炮制對加味拱辰濃縮丸化學成分的影響

張亞柯，張宏偉，張振凌，2*，朱建光，李德華，孫夢梅，趙永琪，王一鳴

（1.河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046； 2.呼吸疾病中醫藥防治省部共建協同創新中心，河南 鄭州 450018）

拱辰丹出自《葉氏錄驗方》［1］，由當歸、山萸肉、鹿茸、麝香組成，而加味拱辰丹是河南保和堂名中醫在其基礎上添加熟地黃、紅參而成，臨床上主要用于早發性卵巢功能不全的治療［2-3］。在拱辰丹傳承過程中，歷代醫家對當歸、山萸肉是否使用炮制品入藥存在不同看法，（1） 當歸，《魏氏家藏方》［4］等以酒當歸入藥，《女科百問》［3］《世醫得效方》［5］等以生當歸入藥，而現代醫家認為，脈絡瘀阻為早發性卵巢功能不全持續存在的病理狀態［6］，酒制后其活血、祛瘀、通經的作用可得到增強［7-8］； （2） 山萸肉，歷代古籍中均以生品入藥，而現代方加味拱辰丹以酒萸肉入藥，于慧等［9］發現，酒萸肉組中環烯醚萜苷等有效成分含量高于生萸肉組中，與山茱萸酒制前后環烯醚萜苷含量變化趨勢不同［10-12］，表明合理配伍可有效提高處方療效。課題組前期將加味拱辰丹開發成濃縮丸以減少服用量、提高依從性，而本實驗考察炮制對該制劑化學成分的影響，以期為其后續開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 VanquishTMFlex 型超高效液相色譜系統、Orbitrap ExplorisTM120 型高分辨率質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）； Waters 2489 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； BT125D 型電子分析天平［十萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］； GZX-9070 MBE 數顯鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）； HH-S6 數顯恒溫水浴鍋 （常州市華普達教學儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 藁本內酯、莫諾苷、綠原酸對照品 （四川省樂美天醫藥有限公司，批號DSTDH000702、DST210508-039、DSTDL002102，純度≥98%）； 馬錢苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111640-201606，純度98.3%）； 阿魏酸、馬錢苷酸、5-羥甲基糠醛對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號 G13S11L124423、M07HB177364、H12M9Z61023，純度≥98%）； 沒食子酸對照品（成都普思生物科技有限公司，批號PS0258-0050，純度98.5%）； 山茱萸新苷對照品 （ 成都埃法生物科技有限公司，批號AF20091301，純度≥98%）。當歸、山萸肉、熟地（批號211103781、210901601、210800199，康美藥業有限公司）； 鹿茸、紅參、麝香（河南省保和堂醫藥有限公司），均經河南中醫藥大學張振凌教授鑒定為正品。甲酸、乙腈、甲醇均為質譜純； 磷酸為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為超純水和飲用水。

2 方法與結果

2.1 炮制品制備

2.1.1 酒當歸 取凈當歸片適量，加入一定量黃酒拌勻，稍悶潤，待酒被吸盡后置于炒制容器中，文火加熱炒至深黃色，取出晾涼，即得（每100 kg當歸片用10 kg 黃酒）。

2.1.2 酒萸肉 取凈山萸肉適量，黃酒拌勻后置于蒸制容器中，隔水蒸透至黑潤，取出，干燥，即得（每100 kg 山萸肉用20 kg 黃酒）。

2.2 濃縮丸制備 根據前期預實驗條件，將當歸、山萸肉、熟地黃粉碎后過4 號篩，加入15 倍量60%乙醇，加熱回流提取2 次，每次1.6 h，合并濾液，濃縮成相對密度為1.35 （60 ℃） 的稠膏；鹿茸、紅參粉碎后過6 號篩，人工麝香研細，與上述稠膏充分混勻，得到軟硬適中的丸塊，制丸，干燥，即得。

2.3 UPLC-MS 成分分析

2.3.1 色譜條件 Shim-pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～2 min，97%B； 2 ～21 min，97% ～75% B； 21 ～30 min，75% ～35% B；30～32 min，35%B）； 體積流量0.3 mL/min； 柱溫30 ℃； 進樣量2 μL。

2.3.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 正負離子掃描； 質量掃描范圍m/z80 ～1 200； 鞘氣體積流量45 arb； 輔助氣體積流量15 arb； 霧化溫度350 ℃； 離子傳輸管溫度320 ℃； 噴霧電壓3.5、-2.5 kV。

2.3.3 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，50%甲醇溶解得貯備液，精密吸取適量，制成分別含莫諾苷13.13 μg/mL、馬錢苷13.43 μg/mL、綠原酸12.37 μg/mL、藁本內酯11.83 μg/mL、馬錢苷酸12.37 μg/mL 的溶液，即得。

2.3.4 供試品溶液制備 將濃縮丸粉碎后精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，精密吸取續濾液1 mL 至10 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，即得。

