達54.09%[1]。然而迄今為止,關于胚胎冷凍時間是否影響凍胚復蘇結局及凍胚移植妊娠結局仍存在較大爭議。有研究表明,隨著冷凍胚胎保存時間的延長,胚胎復蘇率顯著下降[2]。且玻璃冷凍胚胎儲存時間的延長會降低生化妊娠率、臨床妊娠率和活產率[3]。然而也有研究表明玻璃化胚胎的冷凍保存時間并不會影響臨床妊娠結局[4]。由此可見,對不同玻璃化冷凍胚胎的移植時限仍有待進一步研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2020年9月至2022年9月在寧夏醫科大學總醫院生殖醫學中心接受FET的550例患者的資料。根據胚胎的不同玻璃化冷凍時間分為5組,A組239例,玻璃化冷凍時間≤3個月;B組138例,3個月<玻璃化冷凍時間≤6個月; C組74例,6個月<玻璃化冷凍時間≤1年; D組75例,1年<玻璃化冷凍時間≤5年;E組24例,玻璃化冷凍時間>5年。并對所有資料的一般情況、復蘇結局及妊娠結局等進行記錄分析。

1.1.1 納入標準 選取年齡在20～45歲,接受胚胎冷凍并進行凍胚復蘇移植的患者。

1.1.2 排除標準 ①夫妻一方或雙方染色體異常的患者;②患有子宮內膜炎、子宮內膜異位癥等內膜病變的患者;③孕前患有嚴重生殖器官畸形及腫瘤的患者;④合并有嚴重內外科疾病的患者;⑤有不良孕產史的患者。

1.2 胚胎玻璃化冷凍及復蘇方法

1.2.1 玻璃化冷凍過程 冷凍液分為ES和VS,室溫下胚胎先放入 ES冷凍培養基,胚胎皺縮后膨脹,待恢復至最飽滿時迅速轉移至VS培養基中。在1 min內迅速把胚胎取出放在冷凍載桿上,并放入液氮中冷卻。

1.2.2 玻璃化復蘇過程 解凍液分為 TS、DS、WS-1、WS-2。迅速把載桿從液氮中去除,放入TS解凍培養基,待細胞完全皺縮后,依次將胚胎轉移至DS(3 min) 、WS-1(5 min) 、WS-2(5 min)中,待胚胎形態完全恢復,然后將胚胎轉入囊胚培養液中等待移植。

1.3 患者子宮內膜準備 本中心以自然周期及激素替代周期兩種內膜準備方案為主。自然周期是有規律月經周期的患者在月經第11～12 d進行B超監測,評估卵泡和內膜發育情況,于排卵日(自然排卵/HCG扳機后)給予黃體酮(30 mg,每天2次)支持,3～5 d后行胚胎移植。激素代替周期一般是在月經周期或采用藥物行撤退性出血的第2～3 d 起開始口服戊酸雌二醇(4 mg,每天1次),根據B超監測患者子宮內膜生長情況調整劑量,當口服戊酸雌二醇11～12 d、子宮內膜厚度≥7.0 mm時,開始加黃體酮(30 mg,每天2次)轉化內膜,3～5 d 后解凍胚胎行FET。

1.4 胚胎質量的評估 根據Puissant[5]的胚胎等級標準,解凍后胚胎卵裂球數≥50%冷凍前卵裂球數量為存活胚胎;卵裂期胚胎有6～10個細胞2級及以上的為優質胚胎;囊胚分期在4期或以上,外滋養層及內細胞團為B級或A級囊胚。

1.5 各項指標計算公式 胚胎存活率=解凍后存活胚胎/解凍胚胎數×100%;胚胎完好率=解凍后完好胚胎數/解凍胚胎數×100%;解凍后/冷凍前優質胚胎率=解凍后優質胚胎數/冷凍前優質胚胎數×100%;種植率=著床胚胎數/移植胚胎數×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%;活產率=活產周期數/移植周期數×100%;流產率=流產周期數/移植周期數×100%。

2 結果

2.1 不同玻璃化冷凍時間的凍胚移植周期一般情況比較 與胚胎冷凍時間較短的A組相比較,胚胎冷凍時間較長的D組、E組AMH顯著增高(P<0.05)。其余各項指標,各組間差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。

2.2 不同玻璃化冷凍時間胚胎移植的復蘇結局比較 與A、B、C組比較,胚胎冷凍時間較長的D組胚胎存活率及胚胎完好率顯著降低(P<0.05);與A、B組比較,胚胎冷凍時間較長的E組胚胎存活率、胚胎完好率及解凍后/冷凍前優質胚胎率顯著降低(P<0.05);E組較C組胚胎完好率顯著降低(P<0.05);E組較D組解凍后/冷凍前優質胚胎率顯著降低(P<0.05),見表2。

