生地低聚糖霧化吸入后小鼠體內藥動學研究

林佳麗，徐光臨，時瀟麗，劉 力

（上海中醫藥大學附屬曙光醫院藥學部，上海 201203）

慢性阻塞性肺疾病是世界重大公共衛生問題，全球每年死亡病例超過300 萬例，預計到2030 年將成為第三大死因［1-4］。生地低聚糖是生地黃經特定提取分離及純化工藝得到的部位，以水蘇糖為主要成分（含量高達40%）［5-6］，它來源于上海中醫藥大學附屬曙光醫院的院內制劑生地注射液，臨床上用于治療慢性阻塞性肺疾病，療效顯著［7］，對模型大鼠的氣流限制有明顯緩解作用，可用于延緩補全進行性發展，同時也證實了水蘇糖是其主要藥效物質［8-10］。

肺組織給藥其有起效快、防止肝臟首過效應、減少全身不良反應的優勢，在治療呼吸系統疾病中顯示出較大的應用潛力［11-13］。霧化吸入是治療呼吸系統疾病的重要手段［14］，故本實驗采用該方法給予小鼠生地低聚糖，并研究該成分體內藥動學，旨在為經肺組織給藥治療慢性阻塞性肺疾病的新藥開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）； Triple-Quad 4500 質譜儀 （美國AB SCIEX 公司）； NE-C25S 型壓縮霧化器（日本歐姆龍株式會社）。

1.2 試劑與藥物 生地低聚糖（上海中醫藥大學附屬曙光醫院制劑實驗室自制，為白色粉末，無臭，味甜，水蘇糖含量為43.79%）。水蘇糖（批號12031-202002，純度89.9%）、耐斯糖 （批號111891-201704，純度92.2%） 對照品（中國食品藥品檢定研究院）； 乙腈、甲醇為色譜純； 水為超純水。

1.3 動物 SPF 級BALB/c 小鼠，雄性，體質量22～25 g，購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部，動物生產許可證號SCXK （滬） 2018-0006。本實驗經上海中醫藥大學動物倫理委員會批準（倫理號PZSHUTCM220919008）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Shodex Asahipak NH2P-50 4E 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Asahipak NH2P-50G 4A 保護柱（10 mm×4.6 mm）； 流動相水（A） -乙腈（B），梯度洗脫 （0 ～15.10 min，75% ～55%B）； 體積流量900 μL/min； 柱溫25 ℃； 進樣量10 μL。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）； 負離子掃描； 多反應監測 （MRM） 模式； 離子源溫度550 ℃，水蘇糖其他質譜參數見表1。

表1 水蘇糖質譜參數Tab.1 Mass spectrometry parameters for stachyose

2.3 溶液制備

2.3.1 內標溶液 精密量取耐斯糖對照品適量，置于10 mL 量瓶中，超純水溶解并定容至刻度，得質量濃度為200 μg/mL 的貯備液，稀釋至20 μg/mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3.2 對照品溶液 精密稱取水蘇糖對照品適量，置于2 mL 量瓶中，超純水溶解并定容至刻度，即得（該成分質量濃度為1 mg/mL），置于4 ℃冰箱中保存。

2.4 分組、給藥與樣品采集 66 只小鼠隨機分為11 組，每組6 只，置于霧化系統［由歐姆龍壓縮霧化器（工作氣體流量≥4 L/min，噴霧速率≥0.2 mL/min，霧粒中位粒徑2.2 μm，≤5 μm 的霧粒占比大于60%） 和小鼠霧化箱（32 cm×21.5 cm×17 cm） 組成，霧化后的藥液通過導氣管進入霧化箱］中，給藥前自由活動，給藥時口鼻吸入50 mg/mL生地低聚糖溶液6 mL，持續20 min，給藥結束后靜置5 min 以保證霧滴充分吸入，于0、0.16、0.33、0.67、1、2、4、8、12、18、24 h 眼球采血后脫頸椎處死并取肺組織，全血置于肝素鈉離心管中，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，棄去沉淀，吸取上層血漿，肺組織在-20 ℃下保存。

