基于細胞焦亡及中性粒細胞胞外誘捕網探討刺梨根對潰瘍性結腸炎大鼠的影響

晏一平，陳云志，李 倩，陳波洋，范志梁，陳 帥，柴藝匯，秦 忠

（貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC） 是一種以反復腹痛、腹瀉、膿血便及體質量減輕為主要臨床表現的自身免疫性炎癥疾病，主要病理表現為結腸炎癥和黏膜損傷［1］。我國UC 的患病率急劇上升［2］。UC 發病機制至今尚不明確，可能與遺傳易感性、腸黏膜屏障受損、黏膜免疫應答失調和環境因素有關［3］。臨床治療UC 常用藥物有氨基水楊酸類、類固醇、免疫抑制劑、生物制劑等，雖能緩解臨床癥狀，但增加了感染和患癌的風險［4］。因此，研究UC 的發病機制和藥物開發具有重要意義。

細胞焦亡是近年來發現的一種由炎癥小體引發的裂解性程序性細胞死亡形式，在組織穩態及免疫調節中充當重要角色。適度的細胞焦亡可保護機體免受病原體及微生物感染，但其過度激活可引起組織損傷促進炎癥反應，在UC 發病機制中發揮重要作用［5-6］。中性粒細胞胞外誘捕網 （neutrophil extracellular traps，NETs） 是中性粒細胞釋放其細胞外染色質、核蛋白和絲氨酸蛋白酶形成一種以DNA 為框架的網狀纖維結構，其作為一種免疫監管行為，可通過誘捕作用防御病原體感染，但過量的NETs 可導致UC 病理性炎癥［7］。研究顯示，細胞焦亡可引發NETs 放大炎癥反應，NETs 亦可誘導細胞焦亡［8］?？梢?，細胞焦亡與NETs 相互影響并在UC 的發生發展中起關鍵作用。

刺梨為薔薇科薔薇屬植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt，是貴州資源豐富的民族藥材，其性味甘、酸，歸脾、胃、腎經，民間多用于治療食積腹脹、泄瀉、痢疾、腸炎等疾?。?］。刺梨根是刺梨的干燥根莖，現代研究表明刺梨根可有效改善UC 炎癥［10］。課題組前期研究發現，刺梨根可通過改善UC 大鼠腸道病理結構起到干預UC 的作用［11］，但其對UC 的作用機制是否與調節細胞焦亡及NETs 相關，至今未見明確報道。因此，本研究基于細胞焦亡及NETs 探討刺梨根干預潰瘍性結腸炎的作用機制，以期為刺梨根治療UC 的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠48 只（雌雄各半），體質量（200±20） g，購自貴州中醫藥大學實驗動物中心 ［實驗動物生產許可證號SCXK （黔）2021-0003］，飼養于本校實驗動物中心SPF 級動物房，溫度22～24 ℃，相對濕度40% ～60%。動物實驗獲得貴州中醫藥大學倫理委員會批準（倫理號20210101）。

1.2 藥物 刺梨根（批號20190501） 購自貴州德昌祥健康管理有限公司，經貴州中醫藥大學方藥教研室蔣志濱副教授鑒定為薔薇科植物繅絲花Rosa roxburghiiTratt 的干燥根。刺梨根用蒸餾水浸泡0.5 h，武火煮沸后轉文火煎煮1 h，過濾，藥渣加蒸餾水同法再次煎煮，合并2 次煎煮液，濃縮至生藥量0.8 g/mL，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 試劑 柳氮磺吡啶（批號s129986-25g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 三硝基苯磺酸（批號P2297，美國Sigma 公司）； 糞便隱血定性檢測試劑盒（批號206A21，北京雷根生物技術有限公司）； 山羊抗兔二抗、消皮素D （gasdermin D，GSDMD） 抗體、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO） 抗體 （ 批號 SA00001-2、20770-1-AP、22225-1-AP，武漢三鷹生物技術有限公司）； 活化半胱天冬氨酸酶-1 （cysteinyl aspartate specific proteinase 1，caspase-1）、NOD 樣受體蛋白 3（NOD-like receptor protein3，NLRP3）、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、GAPDH 抗體（批號AF5418、DF7438、AF0010、AF7021，美國Affinity 公司）； 白細胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、IL-18、MPO ELISA 試劑盒 （批號JM-01454R2、JM-01601R2、JM-01744R2，江蘇晶美生物科技有限公司）。

