黑地黃丸通過調控IGF-1 表達對慢性腎衰竭大鼠腎纖維化的抑制作用

葉莉瑩，潘廣輝，趙 平，王澤鵬，柳 成，李穎穎，張法榮*

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355； 2.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250012； 3.泰安市中醫院，山東 泰安 271000； 4.北大醫療淄博醫院，山東 淄博 255000）

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF） 是一種腎功能進行性減退直至衰竭的臨床綜合征，病情危重，病死率高，嚴重威脅患者生命健康［1-2］。腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF） 是各種原因引起的CRF 進展為終末期腎衰的共同途徑［3］。胰島素樣生長因子-1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1） 是重要的促生長因子，在腎小管以及腎小球上均有IGF-1 受體（IGF-1R） 的表達，IGF-1 能夠刺激各種腎臟細胞生長，與纖維化密切相關［4］。目前臨床治療CRF 以腹膜透析等為主［5］，但隨著透析時間延長，患者代謝紊亂、微炎癥狀態隨之加重，給預后帶來嚴重影響［6］。因此，臨床迫切需要安全有效的藥物來防治CRF 腎纖維化的進展。

中醫學認為CRF 屬本虛標實之證，本虛為脾腎虧虛，標實為濕濁、血瘀，需以健脾補腎、活血化瘀、解毒化濕之法治之［7］。黑地黃丸出自劉完素《素問病機氣宜保命集》，由熟地黃、蒼術、干姜、大棗4 味中藥組成，具有補腎健脾、燥濕化濁之效［8-9］。課題組前期研究證實黑地黃丸能夠延緩CRF 進展，且發現CRF 大鼠血清IGF-1 變化明顯［10］?；诖?，本實驗重點探究黑地黃丸對CRF大鼠腎纖維化的影響以及IGF-1 在其中的作用，以期為黑地黃丸臨床研究提供實驗室依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質量（180±20） g，由北京維通利華動物技術有限公司提供［實驗動物生產許可證號SCXK （京） 2016-0006］，飼養于山東中醫藥大學附屬醫院實驗中心，環境溫度（24±2）℃，相對濕度（60±5）%，12 h/12 h光/暗循環，標準飲食，自由飲水。實驗過程中所有操作均符合山東中醫藥大學附屬醫院實驗中心實驗動物倫理原則（倫理號AWE-2019-015）。

1.2 藥物 黑地黃丸由熟地黃32 g、蒼術32 g、干姜2 g、大棗34 g 組成，中藥飲片購自山東中醫藥大學附屬醫院藥房，經該院中藥師谷明舉主任鑒定為正品，在本院煎藥室進行藥物制備。將4 味藥加10 倍量水浸泡30 min，煎煮2 次，每次2 h，紗布過濾后合并濾液，濃縮至最終質量濃度為1 g/mL，4 ℃保存備用。

1.3 試劑 IGF-1R 阻斷劑JB1 （貨號T6017） 購自上海陶術生物科技有限公司； BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0010） 購自上海碧云天生物技術股份有限公司； TGF-β （貨號ab215715）、GAPDH （貨號ab181602） 抗體均購自英國Abcam 公司； IGF-1R 抗體（貨號20254-1-AP）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG （貨號20536-1-AP） 均購自武漢三鷹生物技術有限公司； α-SMA 抗體 （貨號GB11364）、HIF-1α 抗體（貨號GB13031）、免疫組化試劑盒DAB 顯色劑（貨號G1211） 均購自武漢賽維爾生物科技有限公司； ECL 發光試劑盒（貨號MA0186）、組織固定液（貨號MA0192） 均購自大連美侖生物技術有限公司； 快速RNA 提取試劑盒 （貨號AC0202）、反轉錄試劑盒 （貨號AG0304）、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Realtime PCR） 試劑（貨號AH0104） 均購自青島浩賽科技股份有限公司。

1.4 儀器 BX53 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）； 5404 離心機 （ 德國 Eppendorf 公司）；RM2235 切片機（德國Leica 公司）； FluorChemQ顯影儀（美國Protein-Simple 公司）； 5424R 型低速離心機（美國Thermo Fisher 公司）； DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋 （上海比朗儀器制造有限公司）；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）； SIM-F124 制冰機（日本SANYO公司）； CascadaI 型純化水系統（美國PALL 公司），Axiovert40 型倒置顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司）。

