重樓皂苷Ⅰ凝結HepG2 細胞膜膽固醇增加阿霉素敏感性的研究

江 旻，陳李霞，洪 超，張立涓，路 璐，康 萍，趙文軍，丁 越，張 彤

（上海中醫藥大學，上海 201203）

膽固醇是細胞膜的必要組成成分之一［1］，其能影響細胞膜脂區的形成及膜蛋白的結構和功能［2］。膽固醇和脂質間的相互作用促進細胞膜上微結構域的形成，其中包括脂筏和膜微囊［3-4］。細胞膜上膽固醇的增加有助于脂筏的擴增，對脂區的功能及膜蛋白的表達有重要的影響，并可進一步改變細胞膜的通透性、流動性和韌性等［5-6］，調節參與腫瘤發生和癌癥進展的信號通路。研究證實，在對腫瘤細胞進行化療藥物治療過程時，異常聚集的膽固醇會降低細胞膜通透性［7］，減少藥物攝取，提高ABC 轉運蛋白水平［8］，增加藥物外排來抵抗化療藥物的治療敏感性。

重樓為百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖，有清熱解毒、消腫止痛之功效［9］。其中重樓皂苷Ⅰ為主要抗腫瘤活性成分，研究證明其對肝癌［10］、肺癌［11］、乳腺癌［12］等多種癌癥有較好的抑制作用。同時，有報道稱重樓皂苷Ⅰ可增加腫瘤細胞對化療藥物敏感性，如Song 等［13］研究發現重樓皂苷Ⅰ可增加HepG2 細胞對順鉑的敏感性；Zhu 等［14］研究發現重樓皂苷Ⅰ可增加MCF-7 細胞對鹽酸阿霉素的敏感性，以上研究表明重樓皂苷Ⅰ具有良好的改善化療藥物敏感性逆轉耐藥的前景，但其具體作用機制尚不明確。本研究將闡明重樓皂苷Ⅰ基于對細胞膜膽固醇的凝結作用，及其提高化療藥物敏感性的作用機制，以期為重樓皂苷Ⅰ抗腫瘤機制提供新的理論依據。

1 材料

1.1 細胞株 人肝癌細胞株HepG2 （編號SCSP-510），購于中國科學院干細胞庫，將HepG2 細胞加入含有10%FBS、100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素的MEM 培養基中，在37 ℃、5% CO2環境中培養。

1.2 藥物與試劑 重樓皂苷Ⅰ對照品、鹽酸阿霉素（doxorubicin hydrochloride，DOX） （上海源葉生物科技有限公司，批號 M29N11S132593、A25GS158731）。膽固醇（cholesterol，Chol） 對照品（上海艾韋特醫藥科技有限公司，批號B71154）； 總膽固醇檢測試劑盒（南京建成科技有限公司，批號20201128）； FillipinⅢ（美國MedChemExpress 公司，批號0604116）； 鬼筆環肽、Anti-ABCA1 抗體［艾博抗（上海） 貿易有限公司，批號GR3370348-1、GR3316971-7］； CTB-488 （美國賽默飛世爾科技公司，批號2291509）；增強型CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號031521211228）； DAPI 染色液（合肥白鯊生物科技有限公司，批號70120050）。

1.3 儀器 高效液相色譜儀（型號Agilent1100，美國安捷倫公司）； 激光共聚焦顯微鏡（型號CLSM，德國Leica 公司）； 多功能酶標儀（型號SpectraMax iD5，美國BioTek 公司）； 細胞流式儀（型號CytoFLEX，美國貝克曼庫爾特公司）； 電子透射電鏡（型號JEM-1230，日本JEOL 公司）；超凈工作臺（型號DL-CJ-IND-Ⅱ，北京東聯哈爾儀器制造有限公司）； CO2細胞培養箱 （型號Forma 3100，美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 方法

2.1 體外結合實驗 稱取重樓皂苷Ⅰ對照品1 mg 加入甲醇1 mL，配制成1 mg/mL 的溶液； 稱取膽固醇對照品100 mg 加入氯仿1 mL，配制成100 mg/mL 的溶液，備用。根據膽固醇、重樓皂苷Ⅰ摩爾比5 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2、1 ∶5，取200 μL 重樓皂苷Ⅰ溶液，加入5 μL 膽固醇溶液，充分混勻后，室溫下搖床振搖2 h，然后，8 000 r/min 離心5 min，取上清液檢測粒徑； 并采用高效液相色譜法檢測上清液中剩余重樓皂苷Ⅰ的含量，通過計算得到不同比例下重樓皂苷Ⅰ與膽固醇的結合率。