2.5 樣品處理

2.5.1 血漿 精密吸取小鼠血漿100 μL，置于1.5 mL 離心管中，精密加入300 μL 乙腈、5 μL 內標溶液，渦旋振蕩5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，加入100 μL 超純水，渦旋振蕩5 min 后再離心15 min，取上清液待測。

2.5.2 肺組織 精密稱取小鼠肺組織100 mg，加入3 倍量生理鹽水制成勻漿，精密吸取100 μL，加入300 μL 乙腈、5 μL 內標溶液，渦旋振蕩5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，加入100 μL 超純水，渦旋振蕩5 min 后再離心15 min，取上清液待測。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性試驗 取空白血漿、加入對照品（300 ng/mL） 和內標的空白血漿、給藥8 h 后血漿樣品各100 μL，按 “2.5” 項下方法處理，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定； 取空白肺組織勻漿、加入對照品（300 ng/mL） 和內標的空白肺組織勻漿、給藥8 h 后肺組織勻漿各100 μL，按“2.5” 項下方法處理，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，水蘇糖與內標可實現完全分離，未受到血漿和肺組織中內源性雜質干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 水蘇糖LC-MS/MS 色譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of stachyose

2.6.2 線性關系考察 取空白血漿100 μL，加入對照品溶液5 μL，制成質量濃度分別為50、100、300、1 500、3 000、6 000、12 000、36 000 ng/mL的溶液，按 “2.5” 項下方法處理，在 “2.1”“2.2” 項條件下各進樣10 μL 測定； 取空白肺組織勻漿100 μL，加入對照品溶液5 μL，制成質量濃度分別為50、100、300、1 500、3 000、6 000、12 000、36 000 ng/mL 的溶液，按“2.5” 項下方法處理，在“2.1” “2.2” 項條件下各進樣10 μL測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），對照品、內標峰面積比值為縱坐標（Y） 進行回歸，并以S/N＝10 為定量限，結果見表2，可知在各自范圍內線性關系良好。

表2 水蘇糖線性關系Tab.2 Linear relationships of stachyose

2.6.3 準確度、精密度試驗 制備水蘇糖質量濃度為分別150、18 000、27 000 ng/mL 的質控樣品，平行6 份，按“2.5” 項下方法處理，同一天內在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定，計算日內精密度和準確度； 同法連續測定3 d，每天1 次，計算日間精密度和準確度，結果見表3，可知均符合生物樣品分析要求。

表3 水蘇糖準確度、精密度試驗結果（n＝6）Tab.3 Results for accuracy and precision tests of stachyose （n＝6）

2.6.4 提取回收率、基質效應試驗 制備水蘇糖質量濃度分別為150、18 000、27 000 ng/mL 的質控樣品，平行6 份，按“2.5” 項下方法處理，同一天內在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定水蘇糖、內標峰面積A1、B1； 取空白血漿和肺組織適量，加入等量對照品、內標溶液使其達到與質控樣品相同的質量濃度，按“2.5” 項下方法處理，同一天內在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定兩者峰面積A2、B2，計算提取回收率A1/A2、B1/B2。分別取空白樣品適量、水100 μL，加入等量對照品、內標溶液使其達到與質控樣品相同的質量濃度，按“2.5” 項下方法處理，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定，計算基質效應，結果見表4，可知均符合生物樣品分析要求。

表4 水蘇糖提取回收率、基質效應試驗結果（±s，n＝6）Tab.4 Results for extraction recovery and matrix effect tests of stachyose （±s，n＝6）

表4 水蘇糖提取回收率、基質效應試驗結果（±s，n＝6）Tab.4 Results for extraction recovery and matrix effect tests of stachyose （±s，n＝6）