1.4 儀器 BMJ-A 型組織包埋機（常州郊區中威電子儀器廠）； 轉輪式切片機（德國徠卡公司）；JT-12S 自動脫水機 （武漢俊杰電子有限公司）；PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司）； LISKANMK3 酶標儀 （美國 Thermo Fisher Scientific 公司）； HI650 型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）； DYCZ-24DN 垂直電泳槽（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 將48 只SD 大鼠（雌雄各半） 適應性喂養1 周后，隨機分為正常組（8只） 和造模組（40 只）。造模前大鼠禁食24 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg） 麻醉后，將三硝基苯磺酸（TNBS） 與0.25 mL 50%乙醇混合溶液（100 mg/kg） 經灌腸軟管緩慢注入距大鼠肛門約8 cm 處深的結腸部位，隨即倒置5 min，謹防藥液流出［12］； 正常組大鼠同法灌注生理鹽水。將造模成功的40 只大鼠隨機分為模型組、柳氮磺吡啶組（0.3 g/kg） 和刺梨根低、中、高劑量組（2、4、8 g/kg），每組8 只。正常組和模型組均灌胃生理鹽水，各給藥組灌胃相應劑量藥物，每天1 次，連續給藥21 d。

2.2 樣本采集 末次給藥后禁食24 h，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg） 麻醉后，腹主動脈取血，靜置0.5 h 后3 000 r/min 離心10 min，分離采集血清，置于-80 ℃冰箱保存備用； 處死大鼠后，取距離肛門（8±2） cm 結腸組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分置于-80 ℃冰箱保存備用。

2.3 大鼠一般情況觀察及疾病活動指數（DAI）評分 每天觀察各組大鼠精神狀態、毛發光澤、活動體態、大便性狀等變化，記錄大鼠體質量、大便性狀，通過鄰聯甲苯胺法檢測大鼠大便隱血情況（2 min 內顯藍色則提示隱血陽性，根據其顏色深淺判斷陽性的強弱，在2 min 內不顯色為陰性），根據Okayasu 等［13］報道的評分標準記錄各組大鼠疾病活動指數（disease aetivity index，DAI） 得分，DAI 評分標準見表1。

表1 DAI 評分標準Tab.1 DAI scoring standards

2.4 HE 染色觀察大鼠結腸組織病理變化 取于4%多聚甲醛中固定的結腸，常規包埋，連續切片，蘇木素染色，伊紅復染，脫水，透明，封片后于顯微鏡下觀察。

2.5 ELISA 法檢測大鼠血清IL-1β、IL-18、MPO水平 取各組大鼠血清，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-18、MPO 水平。

2.6 免疫組化法檢測大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白表達 取結腸組織切片，脫臘至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，正常血清封閉，一抗4 ℃孵育過夜，次日PBS 洗滌3 次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3 次后，復染細胞核，脫水、封片，采集染色切片圖像，使用Halo 數據分析系統計算NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 陽性染色面積占比。

2.7 Western blot 法檢測大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白表達 取少量結腸組織，剪碎后勻漿，于冰上裂解30 min，離心取上清，BCA 法測定樣品蛋白濃度。將提取的蛋白上清與5×蛋白上樣緩沖液混勻，于沸水中加熱10 min 進行變性。蛋白樣品上樣后電泳、轉膜，加封閉液室溫搖床封閉2 h，加入一抗GAPDH （1 ∶1 000）、NE （1 ∶1 000）、caspase-1 （1 ∶1 000）、NLRP3 （1 ∶1 000）、MPO （1 ∶2 000）、GSDMD（1 ∶3 000） 4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗IgG（1 ∶600） 室溫搖床孵育2 h，洗膜3 次，曝光、顯影，使用BandScan 軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 為內參計算目的蛋白相對表達。

2.8 統計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗及Dunnett’s T3 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 刺梨根對UC 大鼠一般情況的影響 正常組大鼠精神狀態正常，活動靈敏，毛發光亮順滑，大便正常； 模型組大鼠體質量下降，精神萎靡，弓背，活動遲緩，毛發枯燥無光澤，伴有稀便、血便； 與模型組比較，刺梨根中、高劑量組及柳氮磺吡啶組大鼠癥狀日漸好轉，體質量回升，精神狀態漸佳、活動增多、毛發色澤漸好、大便成形且未見明顯血便。

