基于主成分分析和灰色關聯度法的白及UPLC特征圖譜及不同商品規格等級質量研究*

楊曉東，鄧成程，楊文惠，王 玥，肖健平，聶 寰，張 妍，古楚瑩

（1.湖南一方天江藥業有限公司，湖南 常德 415000；2.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244）

白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.為蘭科多年生草 本植物，始載于《神農本草經》。其藥用歷史悠久，具有收斂止血、消腫生肌的功效[1]，臨床常用于咯血、外傷出血、瘡瘍腫毒等。白及主要分布于湖南、貴州、湖北、安徽等省份，其他各地均有少量栽培[2]。白及主要含有聯芐類、二氫菲類、菲類、聯菲類等成分[3-4]，為常用名貴藥材，市場需求巨大，野生資源十分匱乏[5]。市場上流通的白及大多為統貨，白及藥材商品規格等級標準亟待更新。

目前，市場中藥材等級規格劃分主要以性狀外觀來評價中藥材優劣[6-7]，是影響中藥材市場價格的重要因素。白及屬于塊莖類中藥材，在中藥材分級過程中常以重量大小為依據[8]，一般認為重量越大，質量越好，反之則較差。但有相關研究表明川芎、天麻、太子參等藥材指標性成分質量分數與大小成正相關[9-11]，白芍、桔梗等藥材指標性成分質量分數與大小無明顯相關性[10-11]，因此，僅通過藥材重量大小來劃分藥材等級較為片面，往往不能很好地反映中藥材的內在質量。中藥材商品規格等級劃分應綜合考慮成分等其他因素。

本研究以白及不同商品規格為研究對象，建立超高效液相色譜（UPLC）特征圖譜，結合主成分分析和灰色關聯度模型，旨在為白及的質量評價和規格等級的建立提供合理建議。

1 材 料

1.1 儀器 Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；SQP型萬分之一天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；SB25-12DTS型數控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試劑與試藥 1,4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯（批號：112061-202102，含量：95.5%）購自中國食品藥品鑒定研究院；甲醇為分析純，磷酸、乙腈為色譜純；水為超純水。

實驗室共收集16批白及藥材，經湖南一方天江藥業有限公司孫冬梅教授鑒定，均為蘭科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.的干燥塊莖[1]，且符合2020年版《中華人民共和國藥典》白及項下的各項規定。根據產地、市場和文獻調研將白及分為3個等級，詳細信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，5%A→18%A；4～10 min，18%A→28%A；10～16 min，28%A →40%A；16 ～20 min，40%A →55%A；20 ～22 min，55%A→55%A）；流速為0.35 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為280 nm；進樣量為4 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取1,4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯對照品適量，精密稱定，置于容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含1,4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯0.15 mg的對照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取白及藥材粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率：300 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 特征圖譜方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取白及藥材粉末（過三號篩，編號：S2），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6次，以4號峰為參照峰，各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取白及藥材粉末（過三號篩，編號：S2），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12 h進樣測定。以4號峰為參照峰，各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3.3 重復性試驗 取白及藥材粉末（過三號篩，編號：S2），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以4號峰為參照峰，各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重復性良好。

2.4 特征圖譜的建立及相似度評價 取16批白及藥材按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測。將色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012年版），設定S1為參照圖譜，自動匹配后多點校正，進行全譜峰匹配，生成疊加圖譜。（見圖1）共確認9個特征共有峰，通過與對照品比對，指認4號峰為1,4-二[4-（葡萄糖氧）芐基]-2-異丁基蘋果酸酯，以保留時間適中、峰面積較大的4號峰作為參照峰（S）[12]。（見圖2）相似度結果見表2。各批次樣品與對照圖譜的相似度均大于0.725，一等品白及和二等品白及之間的相似度為0.503～0.996，一等品白及與三等品白及之間的相似度為0.515～0.988，二等品白及與三等品白及之間的相似度為0.393～0.985，由此可見，不同商品規格等級間的白及存在一定的差異性。

圖1 16 批不同商品規格等級白及特征圖譜

圖2 特征圖譜共有峰的指認

表2 相似度結果

2.5 主成分分析 將16批白及樣品特征圖譜中的9個共有峰的峰面積/稱樣量導入SPSS 20.0軟件[13]，進行主成分分析，得出相關矩陣的特征值及其方差。（見表3）由表3可知，前2個成分的特征值大于1，即4.463和2.811，對總方差的累積貢獻率達80.817%，具有很好的代表性，可顯示白及特征圖譜共有峰的大部分信息。同時結合觀察碎石圖（見圖3）可知，圖中曲線有明顯拐點，說明前2個成分顯示出白及藥材間的大部分信息。成分矩陣見表4。由表4可知，第1主成分主要反映了白及特征圖譜峰2、峰4、峰5、峰6和峰8的信息，第2主成分主要反映了白及特征圖譜峰1、峰3、峰7和峰9的信息。