樣品成分理論質量濃度/（ng·mL-1）提取回收率/%RSD/%基質效應/%RSD/%血漿水蘇糖15046.81±1.733.7123.1±3.422.8 18 00051.46±5.159.8116.6±6.095.2 27 00047.60±1.954.1115.9±9.468.2內標1 00056.47±3.486.2103.61±6.556.3肺組織水蘇糖15063.06±4.497.196.67±5.856.1 18 00058.81±3.235.5106.0±3.693.5 27 00057.34±4.157.2105.1±5.455.2內標1 00056.49±3.085.597.71±7.107.3

2.6.5 穩定性試驗 制備水蘇糖質量濃度分別為150、18 000、27 000 ng/mL 的質控樣品，平行6份，按“2.5” 項下方法處理，在“2.1” “2.2”項條件下進樣測定，分別在室溫下放置4 h、4 ℃自動進樣器中放置24 h、-20 ℃下放置30 d、連續3 d 在-20 ℃下反復凍融3 次，按“2.5” 項下方法處理，在“2.1” “2.2” 項條件下進樣測定，結果見表5，可知均符合生物樣品分析要求。

表5 水蘇糖穩定性試驗結果（n＝6）Tab.5 Results for stability tests of stachyose （n＝6）

2.7 體內藥動學研究 血藥濃度-時間曲線見圖2，再采用DAS 3.1.1 軟件中的非房室模型計算主要藥動學參數，結果見表6。由此可知，給藥后在血漿中有一段吸收入血的時間，而在肺組織中的藥物濃度達峰值，隨后緩慢消除。

圖2 生地低聚糖在小鼠血漿和肺組織中的藥物濃度-時間曲線Fig.2 Drug concentration-time curves for R.glutinosa oligosaccharides in mouse plasma and lung tissue

表6 生地低聚糖主要藥動學參數Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for R.glutinosa oligosaccharides

3 討論與結論

方法學結果表明，樣品提取回收率較低，故本實驗采用乙腈沉淀法除蛋白。雖然水蘇糖和內標在乙腈中的溶解度較低，部分會隨蛋白沉淀，導致在提取步驟有損失，但質控樣品提取回收率不具有統計學意義，RSD 均在10%以內，不影響藥物測定，故本實驗未探討如何提高兩者提取回收率，但在后續實驗中將對樣品前處理技術進行改進。

霧化吸入可將藥物直接送達肺組織，起效快速，用藥量少［15-16］。課題組前期分別考察生地低聚糖質量濃度在3、6、12、24、50 mg/mL 時的霧化效果，發現霧化吸入后在小鼠血漿和肺組織中均能測得藥物，而且其含量隨著霧化質量濃度增加而升高。為了便于藥動學實驗中不同采血時間點的血藥濃度檢測，本實驗選擇最高質量濃度的生地低聚糖溶液作為霧化溶液。另外，藥物沉積位置與霧化顆粒直徑相關，在0.5 ～10 μm 時可直達肺組織［17］，本實驗采用歐姆龍壓縮霧化器，霧化后顆粒粒徑在2.2 μm 左右，可滿足肺組織給藥需求。

藥物經霧化吸入后，在肺組織、氣道中起到藥效作用［17-19］。藥動學研究結果表明，生地低聚糖霧化吸入后能較快地吸收入血，而且全身循環后消除較快； 與血漿比較，肺組織中藥物含量在霧化給藥結束后即達峰值，半衰期在4 h 左右，表明此時生地低聚糖可迅速分布到該器官中，隨后滯留一段時間； 全身性不良反應與藥物高濃度暴露有關，故前者可隨后者Cmax降低而減少［20］。本實驗發現，霧化吸入后肺組織中藥物Cmax低于血漿中，表明生地低聚糖進入體循環濃度降低。

綜上所述，小鼠霧化吸入生地低聚糖后藥物迅速分布到肺組織，而且滯留時間較長，從而實現對該器官疾病快速、靶向治療的目的，并可為經霧化吸入治療慢性阻塞性肺疾病的相關新藥開發提供依據。