復方石榴皮藥膜對金黃地鼠皮脂腺斑形態學及雄激素受體表達的影響*

張娟娟，朱飛云，吳淑輝，謝小麗，楊逸璇，朱明芳

（1.湖南中醫藥大學附屬第二中西醫結合醫院，湖南 瀏陽 410300；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

痤瘡是一種毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性疾病，患病年齡段覆蓋兒童到中年兩極[1]，其中青少年發病率最高。痤瘡好發于面、胸背等皮脂分泌旺盛部位，愈合后易遺留凹陷性或增生性瘢痕，具有損容性。痤瘡病因機制復雜?；颊哌M入青春期后腎上腺及性腺的發育導致雄激素分泌增加。刺激皮脂腺功能增強，皮脂分泌增加是公認的痤瘡發生發展的重要病理生理基礎[2]。因此，減少雄激素分泌，抑制皮脂腺功能的亢進，調控皮脂穩態是治療痤瘡的重要思路和手段。近年來，較之西藥外用藥物，中藥外治以其簡便效廉，不良反應小，患者接受程度高，臨床應用前景廣闊[3]，在輕中度痤瘡治療中的地位愈發凸顯，是國內外研究的重點[4]。

復方石榴皮藥膜由石榴皮、桑葉、荷葉、茉莉花、紫蘇葉、綠茶組成，具有清熱解毒、祛脂化濁、消腫祛瘀功效。前期臨床觀察發現，將上藥制成中藥粗粉后清洗痤瘡患者面、胸背部皮膚，能明顯改善皮膚油膩感，減少皮脂分泌，增強祛痘療效。本研究旨在探究復方石榴皮藥膜對金黃地鼠痤瘡模型的治療作用及對雄激素受體（AR）表達的影響，以期為臨床使用提供依據。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF級雄性金黃地鼠15只，7周齡，體質量110～130 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2021-0011。實驗單位使用許可證號：SYXXK（湘）2020-0015。飼養條件：所有實驗動物同一飼舍內分籠圈養，12 h光照及12 h黑夜并保持20 ℃恒溫的人工環境中喂養標準飼料，適應性飼養1周后開始實驗。本研究經湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司動物倫理委員會審查批準，審批號：IACUC-2021（5）037。所有操作均嚴格遵循實驗動物管理相關規定。

1.2 藥物與試劑 復方石榴皮藥膜由石榴皮、桑葉、荷葉、茉莉花、紫蘇葉組成，以上中藥飲片由安徽盛海堂中藥飲片有限公司生產，批號分別為2021101081、2021100375、2021100545、2021110375、2021110541。中藥經瀏陽市中醫醫院中藥師謝宗明鑒定為正品。研極細粉后過120目篩，制成生藥粉劑，各組分通過篩選取得最佳配比，混勻瓶裝，備用。綠茶（長沙縣金井茶廠出品，食品生產許可證：SC11443012100294）。0.025%維A酸乳膏（商品名：迪維，規格：15 g/支，國藥準字：H50021817，重慶華邦制藥有限公司）。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（珠海貝索生物技術有限公司，批號：718091）；AR抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號：P10275）；通用二步法試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：SP-9000）。

1.3 主要儀器 正置熒光顯微鏡（日本Olympus光學工業株式會社，型號：奧林巴斯BX53）；全封閉式組織脫水機（達科為[深圳]醫療設備有限公司，型號：HP300）；輪轉石蠟切片機（徠卡顯微系統[上海]貿易有限公司，型號：RM2235）；生物組織攤烤片機（武漢漢谷醫療科技有限公司，型號：HK-4）；生物組織石蠟包埋機（孝感市亞光醫用電子技術有限公司，型號：YB-8LF）；全自動免疫組化染色儀（德國徠卡儀器有限公司，型號：Bond-Max）；冰箱（青島海爾股份有限公司，型號：BCD-226SKA）；游標卡尺（上海量具刃具廠，規格：0～200 mm）；強光手電（深圳市神火照明有限責任公司，型號：C8-XPE）。