2.4 化學成分鑒定 在正負離子模式下分別對生品組、炮制品組、酒當歸組、酒萸肉組數據進行采集，結果見圖1。再通過Xcalibur 3 軟件獲取保留時間、準分子離子精確質量數、二級碎片等信息，與已有對照品質譜信息進行比對，并結合相關文獻、PubChem 數據庫進行定性分析。結果，共鑒定出97 個化合物，包括環烯醚萜類、有機酸類、皂苷類、苯肽類、核苷類、氨基酸類等主要結構，具體見表1。

表1 加味拱辰濃縮丸化學成分鑒定結果Tab.1 Results for chemical constituent identification of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

圖1 加味拱辰濃縮丸BPI 圖Fig.1 BPI profiles of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.5 化學模式識別

2.5.1 主成分分析（PCA） 采用SIMCA 14.1軟件對各組質譜數據進行無監督模式的PCA 分析，結果見圖2。由此可知，各組組內聚合度良好，組間區分為4 類，表明加入不同炮制品后化學成分存在明顯差異。

圖2 加味拱辰濃縮丸PCA 得分圖Fig.2 PCA score plot for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.5.2 正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）在PCA 分析基礎上采用有監督模式的OPLS-DA 分析，發現所構建5 個模型的R2X、R2Y、Q2均大于0.9，表明模型具有良好的預測能力和擬合度，再對各組數據進行200 次置換檢驗，發現交叉驗證后模型截距均低于原始模型截距，R2擬合直線在Y軸的截距均小于0.3，Q2擬合直線在Y軸的截距均為負數，表明模型未存在過度擬合現象，預測能力良好，見圖3。

圖3 加味拱辰濃縮丸OPLS-DA 得分圖與驗證模型Fig.3 OPLS-DA score plots and verification models for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

然后，以VIP＞1、P＜0.05 為標準對兩兩組別之間進行差異成分篩選，結果見圖4、表2。由此可知，生品組和炮制品組中26 種差異成分具有統計學意義，酒萸肉組和生品組中27 種差異成分具有統計學意義，酒當歸組和生品組中21 種差異成分具有統計學意義，炮制品組和酒當歸組中25 種差異成分具有統計學意義，炮制品組和酒萸肉組中22 種差異成分具有統計學意義； 生品組和炮制品組、酒當歸組和炮制品組、生品組和酒萸肉組中差異成分重合度高，數量相近，炮制品組和酒萸肉組、生品組和酒當歸組中差異成分數量減少，重合度降低，表明生品組和酒當歸組相似度較高，炮制品組和酒萸肉組相似度較高。

表2 加味拱辰濃縮丸差異成分Tab.2 Differential constituents of Supplemented Gongchen Concentrated Pills

圖4 加味拱辰濃縮丸S-plot 散點圖Fig.4 S-plot scatter plots for Supplemented Gongchen Concentrated Pills

2.6 差異成分含量測定 在定性分析基礎上結合文獻［11，12，34-35］ 報道，綜合考慮含量、藥理活性、紫外吸收情況，選擇莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、沒食子酸、阿魏酸、綠原酸、馬錢苷酸、藁本內酯、5-羥甲基糠醛進行含量測定。

2.6.1 色譜條件 SymmetryShieldTMRP18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.5%磷酸（B），梯度洗脫（0～25 min，4% ～14%A；25 ～50 min，14% ～23% A； 50 ～60 min，23% ～25.5%A； 60～62 min，25.5% ～4% A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長254 nm； 進樣量10 μL。色譜圖見圖5。

圖5 各成分HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of various constituents

2.6.2 對照品溶液制備 精密稱取5-羥甲基糠醛、沒食子酸、馬錢苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸、藁本內酯、綠原酸對照品適量，50%甲醇制成質量濃度分別為0.092、0.254、0.244、0.222、1.580、1.170、0.110、0.490、0.128 mg/mL的貯備液，精密吸取除5-羥甲基糠醛以外的8 種貯備液適量，混勻，50%甲醇稀釋成不同質量濃度； 精密吸取5-羥甲基糠醛貯備液適量，50%甲醇稀釋成不同質量濃度，即得。

2.6.3 供試品溶液制備 本品干燥、粉碎后精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，稱定質量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，50%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.6.4 線性關系考察 取不同質量濃度對照品溶液適量，在“2.6.1” 項色譜條件下各進樣10 μL測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量，在“2.6.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得沒食子酸、馬錢苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸、藁本內酯、綠原酸、5-羥甲基糠醛峰面積RSD 分別為1.13%、1.21%、1.93%、1.68%、1.80%、1.02%、1.21%、1.82%、0.91%，表明儀器精密度良好。

2.6.6 重復性試驗 平行制備供試品溶液6 份，在“2.6.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、馬錢苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸、藁本內酯、綠原酸、5-羥甲基糠醛含量RSD分別為1.36%、0.75%、1.02%、1.85%、1.24%、1.71%、1.15%、1.69%、1.43%，表明該方法重復性良好。