3.2 刺梨根對UC 大鼠體質量及DAI 評分的影響 給藥前，與正常組比較，各造模組大鼠體質量均降低（P＜0.01），DAI 評分均升高（P＜0.01）。給藥21 d 后，與正常組比較，模型組大鼠體質量降低（P＜0.01），DAI 評分升高（P＜0.01）； 與模型組比較，柳氮磺吡啶組和刺梨根中、高劑量組大鼠體質量升高 （P＜0.01），DAI 評分降低 （P＜0.05，P＜0.01），刺梨根低劑量組大鼠體質量升高（P＜0.05），DAI 評分無明顯變化（P＞0.05），見表2～3。

表2 刺梨根對UC 大鼠體質量的影響（g，±s，n＝8）Tab.2 Effects of R.roxburghii Radix on body weight of UC rats （g，x ±s，n＝8）

表2 刺梨根對UC 大鼠體質量的影響（g，±s，n＝8）Tab.2 Effects of R.roxburghii Radix on body weight of UC rats （g，x ±s，n＝8）

注： 與正常組比較，**P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別給藥前體質量給藥21 d 后體質量正常組210.5±8.38251.13±9.23模型組191.5±10.62**213.88±11.32**柳氮磺吡啶組191.13±13.70**237.25±8.84＃＃刺梨根低劑量組193.13±8.36**224.88±11.31＃刺梨根中劑量組193.38±10.34**230.25±6.04＃＃刺梨根高劑量組191.88±17.53**234.38±8.26＃＃

表3 刺梨根對UC 大鼠DAI 評分的影響（分，±s，n＝8）Tab.3 Effects of R.roxburghii Radix on DAI score of UC rats （score，±s，n＝8）

注： 與正常組比較，**P ＜0.01； 與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別給藥前DAI 評分給藥21 d 后DAI 評分正常組00模型組2.29±0.79**1.88±0.25**柳氮磺吡啶組2.42±0.53**0.54±0.18＃＃刺梨根低劑量組2.63±0.74**1.29±0.45刺梨根中劑量組2.62±0.38**0.96±0.49＃刺梨根高劑量組2.33±0.53**0.58±0.35＃＃

3.3 刺梨根對UC 大鼠結腸組織病理學的影響正常組大鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層形態結構完整，未見明顯病理改變； 模型組大鼠結腸組織黏膜層大面積變性壞死、腸腺結構消失并見大量的纖維組織增生，同時伴有大量炎性細胞浸潤并累及黏膜下層、肌層和漿膜層； 柳氮磺吡啶組和刺梨根高劑量組大鼠結腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層結構較完整，炎性細胞浸潤較模型組明顯減少； 刺梨根中劑量組黏膜層局部區域變性壞死，較模型組稍改善，見圖1。

圖1 刺梨根對UC 大鼠結腸組織病理學變化的影響（HE，×100）Fig.1 Effects of R.roxburghii Radix on histopathological changes of colon in UC rats （HE，×100）

3.4 刺梨根對UC 大鼠血清IL-1β、IL-18、MPO水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18、MPO 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，柳氮磺吡啶組和刺梨根中、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-18、MPO 水平降低（P＜0.01），刺梨根低劑量組大鼠血清IL-1β 水平降低（P＜0.01），IL-18、MPO 水平無明顯變化（P＞0.05），見表4。

表4 刺梨根對UC 大鼠血清IL-1β、IL-18、MPO 水平的影響（pg/mL，±s，n＝6）Tab.4 Effects of R.roxburghii Radix on serum IL-1β，IL-18 and MPO levels of UC rats （pg/mL，±s，n＝6）

表4 刺梨根對UC 大鼠血清IL-1β、IL-18、MPO 水平的影響（pg/mL，±s，n＝6）Tab.4 Effects of R.roxburghii Radix on serum IL-1β，IL-18 and MPO levels of UC rats （pg/mL，±s，n＝6）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別IL-1βIL-18MPO正常組15.38±4.7388.93±5.3172.27±18.80模型組30.00±3.35**141.42±3.47**146.57±22.49**柳氮磺吡啶組16.00±2.42＃＃96.45±10.45＃＃81.82±21.01＃＃刺梨根低劑量組21.07±4.30＃＃111.61±17.69130.29±14.40刺梨根中劑量組20.37±1.76＃＃104.64±13.01＃＃100.58±9.79＃＃刺梨根高劑量組15.18±2.50＃＃91.72±6.08＃＃86.17±15.67＃＃