2 方 法

2.1 分組與給藥 15只受試動物隨機分為空白組、陽性對照組（0.025%維A酸乳膏組）、藥膜組，每組5只?？瞻捉M外涂蒸餾水，不予任何藥物處理。陽性對照組外涂0.025%維A酸乳膏，1 mL/次，給藥后予遮光措施處理以防止藥物見光分解。藥膜組，每次使用時取10 g生藥粉末以綠茶茶汁調制成藥膜，將泥膏狀藥膜涂抹于無菌敷料上，2 mL/次，通過醫用無紡布貼固定到金黃地鼠皮脂腺斑處，30 min后洗去。各組給藥方法均為外用，給藥部位為雙側皮脂腺斑處，2次/d，連續用藥28 d。

2.2 觀察指標

2.2.1 皮脂腺斑面積大小 干預開始后第0、14、28天，剃毛器剃除皮脂腺斑及周圍皮膚毛發后，使皮脂腺斑充分暴露，金黃地鼠取俯臥位，在強光照射下，用照相機以同一焦距記錄皮脂腺斑大體照片，游標卡尺分別測量并記錄左、右兩側皮脂腺斑的最大橫徑（transverse diameter，DT）mm、最大縱徑（longitudinal diameter，DL）mm，以DT×DL值計算皮脂腺斑面積，取兩側皮脂腺斑面積大小之和進行觀察比較。

2.2.2 皮脂腺斑組織病理學 末次給藥24 h后，剪取金黃地鼠左側皮脂腺斑組織，放入10%甲醛固定液固定，經脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，鏡下觀察皮脂腺斑組織學形態變化。參考文獻修訂皮脂腺斑厚度變化的計算標準[5-6]：皮脂腺體積無明顯變化，厚度較厚，重疊腺葉數0葉（-）；皮脂腺體積略有減小，厚度稍變薄，重疊腺葉數1葉（+）；皮脂腺體積有所縮小，厚度變薄，重疊腺葉數2～3葉（++）；皮脂腺體積顯著縮小，厚度顯著變薄，重疊腺葉數≥4葉（+++）。

2.2.3 免疫組織化學測量AR值 免疫組化AR陽性表達判定標準：染色區域為皮脂腺細胞核或細胞質中顯示棕黃色顆粒。每張切片選取3個具有代表性的高倍視野（×200），根據染色呈陽性皮脂腺細胞的分布情況劃分為：未見陽性細胞或者陽性細胞比例＜10%為陰性（-）；陽性細胞所占比例10%～≤25%為弱陽性（+）；陽性細胞所占比例＞25%且≤50%為陽性（++）；陽性細胞所占比例＞50%為強陽性（+++）。參考文獻制定計數轉換標準[6]：（-）=0，（+）=1，（++）=2，（+++）=3。

2.3 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。計量資料若符合正態分布，采用“均數±標準差”（±s）表示。重復測量計量資料采用重復測量方差分析。3個及以上獨立組的比較采用單因素方差分析，若滿足方差齊性，兩兩比較采用LSD法，若不滿足方差齊性，則采用塔姆黑尼法。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 各組金黃地鼠皮脂腺斑面積比較 第28天，肉眼觀察可見陽性對照組、藥膜組金黃地鼠的皮脂腺斑大體上小于空白組。第0天，空白組、陽性對照組、藥膜組皮脂腺斑面積比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。3組金黃地鼠皮脂腺斑面積總體比較，差異無統計學意義（P＞0.05），即組間效應不明顯。所有金黃地鼠皮脂腺斑面積在不同時間點比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在時間效應。3組金黃地鼠接受不同干預方法和時間之間存在交互效應（P＜0.05），即隨時間的延長，空白組和陽性對照組、藥膜組皮脂腺斑面積大小變化趨勢不同。隨著時間變化，空白組皮脂腺斑面積逐漸增大，陽性對照組和藥膜組皮脂腺斑面積先增大后縮小。陽性對照組第28天與第14天比較，皮脂腺斑面積減小，差異有統計學意義（P＜0.05）。藥膜組第14天、第28天分別與給藥前比較，皮脂腺斑面積減小，差異均有統計學意義（P＜0.05）。第28天，藥膜組與陽性對照組皮脂腺斑面積比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。（見圖1～2、表1）