2.2 HepG2 細胞總膽固醇含量檢測 取對數生長期HepG2細胞混懸液2 mL，分別置于6 孔培養板中，每孔約1×106個，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，分別加入重樓皂苷Ⅰ（2、6 μmol/L）、洛伐他?。? μmol/L）、膽固醇（5 μmol/L），繼續培養24 h。棄去含藥培養基，用含EDTA 胰酶消化后，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，留細胞沉淀，用等滲緩沖液PBS 清洗1～2 次，1 000 r/min 離心10 min，細胞沉淀用PBS 重懸。取細胞重懸液2 μL 加入96 孔板中，加入200 μL 總膽固醇工作液，37 ℃孵育10 min，于510 nm 波長處檢測光密度（OD） 值。根據公式膽固醇量＝ （OD樣本-OD空白） / （OD校準-OD空白） ×校準品濃度，計算細胞中膽固醇含量。

2.3 Filipin Ⅲ試劑檢測細胞內總膽固醇變化 將培養好的HepG2 細胞鋪于激光共聚焦培養皿，每孔2×104個，培養24 h 后，加入重樓皂苷Ⅰ（2、6 μmol/L） 孵育24 h。棄去含藥培養基，用PBS 清洗2 ～3 次，加入鬼筆環肽抗體（1 ∶1 000） 孵育1 h，然后加入Filipin Ⅲ抗體（1 ∶1 000）孵育1 h，棄去含藥培養基，加入500 μL PBS，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2.4 透射電鏡觀察HepG2 細胞膜結構 將HepG2 細胞以每孔4×105個的密度接種于培養皿中，培養24 h 后，用不同濃度重樓皂苷Ⅰ（2、4、8 μmol/L） 處理24 h。用0.1 mol/L 二甲胂酸鈉緩沖液清洗細胞，1.5%戊二醛4 ℃固定2 h，再清洗3 次，1%四氧化鋨固定1 h，清洗2 次，用不同體積分數的乙醇（30% ～100%） 和100% 環氧丙烷脫水制備。將細胞浸潤并嵌入Agar-100 樹脂中，60 ℃加熱過夜硬化。制備超薄切片，并使用JeolJEM-1230 透射電子顯微鏡觀察細胞膜結構并獲取圖像［15］。

2.5 CTB-488 檢測細胞膜脂筏含量變化 將HepG2 細胞接種到激光共聚焦皿上，培養24 h 后，加入重樓皂苷Ⅰ（2、6 μmol/L） 孵育24 h，棄去原有培養基，每孔加入1 mL AF488-CTB （5 μg/mL），并將6 孔板置于冰上孵育20 min 以完成CTB-488 對細胞膜脂筏的標記。用滅菌PBS 清洗2 ～3次后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，再用滅菌PBS 清洗2～3次，于激光共聚焦顯微鏡下分別觀察各組熒光強弱情況。

2.6 免疫熒光染色檢測細胞膜脂筏及ABCA1 蛋白表達變化 將HepG2 細胞接種到激光共聚焦皿上，培養24 h 后，分為對照組、DOX 組（1 μmol/L）、DOX （1 μmol/L） ＋重樓皂苷Ⅰ （2 μmol/L） 組及Chol （5 μmol/L） ＋DOX（1 μmol/L） ＋重樓皂苷Ⅰ（2 μmol/L） 組，加入相應藥物于培養箱中培養24 h，棄去含藥培養基，用滅菌PBS 清洗2～3 次，每皿加入1 mL 4%多聚甲醛室溫固定10 min，加入0.5%Triton-100X 溶液透化細胞5 min，2%BSA 溶液封閉30 min，加入anti-ABCA1 一抗4 ℃孵育過夜，第二天回收一抗，加入Alex647-熒光二抗室溫孵育1 h，回收二抗，用PBS 清洗2～3 次。AF488-CTB 染色方法同上。于激光共聚焦顯微鏡下分別觀察各組熒光強弱情況。