3.5 刺梨根對UC 大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白表達的影響 免疫組化結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠結腸組織NE、MPO、NLRP3、caspase-1、GSDMD 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，柳氮磺吡啶組和刺梨根中、高劑量組大鼠結腸組織NE、MPO、NLRP3、caspase-1、GSDMD 蛋白表達降低（P＜0.01），低劑量組大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），NLRP3、GSDMD 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），見圖2～6、表5。

圖2 刺梨根對UC 大鼠結腸組織NE 蛋白表達的影響（免疫組化，×400）Fig.2 Effects of R.roxburghii Radix on NE protein expression in colon tissue of UC rats （IHC，×400）

圖3 刺梨根對UC 大鼠結腸組織MPO 蛋白表達的影響（免疫組化，×400）Fig.3 Effects of R.roxburghii Radix on MPO protein expression in colon tissue of UC rats （IHC，×400）

圖5 刺梨根對UC 大鼠結腸組織NLRP3 蛋白表達的影響（免疫組化，×400）Fig.5 Effects of R.roxburghii Radix on NLRP3 protein expression in colon tissue of UC rats （IHC，×400）

圖6 刺梨根對UC 大鼠結腸組織GSDMD 蛋白表達的影響（免疫組化，×400）Fig.6 Effects of R.roxburghii Radix on GSDMD protein expression in colon tissue of UC rats （IHC，×400）

表5 刺梨根對UC 大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白陽性染色面積的影響（%，±s，n＝3）Tab.5 Effects of R.roxburghii Radix on the positive staining area of NE，MPO，caspase-1，NLRP3 and GSDMD proteins in colon tissue of UC rats （%，±s，n＝3）

表5 刺梨根對UC 大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白陽性染色面積的影響（%，±s，n＝3）Tab.5 Effects of R.roxburghii Radix on the positive staining area of NE，MPO，caspase-1，NLRP3 and GSDMD proteins in colon tissue of UC rats （%，±s，n＝3）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別NEMPOcaspase-1NLRP3GSDMD正常組2.66±0.5813.78±4.883.53±1.185.75±2.6110.34±1.94模型組18.60±3.09**29.74±11.05**31.73±3.69**21.23±2.43**24.65±0.78**柳氮磺吡啶組6.19±2.86＃＃11.86±4.23＃＃11.09±3.54＃＃5.50±2.47＃＃17.50±2.19＃＃刺梨根低劑量組14.14±1.47＃16.06±5.62＃＃23.57±3.61＃＃18.66±2.8822.78±1.19刺梨根中劑量組10.07±1.98＃＃11.44±2.69＃＃15.24±2.09＃＃12.59±2.85＃＃20.19±0.35＃＃刺梨根高劑量組6.35±2.18＃＃12.01±8.70＃＃9.18±3.43＃＃7.31±3.10＃＃14.19±1.15＃＃

Western blot 結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白表達均升高（P＜0.01）； 與模型組比較，柳氮磺吡啶組及刺梨根中、高劑量組大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），刺梨根低劑量組大鼠結腸組織MPO、NLRP3 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），NE、caspase-1、GSDMD 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），見圖7、表6。

圖7 各組大鼠結腸組織 NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白條帶圖Fig.7 Protein bands of NE，MPO，caspase-1，NLRP3 and GSDMD in colon tissues of rats in each group

表6 刺梨根對UC 大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Tab.6 Effects of R.roxburghii Radix on the protein expressions of NE，MPO，caspase-1，NLRP3 and GSDMD in colon tissue of UC rats （±s，n＝3）

表6 刺梨根對UC 大鼠結腸組織NE、MPO、caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Tab.6 Effects of R.roxburghii Radix on the protein expressions of NE，MPO，caspase-1，NLRP3 and GSDMD in colon tissue of UC rats （±s，n＝3）