圖3 主成分分析碎石圖

表3 特征值及累積方差貢獻率

表4 主成分分析矩陣

采用SPSS 20.0軟件對上述主要成分載荷值進行分析，以各自主成分載荷向量除以各自主成分特征值的算術平方根得到主成分系數[14]，各主成分的線性模型如下：F1=-0.055X1+0.454X2-0.087X3+0.385X4+0.458X5+0.450X6-0.074X7+0.453X8-0.118X9；F2=0.390X1-0.058X2+0.548X3+0.233X4+0.009X5+0.080X6+0.545X7+0.119X8+0.410X9，F =0.496F1+0.312F2。其中，F1、F2分別表示第1、2個主成分得分，F表示綜合得分，X1～X9分別表示9個共有峰峰面積的標準化數據。計算后，得到各批白及樣品的綜合得分。（見表5）整體而言，一等品白及得分最低，三等品白及得分最高。

表5 綜合得分排序

2.6 灰色關聯度 為了進一步探究不同商品規格等級白及的質量差異，采用灰色關聯度分析法對不同商品規格等級白及進行質量評價。設有m個總樣本，每個樣本n個評價指標，由此組成的一個評價單元序列｛Xik｝（i=1、2、3、4…m；k=1、2、3、4…n；在本研究中i=16，k=9）。

2.6.1 標準化處理 由于樣本不同指標之間量綱不統一，故需對原始數據進行變換處理[15]，處理公式為Yik=Xik/Xk（Yik為標準化處理后的數據，Xik為原始數據，Xk為第m個樣品第k個指標的均值）。

2.6.2 關聯系數的計算 灰色關聯度最優參考序列和最差參考序列[16]分別為｛XSK｝和｛Xtk｝（k=1，2，3…n）。計算各評價單元相對于最優、最差參考序列的關聯系數。

相對于最優參考序列的關聯系數計算公式如下：

式中，Δmin=min|Yik-Ysk|，Δmax=max|Yik-Ysk|，（i=1，2，3…m）；ρ為0.5。相對于最差參考序列的關聯系數計算公式如下：

式中，Δ'min=min|Yik-Ytk|，Δ'max=max|Yik-Ytk|，（i=1，2，3…m），Ytk為各個成分對應Yik的最大值；ρ為0.5。

2.6.3 關聯度和相對關聯度的計算 相對于最優參考序列的關聯度為：

相對于最差參考序列的關聯度為：

評價單元的相對關聯度計算公式如下：

根據相對關聯度的大小對評價單元序列進行排序，得到質量排序結果[17]。結果見表6，不同商品規格等級的白及存在差異性，整體而言，三等品白及得分最高，一等品白及得分最低。

表6 不同商品規格等級白及相對關聯度

3 討 論

本研究采用梯度洗脫，在前期實驗中對比了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動相，最終選定乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。在上述條件下，色譜峰分離度和理論板數等均較好。本研究通過單因素試驗系統考察了提取溶劑、提取方法及提取時間對整體色譜峰的影響。當溶劑為80%甲醇、料液比為1∶50（g/mL）、超聲時間為30 min時，提取效率和峰型較好，故選擇上述方法作為白及藥材的提取方法。

中藥指紋/特征圖譜等多指標成分整體質量控制已成為中藥質量控制必然發展趨勢[18-19]?；瘜W模式識別的方法與指紋/特征圖譜分析相結合，能準確判斷白及不同商品規格等級之間的差異，可以作為初步判斷中藥材質量優劣的判別標準[20]。本研究以白及藥材特征圖譜的9個共有峰為指標，對比相似度可知不同商品規格等級的白及間存在明顯差異，結合主成分分析與灰色關聯度對不同商品規格等級的白及樣品進行質量評價研究。結果顯示三等品白及得分最高，質量最好，一等品白及得分最低，質量最差。原因可能與白及的生長方式有關，不同年份的白及通過分叉莖連接，上一年生的白及需要為后續白及生長提供部分營養[21]。另一方面隨著社會的進步，農業的發展，現在中藥材生產中存在不科學施用化肥、激素、農藥等促進藥材高產的現象，導致藥材性狀發生顯著變化，體現為中藥材個頭增大、種植年限縮短。但中藥材也不能單以重量較小的入藥，容易造成藥材資源浪費的同時還會降低農民種植的積極性，不利于中藥行業的健康發展。因此，需要對白及的大小、采收時間和藥材質量等多個方面進行綜合考量，以期為白及藥材的質量控制及種植采收提供理論指導，而且對于白及規范化種植、提升藥材質量和臨床療效也有積極的意義。