2.6.7 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.6.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、馬錢苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸、藁本內酯、綠原酸、5-羥甲基糠醛峰面積RSD 分別為1.54%、0.65%、1.80%、1.55%、1.92%、1.06%、0.78%、1.17%、1.29%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.6.8 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的本品粉末6 份，每份約0.25 g，精密稱定，按100%水平精密加入對照品溶液適量，按“2.6.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.6.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、馬錢苷酸、山茱萸新苷、莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸、藁本內酯、綠原酸、5-羥甲基糠醛平均加樣回收率分別為98.50%、99.28%、98.57%、100.08%、99.63%、99.90%、99.07%、100.12%、98.84%，RSD 分別為 1.69%、1.25%、0.86%、1.92%、0.67、1.37%、0.93%、1.56%、1.73%。

2.6.9 樣品含量測定 平行制備生品組、炮制品組、酒當歸組、酒萸肉組樣品各 5 份，按“2.6.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.6.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表4。由此可知，藁本內酯在酒萸肉組中含量最高； 炮制品組和酒萸肉組中沒食子酸含量約為生品組和酒當歸組中的4 倍，有機酸總含量約為后兩者中的1.5倍，環烯醚萜苷總含量接近。

表4 各成分含量測定結果（mg/g）Tab.4 Results for content determination of various constituents （mg/g）

2.6.10 聚類分析 采用Heml 1.0 軟件，以各成分含量為指標進行分析，結果見圖6。由此可知，同一組別5 批樣品各自聚為一類，表明其質量一致性良好； 生品組和酒當歸組聚為一類，炮制品組和酒萸肉組聚為一類，表明兩兩組別之間各成分含量變化規律相似； 數值越大，顏色越暖，相應成分含量越高，而炮制品組和酒萸肉組暖色調占比較大，表明其所含成分含量整體上較高。

圖6 各成分含量聚類熱圖Fig.6 Cluster heatmap for contents of various constituents

3 討論

3.1 定性定量分析 生品組、炮制品組、酒當歸組、酒萸肉組中均鑒定出環烯醚萜苷、有機酸、苯肽、核苷、氨基酸、皂苷6 種主要構型，化學成分數量也無明顯差異。以VIP ＞1、P＜0.05 為標準，分別對兩兩組別進行OPLS-DA 分析來篩選組間差異物，發現每2 組之間均得到20 種以上差異成分，并選出莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、沒食子酸、阿魏酸、馬錢苷酸、綠原酸、藁本內酯、5-羥甲基糠醛9 種差異大、含量高、藥理活性和紫外吸收強的代表性成分進行含量測定。OPLS-DA 分析、聚類熱圖分析均顯示，炮制品組、酒萸肉組中各成分含量變化趨勢極為相似，表明酒萸肉的加入對增加組方配伍合理性起到主要貢獻； 炮制品組中有機酸、環烯醚萜苷總量略高于酒萸肉組，推測酒當歸的加入也具有一定協同增效作用； 炮制品組中各飲片相互配伍后有機酸總量顯著升高，但環烯醚萜苷類成分含量未明顯降低，與山茱萸酒制后莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷等環烯醚萜苷類成分含量顯著降低的趨勢不同［10］。另外，酒當歸、酒萸肉的加入對組方成分的影響可能與黃酒有關，該輔料可使加味拱辰濃縮丸中當歸、山萸肉等飲片中有機酸類成分溶解度增加，含量升高，進一步改變了溶液pH［36］，從而影響環烯醚萜苷類成分酸解效率，還可提高該類成分前體物質向環烯醚萜苷類物質的轉化效率［37］。

3.2 成分-藥效關聯分析 中醫認為，早發性卵巢功能不全病機主要與腎、肝、心等臟腑有關； 西醫認為，本病主要發病機制與神經內分泌、免疫功能、卵巢微環境、細胞自噬與凋亡等因素有關［2］。加味拱辰濃縮丸主要成分包括有機酸類、環烯醚萜苷類等，具有保護神經系統、促進造血功能、保肝、免疫調節、降血糖等作用，集中作用于神經系統、內分泌系統、免疫系統［34，38］，與早發性卵巢功能不全發病機制吻合，也與中醫“腎” “肝”藏象在宏觀層面所指一致［35，39］。由此推測，加味拱辰濃縮丸所含有機酸、環烯醚萜苷類成分含量的升高可能會增強其補益肝腎作用，從而提高療效。

4 結論

本實驗通過化學成分種類、數量、含量對不同組成的加味拱辰濃縮丸質量進行綜合評價，發現炮制品組、酒萸肉組質量優于生品組、酒當歸組，表明酒萸肉的加入對增加組方配伍的合理性起到主要貢獻，并且酒當歸的加入具有一定協同增效作用。