注： 與正常組比較，**P＜0.01； 與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別NEMPOcaspase-1NLRP3GSDMD正常組0.31±0.100.25±0.030.29±0.060.26±0.040.28±0.04模型組0.75±0.04**0.72±0.05**0.69±0.04**0.77±0.02**0.70±0.07**柳氮磺吡啶組0.51±0.08＃＃0.45±0.03＃＃0.42±0.10＃＃0.51±0.09＃＃0.47±0.05＃＃刺梨根低劑量組0.66±0.080.59±0.03＃＃0.62±0.060.64±0.07＃0.62±0.07刺梨根中劑量組0.50±0.04＃＃0.47±0.02＃＃0.50±0.02＃＃0.58±0.07＃＃0.53±0.10＃刺梨根高劑量組0.42±0.04＃＃0.33±0.05＃＃0.37±0.05＃＃0.42±0.06＃＃0.39±0.09＃＃

4 討論

UC 病程長、致癌風險高、治愈難度大，嚴重影響患者生活質量，故尋找高療效、低不良反應率的藥物治療UC 是關鍵［14］。本實驗基于祖國醫學及目前相關研究對刺梨根的認識，發現刺梨根能有效改善UC 大鼠炎癥、一般情況、DAI 評分、結腸組織病理情況。

NETs 是中性粒細胞經刺激活化后釋放一種以DNA 為骨架，其間鑲嵌有NE、MPO 等顆粒蛋白的網狀結構［15］。研究發現，UC 中MPO、NE 高表達并與疾病嚴重程度呈正相關［16］。MPO 是一種主要在中性粒細胞中表達的過氧化物酶，可通過介導腸道炎性反應引發UC 的腸道菌群紊亂，可作為UC疾病活動度的評估指標［17］，一定程度上反映UC的炎性反應狀態［18］。NE 是中性粒細胞釋放的主要炎癥蛋白酶，可破壞緊密連接蛋白，損害UC 腸道通透性及腸道屏障功能［19］。本研究顯示，UC 大鼠血清MPO 水平及結腸組織MPO、NE 蛋白表達升高，經刺梨根水煎液干預后以上指標降低，說明刺梨根可通過抑制NETs 過表達改善UC 大鼠炎癥反應。

細胞焦亡是當機體受到內、外源性物質刺激后誘導形成NLRP3 炎癥小體，caspase-1 繼而促進IL-1β、IL-18 成熟并切割GSDMD 釋放其N 端結構域的一種細胞死亡形式［20］。NLRP3 廣泛分布于腸黏膜上皮細胞及巨噬細胞中，是腸道穩態的重要調節因子［21］。臨床研究表明，抑制UC 患者結腸組織中NLRP3 活化可有效改善UC 臨床表現［22］。GSDMD、caspase-1 可激活并加速IL-1β 與IL-18 的釋放［23-24］，引發腸道上皮內膜死亡［6］。抑制NLRP3、GSDMD 或caspase-1 除可阻礙NE、MPO釋放、減少NETs 形成外［25-26］，還能降低炎癥結腸組織中MPO、IL-18 水平，減少中性粒細胞浸潤，從而緩解腸道炎癥改善UC 炎癥反應及病理損傷［27-28］。而NE 亦可切割GSDMD 導致細胞膜破裂并釋放NETs［29］，NETs 激活caspase-1、NLRP3，釋放IL-1β 及IL-18 產生自我延續循環，導致NETs與炎癥介質加重UC 炎癥反應［30］。由此可知，細胞焦亡除與UC 的發病機制密切相關外，還能與NETs 相互協同作用參與UC 的發病機制。本研究顯示，UC 大鼠結腸組織 NLRP3、caspase-1、GSDMD 蛋白表達及血清IL-1β、IL-18 水平升高，經刺梨根水煎液干預后以上指標均降低，提示刺梨根可能通過抑制細胞焦亡與NETs 進而減輕UC 炎癥反應。

綜上所述，刺梨根可通過降低caspase-1、NLRP3、GSDMD 蛋白表達，減少IL-1β、IL-18 炎癥因子釋放，進而抑制細胞焦亡進展，并減少NETs 中NE、MPO 的生成以改善UC 大鼠炎癥反應。本研究結果表明刺梨根在UC 的治療上具有潛在臨床價值，但現階段對刺梨根干預UC 具體機制的研究方法較為單一，今后將在此基礎上對刺梨根治療UC 的具體分子機制進行深入研究，為刺梨根治療UC 與進一步開發應用提供實驗依據。