2 方法

2.1 CRF 大鼠模型的建立 60 只大鼠適應性喂養1 周后，隨機取12 只大鼠作為空白組，剩余大鼠采用5/6 腎切除法復制CRF 模型［11］。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg） 麻醉，俯臥位固定，常規消毒皮膚，暴露右腎，剝離腎被膜，結扎腎門，切除右腎（保留腎上腺），逐層縫合皮膚。第1 次手術后10 d，同樣方法麻醉后切除左腎上、下極腎實質，以明膠海綿壓迫止血，關閉腹腔。各組大鼠于第2 次術后4 周，斷尾取血，并檢測血清中肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN） 水平，以Scr、BUN 水平較空白組均顯著升高表明模型復制成功［12］（本實驗共剔除死亡和未成模大鼠8 只）。

2.2 分組及給藥 將造模成功的大鼠隨機分成模型組（14 只）、黑地黃丸組（13 只） 及黑地黃丸＋JB1 組（13 只），另設空白組（12 只）。根據體表面積法換算等效劑量，黑地黃丸組大鼠每天皮下注射生理鹽水； 黑地黃丸＋JB1 組大鼠每天9： 00 皮下注射18 ng/g IGF-1R 阻斷劑JB1 （50 ng/μL），連續7 d。注射7 d 后，黑地黃丸組和黑地黃丸＋JB1 組大鼠均灌胃給予10.43 g/kg 黑地黃丸藥液，空白組和模型組均灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續8 周。

2.3 大鼠腎功能檢測 給藥8 周后，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg） 麻醉，腹主動脈取血，靜置30 min 后離心取血清，于-80 ℃冰箱保存。采用全自動生化分析儀檢測血清Scr、BUN 水平。

2.4 腎組織病理學觀察 將殘余腎臟沿腎蒂剪下，以10%多聚甲醛溶液固定后，流水沖洗過夜，常規脫水，透明，浸蠟，包埋，切片，展片，烤片，再進行蘇木素-伊紅（HE） 和馬松（Masson） 染色。HE 染色切片在光鏡下觀察腎臟組織的改變；Masson 染色切片在光學顯微鏡下觀察腎纖維化改變。在200 倍鏡下隨機選取10 個不同視野，將呈現為藍色區域的膠原纖維作為陽性目標，以陽性區域面積與整個視野總面積的比值為腎纖維化指數。采用Image Pro Plus 6.0 軟件進行半定量分析。

磨礦是選礦過程中的一個重要環節，尤其是對硫化礦來說，磨礦會使其礦漿性質(如礦漿電位、pH)產生較大的改變[1]，這些改變對浮選回收率起著至關重要的作用。因此，磨礦對方鉛礦礦漿電位及浮選行為影響的研究十分必要。

2.5 免疫組化法檢測腎組織TGF-β、HIF-1α、α-SMA 蛋白表達 腎組織石蠟切片采用免疫組織化學染色測定腎小管間質TGF-β、HIF-1α、α-SMA蛋白表達。

2.6 Western blot 法檢測腎組織IGF-1R、TGF-β 蛋白表達 取腎組織，在冰上用RIPA 細胞裂解液裂解，提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液煮沸10 min 進行變性。取40 μg蛋白上樣，經SDS-PAGE 凝膠電泳后，將蛋白電轉至聚偏氟乙烯（PVDF） 膜上，用50 g/L 脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP） 標記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后采用電化學發光（ECL） 法使蛋白條帶顯色，以GAPDH 為內參，采用Image J 分析軟件對各組條帶的灰度值進行分析。

2.7 RT-qPCR 法檢測腎組織IGF-1R、TGF-βmRNA表達 收集各組腎組織后，使用快速RNA 提取試劑盒提取腎組織總RNA，按照試劑盒說明書反轉錄合成cDNA 后，采用RT-qPCR 系統檢測關鍵靶點IGF-1R和TGF-β的表達。PCR 擴增以GAPDH為內照，引物序列見表1。擴增條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環40 次。PCR 實驗重復3 次，每次3 個復孔，根據RT-qPCR 原始數據CT值，以2-ΔΔCT法分析樣本的相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.8 統計學分析 通過SPSS 25.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著性差異法（LSD）。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 CRF 造模后大鼠腎功能指標比較 以血清Scr、BUN 水平為指標，通過對比造模前后指標變化，評價CRF 模型是否建立成功。如表2 所示，與空白組比較，CRF 造模組大鼠血清Scr、BUN 水平均升高（P＜0.05），表明大鼠CRF 模型復制成功。

表2 造模后大鼠腎功能指標比較（±s）Tab.2 Comparison of renal function indexes levels in rats after modeling （±s）

表2 造模后大鼠腎功能指標比較（±s）Tab.2 Comparison of renal function indexes levels in rats after modeling （±s）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05。