2.3 不同玻璃化冷凍時間移植優質胚胎的妊娠結局比較 在保證至少移植一枚優質胚胎的情況下,各組間的胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率、流產率及早產率均無統計學差異,見表3。

2.4 不同玻璃化冷凍時間移植優質卵裂期胚胎的妊娠結局比較 在移植至少一枚優質卵裂期胚胎時,各組間胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率、流產率差異均無統計學意義。相較于胚胎冷凍時間較短的B組,胚胎冷凍時間較長的E組早產率顯著升高(P<0.05),見表4。

表1 不同玻璃化冷凍時間的凍胚移植周期一般情況比較

表2 不同玻璃化冷凍時間胚胎移植的復蘇結局比較(%)

表3 不同玻璃化冷凍時間移植優質胚胎的妊娠結局比較(%)

表4 不同玻璃化冷凍時間移植優質卵裂期胚胎的妊娠結局比較(%)

2.5 不同玻璃化冷凍時間移植優質囊胚的妊娠結局比較 在移植至少一枚優質囊胚時,各組間胚胎種植率、臨床妊娠率、活產率、流產率差異均無統計學意義。相較于胚胎冷凍時間較短的A組,胚胎冷凍時間較長的C組早產率顯著升高(P<0.05),見表5。

表5 不同玻璃化冷凍時間移植優質囊胚的妊娠結局比較(%)

3 討論

在新鮮胚胎移植周期中,胚胎分裂過快或過慢都因不能與子宮內膜同步發育而無法作為胚胎移植的首選[6]。而冷凍胚胎移植為鮮胚移植失敗或卵巢過度刺激取消移植的人群提供了再次胚胎移植并獲得臨床妊娠的機會,且進行凍胚移植的患者患卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的風險更低[7]。因此,近年來,胚胎冷凍時間對復蘇結局及臨床妊娠結局的影響也更加受到關注。

本研究結果提示,較長的玻璃化冷凍時間會對胚胎復蘇結局產生不利影響。隨著玻璃化冷凍時間的延長,復蘇后的胚胎存活率、胚胎完好率及解凍后/冷凍前優質胚胎率均顯著降低。有文獻指出,長期在液氮中保存會降低胚胎存活率[8]。較長凍存時間組胚胎解凍后的胚胎復蘇率顯著降低(P<0.05),且1～6個月組胚胎復蘇率最高(P<0.05)[2]。胚胎冷凍超過6年的復蘇率低于冷凍3～5年的胚胎(P<0.05)[9]。其原因是胚胎冷凍保存可能會影響基因的穩定性,造成胚胎DNA碎片的增加、線粒體DNA的突變等[10]。在冷凍保存過程中,高滲應激可能導致DNA雙鏈斷裂頻率增加或抑制DNA修復,從而導致染色體畸變[11]。在真核生物中,DNA與組蛋白和非組蛋白染色體蛋白連接形成染色質以確保DNA穩定性,而低溫會改變蛋白質結構,從而影響DNA的穩定性。除了核基因組外,細胞還擁有線粒體DNA。冷凍保存會導致活性氧(ROS)的過度產生[12-13],最終損傷線粒體DNA。除此之外,玻璃化冷凍誘導的應激,包括滲透性休克、溫度和pH值的變化以及冷凍保護劑的毒性,也可能誘導卵母細胞和胚胎的表觀遺傳學和轉錄組學變化[14]。以上因素可能是導致長時間冷凍胚胎的復蘇結局較短時間冷凍胚胎差的原因。另有研究表明,不同卵裂期胚胎復蘇率、胚胎解凍完整存活率均無統計學差異[15]。與本研究結果不同的原因可能在于分組及納入研究的胚胎形態不同。

本研究提示,在移植至少一枚優質凍胚后,各組間胚胎植入率、臨床妊娠率、活產率及流產率均無統計學差異。有研究顯示,玻璃化冷凍卵裂期胚胎的時間對復蘇及妊娠結局沒有顯著影響[16-17]。凍囊胚的胚胎存活率、胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產率、活產率[18]及新生兒結局[19]差異均無統計學意義。Wan[20]等人也認為:胚胎冷凍時間小于60天和大于60天2組的活產率、生化妊娠率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產率、晚期流產率和新生兒畸形率差異均無統計學意義。以上結果與本研究結果一致。但其同時表明不同玻璃化冷凍時間對單胎早產率沒有影響,該結果與本研究不一致,其原因可能是對不同玻璃化冷凍時間分組不一致且納入樣本量較少有關,仍需進一步研究。

綜上所述,相較于短期冷凍胚胎,較長的胚胎冷凍時間對凍胚復蘇結局有不利影響。然而在移植至少一枚優質胚胎后,凍胚移植的臨床妊娠結局并無顯著性差異,但長期冷凍保存的胚胎對后期子代安全性的影響尚未明確。這意味著對凍胚移植來說,臨床醫生擁有了更加自由靈活的移植時限。