2.7 Western blot 法檢測細胞膜ABCA1 蛋白表達 取對數生長期HepG2 細胞混懸液1 mL，接種于6 孔培養板中培養24 h，分別加入1 mL 不同濃度重樓皂苷Ⅰ（2、6 μmol/L）和DOX （2 μmol/L） 繼續培養48 h，棄去含藥培養基，用細胞刮刀收集細胞，冷PBS 洗滌2 次，收集至1 mL 離心管中，3 000 r/min 離心5 min，棄去上清，加入細胞裂解液和PMSF 混合液（100 ∶1） 100 μL，吹打均勻，冰上放置30 min 后，4 ℃、15 000 r/min 離心10 min，取上清液10 μL，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，剩余上清液加入1/5 總體積loading buffer，100 ℃加熱10 min，取出后于-20 ℃保存。通過常規Western blot 法檢測蛋白表達。

2.8 DOX 的吸收作用

2.8.1 激光共聚焦顯微鏡檢測 將HepG2 細胞接種于共聚焦培養皿中，培養24 h 后，分別給予重樓皂苷Ⅰ（2 μmol/L） 及游離膽固醇 （5 μmol/L） ＋重樓皂苷Ⅰ （2 μmol/L），孵育3 h，去除含藥培養基，PBS 清洗3 次，加入含DOX （1 μmol/L） 的培養基，孵育3 h，去除培養基，PBS 清洗3 次，加入不含血清培養基，于激光共聚焦顯微鏡下觀察DOX 熒光強弱。

2.8.2 細胞流式儀檢測 取對數生長期HepG2 細胞混懸液1 mL 接種于6 孔板中，培養24 h，分別給予重樓皂苷Ⅰ（2 μmol/L） 及游離膽固醇（5 μmol/L） ＋重樓皂苷Ⅰ（2 μmol/L），37 ℃孵育4 h，去除含藥培養基，PBS 清洗3次，加入含DOX （1 μmol/L） 的培養基，37 ℃孵育3 h，胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，棄去上清，PBS 清洗3次，加入1 mL PBS 重懸，轉移至流式管中，上機進行流式檢測。

2.9 CCK-8 法檢測細胞毒性 取對數生長期HepG2 細胞混懸液100 μL （約每孔1×104個細胞），接種于無菌96 孔培養板中，培養24 h 后，每孔分別加入100 μL 不同濃度的重樓皂苷Ⅰ、DOX 及DOX＋重樓皂苷Ⅰ組，另外再設Chol＋重樓皂苷Ⅰ組及Chol＋DOX＋重樓皂苷Ⅰ組（均加游離膽固醇5 μmol/L），繼續培養48 h，棄去含藥培養基，加入10 μL CCK-8 試劑及100 μL 無血清MEM 培養基，置于培養箱避光孵育1 h，在450 nm 波長處用酶標儀測定吸光度（A）值，并計算細胞存活率和IC50值，公式為細胞存活率＝（A樣品-A空白） / （A對照-A空白） ×100%。

2.10 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 重樓皂苷Ⅰ與膽固醇的體外結合反應 如表1、圖1A所示，在膽固醇、重樓皂苷Ⅰ為5 ∶1 的摩爾比下，上清液中幾乎檢測不到重樓皂苷Ⅰ成分，溶液中粒徑較小，表明重樓皂苷Ⅰ與膽固醇充分結合； 而隨著重樓皂苷Ⅰ的比重增加，結合率也逐步下降，溶液中粒徑增大，游離重樓皂苷Ⅰ含量增加，表明在膽固醇和重樓皂苷Ⅰ的不同摩爾比下，重樓皂苷Ⅰ可隨著膽固醇的含量增加與膽固醇充分結合，而膽固醇含量減少則結合反應減弱。同時，本研究還發現，重樓皂苷Ⅰ可與膽固醇形成凝膠狀固態物，見圖1B，推測其可能為兩者發生氫鍵結合反應形成非共價鍵的水凝膠分子，為兩者的結合反應提供進一步的佐證。