表1 3 組金黃地鼠皮脂腺斑面積比較 （±s，mm2）

表1 3 組金黃地鼠皮脂腺斑面積比較 （±s，mm2）

組別 n 第0天 第14天 第28天 F P空白組 5 90.30±13.21 103.02±9.90 123.47±17.04 7.464 0.008陽性對照組 5 88.66±20.88 112.91±4.80 98.05±6.23 4.502 0.035藥膜組 5 93.29±11.00 122.40±10.58 112.11±10.87 9.359 0.004 F 0.113 6.089 5.442 P 0.894 0.015 0.021

圖1 給藥28 d 各組金黃地鼠皮脂腺斑大體圖

圖2 皮脂腺斑面積交互效應輪廓圖

3.2 各組金黃地鼠皮脂腺斑組織形態及厚度比較 第28天，空白組皮脂腺腺體體積大，數量多，呈多層分葉狀，排列厚且緊密整齊；陽性對照組皮脂腺腺體體積與空白組對比明顯變小，厚度較空白組明顯變薄，腺葉數減少，排列松散；藥膜組皮脂腺腺體體積明顯減小，部分腺體萎縮，分葉狀結構較空白組減少，厚度較空白組明顯變薄，排列明顯疏松，個別視野有液化小囊形成。與空白組比較，陽性對照組及藥膜組皮脂腺斑厚度明顯變薄，差異均有統計學意義（P＜0.05）；陽性對照組與藥膜組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖3、表2）

表2 第28 天各組金黃地鼠皮脂腺斑厚度、AR 比較（±s）

表2 第28 天各組金黃地鼠皮脂腺斑厚度、AR 比較（±s）

組別 n 皮脂腺斑厚度/mm AR空白組 5 2.60±0.55 2.40±0.55陽性對照組 5 1.60±0.55 1.20±0.45藥膜組 5 1.00±0.71 0.60±0.55 F 8.909 15.750 P 0.004 0.000

圖3 第28 天各組金黃地鼠皮脂腺斑病理變化比較（HE 染色）

3.3 各組金黃地鼠皮脂腺斑表達AR比較 第28天，免疫組織化學染色結果顯示，AR陽性區域為皮脂腺細胞核。與空白組比較，陽性對照組及藥膜組AR表達減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）；陽性對照組與藥膜組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖4、表2）

圖4 第28 天各組AR 免疫組化染色結果

4 討 論

痤瘡是累及毛囊皮脂腺單位的慢性炎癥性皮膚病，好發于面、胸背等皮脂分泌旺盛部位。皮脂腺產生的脂類混合物稱為皮脂，痤瘡發病的重要因素是皮脂生成增多、含量增加，皮脂成分改變[7-8]。皮脂的分泌與雄激素調控的皮脂腺功能密切相關。調節雄激素水平，抑制皮脂腺功能亢進，維護皮脂穩態在痤瘡防治中具有重要作用。目前外用較廣泛的維A酸類藥物、抗生素類藥膏，因其容易導致皮膚干燥、灼熱等不良反應及產生耐藥性，一定程度上限制了其使用。因此，迫切需要開發天然安全無毒的中藥抑脂祛痘產品解決痤瘡患者油脂分泌過多的煩惱，為臨床治療痤瘡提供新的手段。