組別動物數/只Scr/（μmol·L-1）BUN/（mmol·L-1）空白組1220.00±0.126.92±0.72造模組4038.29±14.58＃12.81±4.91＃

3.2 黑地黃丸對CRF 大鼠血清Scr、BUN 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清Scr、BUN水平升高（P＜0.05），表明模型組大鼠腎功能衰退； 與模型組比較，黑地黃丸組大鼠血清Scr、BUN 水平降低（P＜0.05），黑地黃丸＋JB1 組大鼠血清BUN 水平降低（P＜0.05），Scr 水平無明顯變化（P＞0.05），見表3。結果表明，連續給藥8 周后，CRF 大鼠腎功能好轉，而此效應被JB1 減弱。

表3 黑地黃丸對CRF 大鼠血清Scr、BUN 水平的影響（±s）Tab.3 Effects of Heidihuang Pills on serum Scr and BUN levels in CRF rats （±s）

表3 黑地黃丸對CRF 大鼠血清Scr、BUN 水平的影響（±s）Tab.3 Effects of Heidihuang Pills on serum Scr and BUN levels in CRF rats （±s）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別動物數/只 Scr/（μmol·L-1） BUN/（mmol·L-1）空白組1223.00±2.659.57±0.69模型組1459.67±12.70＃16.30±0.80＃黑地黃丸組1341.67±2.52*11.94±0.06*黑地黃丸＋JB1 組1348.00±10.4414.00±1.50*

圖1 各組大鼠腎組織HE 染色（×200）Fig.1 HE staining of rat renal tissue for each group （×200）

圖2 各組大鼠腎組織Masson 染色（×200）Fig.2 Masson staining of rat renal tissue for each group （×200）

表4 黑地黃丸對CRF 大鼠腎臟纖維化的影響（±s，n ＝6）Tab.4 Effects of Heidihuang Pills on renal fibrosis in CRF rats （±s，n＝6）

表4 黑地黃丸對CRF 大鼠腎臟纖維化的影響（±s，n ＝6）Tab.4 Effects of Heidihuang Pills on renal fibrosis in CRF rats （±s，n＝6）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05。

組別纖維化陽性面積占比/%空白組5.43±0.63模型組25.25±3.02＃黑地黃丸組16.15±1.20*黑地黃丸＋JB1 組18.39±1.03*

3.4 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α 蛋白表達的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α 蛋白表達增加（P＜0.05）； 與模型組比較，黑地黃丸組和黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α 蛋白表達減少（P＜0.05）； 與黑地黃丸組比較，黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織TGFβ、α-SMA 蛋白表達增加（P＜0.05）。結果表明，黑地黃丸可以下調CRF 大鼠腎組織中TGF-β、α-SMA 及HIF-1α 蛋白表達，而此效應會被IGF-1R阻斷劑JB1 所抑制。

圖3 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織TGF-β、α-SMA、HIF-1α 蛋白表達的影響（×200，±s，n＝3）Fig.3 Effects of Heidihuang Pills on the renal protein expressions of TGF-β，α-SMA and HIF-1α in CRF rats （×200，±s，n＝3）

3.5 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-β蛋白表達的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組大鼠腎組織IGF-1R 蛋白表達降低（P＜0.01），TGF-β 蛋白表達升高（P＜0.01）； 與模型組比較，黑地黃丸組和黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織IGF-1R蛋白表達升高（P＜0.05），TGF-β 蛋白表達降低（P＜0.05）； 與黑地黃丸組比較，黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織IGF-1R 表達降低（P＜0.05）。結果表明，黑地黃丸可以上調CRF 大鼠腎組織IGF-1R 蛋白表達，下調TGF-β 蛋白表達，而聯用JB1 后，可減弱黑地黃丸對腎組織IGF-1R、TGF-β 的調控作用。

圖4 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-β 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig.4 Effects of Heidihuang Pills on the renal protein expressions of IGF-1R and TGF-β in CRF rats （±s，n＝3）

3.6 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-βmRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠腎組織IGF-1RmRNA 表達降低（P＜0.05），TGF-βmRNA 表達升高（P＜0.05）； 與模型組比較，黑地黃丸組和黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織IGF-1RmRNA 表達均升高（P＜0.05），TGF-βmRNA 表達均降低（P＜0.05）； 與黑地黃丸組比較，黑地黃丸＋JB1 組大鼠腎組織IGF-1RmRNA 表達降低（P＜0.05），而TGF-βmRNA 表達升高（P＜0.05），見表5。結果表明，黑地黃丸能夠上調CRF 大鼠腎組織IGF-1RmRNA 表達，抑制TGF-βmRNA 表達，而聯用JB1 后，黑地黃丸對腎組織IGF-1R、TGF-βmRNA 表達的調控作用被抑制。