圖1 重樓皂苷Ⅰ與膽固醇的體外結合反應

表1 重樓皂苷Ⅰ與膽固醇體外結合后上清液中成分粒徑信息

3.2 重樓皂苷Ⅰ對HepG2 細胞膜膽固醇含量的影響 如圖2A 所示，重樓皂苷Ⅰ可有效降低細胞的總膽固醇含量（P＜0.05，P＜0.01），且與陽性藥物洛伐他?。↙ovastatin，Lova） 作用相當，且高濃度藥效更為顯著。如圖2B 所示，通過Filipin Ⅲ標記定位HepG2 細胞膽固醇分布，顯示綠色熒光即為與膽固醇結合的Filipin Ⅲ，紅色熒光即為與鬼筆環肽（Phalloidin） 結合的細胞膜骨架結構。對照組HepG2細胞膜上綠色熒光強度較強，細胞內分布較弱； 在重樓皂苷Ⅰ的作用下，細胞膜上的綠色熒光減弱，紅色熒光強度不變，濃度越大效果越明顯，表明重樓皂苷Ⅰ可使細胞膜上膽固醇含量明顯減少。

圖2 重樓皂苷Ⅰ對HepG2 細胞膜膽固醇含量的影響（±s，n＝3）

3.3 重樓皂苷Ⅰ對HepG2 細胞膜形態的影響 如圖3 所示，對照組HepG2 細胞表面膜質非常光滑，且外層有許多微絨毛，線粒體及內質網結構正常； 不同濃度重樓皂苷Ⅰ組細胞膜形態學發生改變，表面凹凸不平且隨著濃度的增加有不同程度的膜斷裂現象（如紅色箭頭所示），微絨毛脫落并在膜外形成特化結構，內質網腫脹及線粒體凋亡，表明在重樓皂苷Ⅰ的作用下，細胞膜通透性發生改變，降低了物質進出細胞的抵抗力，促進了化療藥物的滲透作用。

圖3 重樓皂苷Ⅰ對HepG2 細胞膜形態的影響

3.4 重樓皂苷Ⅰ對細胞膜脂筏及ABCA1 表達的影響 如圖4所示，綠色熒光為CTB-488 標記的細胞膜脂筏，紅色熒光為抗體標記的ABCA1 蛋白，藍色熒光為DAPI 標記的細胞核。DOX 組細胞膜脂筏及ABCA1 蛋白熒光強度無明顯變化，與對照組相似； DOX＋重樓皂苷Ⅰ組綠色及紅色熒光強度明顯減弱，表明重樓皂苷Ⅰ可結合細胞膜上膽固醇，從而降低膜上膽固醇含量，進一步影響細胞膜脂筏的形成及功能，在降低膜上脂筏含量的同時，能進一步影響到ABCA1 蛋白表達，對增加DOX 的敏感性具有一定積極意義； 而加入游離膽固醇后，重樓皂苷Ⅰ的作用被明顯抑制，脂筏及ABCA1 的熒光強度都有不同程度的恢復，推測重樓皂苷Ⅰ對細胞膜脂筏及ABCA1 的作用與細胞膜膽固醇含量密切相關。

圖4 重樓皂苷Ⅰ對細胞膜脂筏及ABCA1 表達的影響

3.5 重樓皂苷Ⅰ對細胞膜ABCA1 蛋白表達的影響 如圖5所示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅰ組ABCA1 蛋白表達降低（P＜0.05），且化療藥物DOX 無明顯作用（P＞0.05），表明重樓皂苷Ⅰ可有效降低ABCA1 蛋白在細胞膜上的表達，從而抑制藥物的外排作用。

圖5 重樓皂苷Ⅰ對細胞膜ABCA1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.6 重樓皂苷Ⅰ對化療藥物DOX 在HepG2 細胞中吸收的影響 DOX 自帶熒光表現為紅色熒光。如圖6 所示，在單獨給予DOX 時，HepG2 細胞內紅色熒光強度較弱，表明腫瘤細胞對DOX 的吸收較差； 但在重樓皂苷Ⅰ作用下，HepG2 細胞內紅色熒光增強，表明DOX 含量增加，重樓皂苷Ⅰ可起到促進DOX 吸收的作用，從而增加DOX 的療效。然而，在聯合用藥組中加入游離膽固醇后，DOX 吸收增加的作用被抑制，表明游離膽固醇可競爭性地與重樓皂苷Ⅰ結合從而抑制重樓皂苷Ⅰ對細胞膜膽固醇的作用，進而影響DOX 的吸收。