中醫外治專著《理瀹駢文》提出：“外治之理，即內治之理，外治之藥亦即內治之藥。所異者，法耳?！痹撚^點為中醫外治法提供了理論依據。朱明芳教授跟師湖湘中醫皮病取象論治學派創始人歐陽恒教授十余年，學派取象論治法則之一的“以皮治皮”法是歐陽恒教授的主要臨證學術思想。朱明芳教授盡得其傳，臨床運用以皮類中藥石榴皮為主的組方外治于面部痤瘡，在調控皮脂穩態方面收效頗佳[9-11]。復方石榴皮藥膜組方以石榴皮為主藥，均為常見的藥食同源花葉類植物，藥性溫和無毒，使用安全。方中石榴皮，性味酸澀，具有收斂止血殺蟲之效。課題組前期研究發現石榴皮有效成分石榴皮多酚具有抑制痤瘡丙酸桿菌活性、抗瘢痕、抗金黃地鼠皮脂腺斑增生、調控皮脂穩態失衡的作用[12-14]。荷葉味苦、澀，性平，清暑利濕，升發清陽，涼血止血；桑葉性偏涼，味甘、苦、寒，有疏風清熱解毒、涼血止血等功效。桑葉、荷葉可加強脂質代謝，增強脾胃運化，以清熱解毒化濁增強療效[15]。茉莉花味辛、甘，性溫，具有解毒消腫、活血散瘀等效。紫蘇葉辛、溫，主解表、行氣、和血。兩藥氣味芳香，合用可明顯改善機體糖代謝[16]?，F代研究顯示桑葉、荷葉、茉莉花、紫蘇葉均具有降脂、抑菌、抗病毒、抗炎、抗敏等作用[17-20]。綠茶汁液治療痤瘡效果顯著，對面部痤瘡細菌具有抑制作用且作用隨著汁液濃度的增加而增強[21]。

痤瘡在中醫學屬“肺風粉刺”“面皰”等范疇?！锻饪普凇费裕骸胺鄞虒俜巍偨匝獰嵊魷簧??！薄端貑枴ぶ琳嬉笳撈分^“諸痛癢瘡，皆屬于心”。肺主皮毛，心主血脈。疏解客于皮毛的外邪、清解郁于心血的火熱之邪是從臟腑辨證的角度分析論治痤瘡的依據。本研究組方中的皮類藥石榴皮以皮治皮，以皮走皮，引藥直達病所?；?、葉類藥茉莉花、桑葉、荷葉、紫蘇葉質輕味辛，輕揚浮散、能宣能透，具有輕疏靈動之性。輕者，輕解升清；疏者，疏動氣機，和調氣血。且辛散藥物具有加強外用藥物滲透的作用[22]。全方皮、花、葉合用，用于治療好發于面部肌膚的痤瘡療效明顯，可達宣暢、解毒、化濕、泄濁、散瘀之功。

金黃地鼠側腹部皮脂腺斑是目前公認的可作為研究皮脂腺增生活性的較理想的動物模型[23]。皮脂腺斑的真實體積大小變化與藥物的作用強弱呈較好的相關性[24]。本實驗結果顯示，陽性對照組、藥膜組用藥后金黃地鼠皮脂腺斑面積縮小，藥膜組與陽性對照組金黃地鼠皮脂腺斑面積大小相當。組織病理學觀察顯示，復方石榴皮藥膜干預能使金黃地鼠皮脂腺體積減小、厚度變薄、腺體層數減少、腺體萎縮等組織結構改變，提示復方石榴皮藥膜對皮脂腺功能有抑制作用。

AR由配體結合結構域、核酸結合結構域和N端調控結構域組成，屬于類固醇/核受體超家族[25]。AR可刺激皮脂腺皮脂過分泌，在調節皮脂分泌中起重要作用。AR能促進痤瘡炎癥反應的發生和發展[26]，但具體機制尚不明確，可能與其調節成纖維細胞生長因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）的活性，使皮脂腺的分泌處于平衡有關[27]，也可能與其增加皮脂固醇調節元件結合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs）的表達，刺激皮脂腺的皮脂分泌等因素有關[28]。因此，局部抑制雄激素受體可能是一種治療痤瘡有效的方法。本實驗結果顯示，復方石榴皮藥膜外敷于金黃地鼠皮脂腺斑后雄激素受體表達量降低，故局部雄激素受體一定程度上受到抑制，進而對皮脂腺細胞產生抑制作用減少了皮脂分泌從而達到治療效果。

綜上所述，復方石榴皮藥膜對金黃地鼠痤瘡模型治療效果確切，能有效減輕病理損傷，抑制皮脂腺增生。其作用機理可能與其抑制雄激素受體表達相關。