表5 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-β mRNA 表達的影響（±s，n＝3）Tab.5 Effects of Heidihuang Pills on the renal mRNA expressions of IGF-1R and TGF-β in CRF rats（±s，n＝3）

表5 黑地黃丸對CRF 大鼠腎組織IGF-1R、TGF-β mRNA 表達的影響（±s，n＝3）Tab.5 Effects of Heidihuang Pills on the renal mRNA expressions of IGF-1R and TGF-β in CRF rats（±s，n＝3）

注： 與空白組比較，＃P＜0.05； 與模型組比較，*P＜0.05； 與黑地黃丸組比較，▲P＜0.05。

組別IGF-1R mRNATGF-β mRNA空白組1.00±0.001.00±0.00模型組0.32±0.12＃1.94±0.76＃黑地黃丸組0.95±0.41*1.18±0.33*黑地黃丸＋JB1 組0.77±0.36*▲1.52±0.67*▲

4 討論

中醫學認為CRF 應歸于“腎勞” “癃閉” “水腫” 等范疇，其病程纏綿，且反復發作，根本病機當屬于脾腎虧虛，濕濁血瘀之證。黑地黃丸是針對CRF 病機特點而設制劑，主治脾腎不足證。課題組前期研究表明，黑地黃丸能夠通過調控氧化應激、微炎癥狀態以及鈣磷代謝等途徑提高大鼠腎功能，延緩CRF 進展［13-15］，證實了黑地黃丸在CRF中具有一定的治療潛力。

RIF 的病理改變主要為腎單位的進行性破壞，同時伴有大量成纖維細胞及肌成纖維細胞增生，細胞外基質產生堆積導致腎小球硬化，從而加重RIF，最終引起CRF［16］。因此，抑制RIF 的發展，對CRF 的治療有十分重要的意義。研究表明，TGF-β 是公認的體現腎纖維化的特效性指標，α-SMA 也被作為早期纖維化的標志，而HIF-1α 在RIF 的發展中具有重要的調節作用，三者是腎間質纖維化的重要指標［17-19］。本研究通過5/6 腎切除構建CRF 大鼠模型，結果顯示，CRF 大鼠Scr、BUN 水平升高，腎組織出現纖維化，TGF-β、α-SMA 和HIF-1α 表達升高； 使用黑地黃丸干預后，可以有效調節上述指標，改善CRF 大鼠腎功能。

IGF-1 是一類促進細胞生長，抑制細胞凋亡，具有胰島素樣代謝效應的因子，能夠刺激各種腎臟細胞生長，進而對腎損傷大鼠腎小管上皮細胞起到保護作用［20］。有研究報道，IGF-1 的缺失會導致高血壓小鼠進一步加重左室功能障礙和腎功能損傷［21］； 注射IGF-1 后能夠下調腎小管上皮細胞凋亡達38%，下調腎間質膠原沉積達44%，因此，IGF-1 是重要的腎臟保護性因子［22］。但也有學者持有不同的觀點，目前兩者的關系存在爭議［23］，IGF-1 在腎臟疾病發展過程中的作用及機制尚有待進一步研究。本研究發現，空白組大鼠腎小管間質僅少量表達HIF-1α、α-SMA 及TGF-β，而模型組大鼠腎小管間質中上述指標表達增多且與腎功能下降相平行； 同時發現IGF-1 表達增加和HIF-1α、α-SMA 及TGF-β 的表達成反比，使用IGF-1R 抑制劑并沒有使HIF-1α、α-SMA 及TGF-β 蛋白表達下調，且IGF-1 表達量與腎間質纖維化成反比，提示IGF-1 可能對損傷的腎上皮細胞起到了保護作用。其中黑地黃丸組IGF-1 表達升高，HIF-1α、α-SMA及TGF-β 表達均降低且與腎臟纖維化程度相平行，表明黑地黃丸能夠調控IGF-1 因子發揮腎臟保護作用。黑地黃丸是否能夠調控其他作用途徑改善腎纖維化，將是本課題將來探索的新方向。

綜上所述，本研究通過構建CRF 模型探究黑地黃丸對腎纖維化的影響，結果顯示黑地黃丸能夠通過上調IGF-1 表達，促進IGF-1 與IGF-1R 受體相結合，激活IGF-1 通路，抑制腎纖維化，緩解CRF 腎損傷。該結果初步證實了黑地黃丸在CRF中的治療作用，為后期臨床應用提供了實驗依據。