圖6 重樓皂苷Ⅰ對DOX 在HepG2 細胞中吸收的影響（±s，n＝3）

3.7 重樓皂苷Ⅰ對化療藥物DOX 在HepG2 細胞中敏感性的影響 如表2、圖7 所示，DOX 單藥的IC50值為（0.77±0.12） μmol/L，在DOX 中加入重樓皂苷Ⅰ后，DOX 的抗腫瘤活性提升，IC50值下降為（0.32±0.095） μmol/L，表明重樓皂苷Ⅰ可增加HepG2 對DOX 的敏感性。然而，在重樓皂苷Ⅰ及DOX＋重樓皂苷Ⅰ的聯合給藥組別中加入游離膽固醇后，重樓皂苷Ⅰ及聯合給藥組的細胞抑制率降低，表明重樓皂苷Ⅰ對DOX 的增敏作用與細胞膜膽固醇密切相關。

圖7 重樓皂苷Ⅰ對DOX 在HepG2 細胞中敏感性的影響

表2 各組藥物的IC50值

4 討論

肝癌是嚴重危害人類健康的主要惡性腫瘤之一，位居惡性腫瘤發病譜的第6 位，死亡譜的第4 位［16］。2018 年，我國肝癌新發病例數占全球46.6%，死亡病例數占全球47.1%［17］。我國作為肝癌高發國家，中晚期肝癌患者比例高，肝癌的高復發率和轉移率以及耐藥問題使其防控形勢異常嚴峻。目前，采用中西醫聯合治療肝癌在臨床上取得了較好的效果，特別是在增加化療藥物療效和提高敏感性方面有一定優勢。

目前，中藥活性成分在臨床腫瘤防治中越發重要，甾體皂苷作為中藥和天然藥物中一類重要的生物活性物質，大多存在于單子葉植物的百合科、石蒜科和薯蕷科等植物中，包括中藥知母、天冬、重樓等。甾體皂苷具有廣泛的生物活性，如抗腫瘤、降血脂、抗炎和調節免疫等作用［18］。重樓皂苷Ⅰ針對多種腫瘤細胞都具有良好抗腫瘤藥效，同時研究也表明其可增加各類化療藥物敏感性，提升化療藥物療效?；谡n題組前期對重樓皂苷Ⅰ降低腫瘤膽固醇含量的研究，及相關研究證實細胞膜上膽固醇降低可影響脂筏的形成及聚集，起到抗腫瘤以及逆轉耐藥等相關作用［19］。表明重樓皂苷Ⅰ具有良好的改善化療藥物敏感性，逆轉腫瘤細胞耐藥的前景，但其具體機制尚不明確，有待進一步研究。

脂筏為細胞質膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結構域。其中，膽固醇為促進脂筏形成的重要原料，去除細胞膜上膽固醇可改變與脂筏結合的膜成分的分布或功能［20］。脂筏在細胞膜表面可結合不同種類的蛋白如膽固醇結合蛋白及跨膜蛋白等，廣泛參與了細胞信號傳導及物質轉運等細胞事件。ABCA1 蛋白為細胞膜上ABC 轉運家族蛋白之一，它在促進膽固醇外流出細胞進而啟動逆向轉運的起始階段發揮重要的作用［21］。本實驗基于重樓皂苷Ⅰ與膽固醇的結合作用，發現其在體外可與膽固醇結合形成凝膠固態物，進一步探究了重樓皂苷Ⅰ對HepG2 細胞膜膽固醇的影響，發現其可通過與膜膽固醇形成復合物。重樓皂苷Ⅰ不僅增強了質膜的流動性和通透性，而且破壞了細胞膜上脂筏的分布，進一步抑制了ABC 轉運蛋白的表達和功能，使更多的DOX 到達細胞質或細胞核并增加對腫瘤細胞的敏感性。該結果為中藥活性成分與化療藥物聯合使用提供了新的研究思路，并為重樓皂苷Ⅰ的抗腫瘤機制提供了新的理論和實驗基礎。