塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎功能的改善和保護作用

曹瑞珍，尹美珍，張國文，張樹軍，喬 偉

（內蒙古民族大學醫學院，內蒙古 通遼 028043）

近年來，隨著經濟的發展，快節奏的生活、長期的熬夜和不合理飲食等諸多因素，使2 型糖尿病的發病率逐年升高，且趨于年輕化。2019 年公布的數據顯示，全世界約有4.63 億糖尿病患者，其中，中國約占1/4［1］。2型糖尿病患者，隨著病情的進展，前期的胰島素抵抗和后期胰島素分泌不足，使細胞對血糖利用障礙，葡萄糖在血液堆積引起血糖升高，進而引起脂代謝紊亂，引起患者血脂升高［2］。高糖高脂和胰島素抵抗還可引起組織細胞氧化應激反應加強，全身血管神經損害，導致各種并發癥［3］，如糖尿病腎病、眼底病變、心腦及下肢血管病變等，而糖尿病腎病在終末期腎病患者中的百分比例逐年升高，需要引起大家足夠的重視。

中蒙藥在治療糖尿病方面有其獨特的優勢，對糖尿病患者肝腎損傷的預防和治療也有豐富的經驗［4-5］?，F代研究表明，中蒙藥大多是通過其有效成分如類胰島素、黃酮類、多糖類、生物堿類等促進細胞對血糖的攝取、降低氧化應激損傷等途徑而控制血糖和調節血脂等，同時利用這些活性物質清除自由基等達到抗氧化、保護肝腎等器官的目的［6-8］。

塔本文都蘇方劑由黃精、玉竹、天冬、刺蒺藜和天花粉組成，每味藥有相似活性成分，也有自己獨特成分，這些活性成分或有抗氧化、調血脂功能，或有降糖功能等，組成方劑后功能互補，作用得到加強［7-8］，通過這些作用最終使肝腎等組織器官得到保護。本實驗目的是建立糖尿病腎病小鼠模型，考察塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1.5～2 月齡C57BL/6J 雄性小鼠70 只，SPF 級，體重18～22 g，購于吉林省億斯實驗動物技術有限責任公司［SCXK-（吉）2018-0007］［8］。環境溫度24 ℃左右（空調），濕度50%左右。

1.2 主要試劑與儀器

塔本文都蘇各組方由內蒙古民族大學蒙醫藥學院教師鑒定，從通遼市中醫院購買［8］。轉化生長因子β1（TGF-β1）多克隆抗體（上海谷研實業有限公司，批號：GOY-667）；鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，sigma公司，批號：13071275422）；基底膜六胺銀染色液（北京雷根生物技術有限公司，批號：DZ0050）；活性氧（ROS）試劑盒（批號：20190825）、肌酐（CRE）試劑盒（批號：20190920）、尿素氮（BUN）試劑盒（批號：20190821）、尿微量白蛋白（mAlb）試劑盒（批號：20190924）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號：20190815）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20190809）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號：20190912）和考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒（批號：20190927）均購自南京建成生物工程研究所。

RE-52A型旋轉蒸發器（上海亞索生化儀器廠）；DY-89-1型電動玻璃勻漿機（寧波新芝生物技術公司）；羅氏活力型血糖儀（德國羅氏公司）；ZS-2型自動板式酶標儀（京航宇浪琴設備公司）；奧林巴斯BX-41型顯微鏡（日本olimpus公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 TBWDS提取液的制備

取TBWDS 方劑400 g，20目粗粉，用75%乙醇2.40 L，浸泡10余小時，回流提取，并重復2次，將提取液合在一起，乙醇充分回收，用蒸餾水溶解，最后定容至1.25 L，配成每毫升含生藥0.32 g，按每星期的藥量分裝，4 ℃冰箱冷藏［8］。

1.3.2 動物模型的建立及分組

70只小鼠按體重隨機分為正常對照組10只和糖尿?。―M）組60只，適應性飼養7 d后，DM組不進食24 h，然后以0.08 g/kg劑量連續腹腔注射STZ（溶解在檸檬酸緩沖液，酸堿度4.5）2 d，5 d后斷尾取血，用血糖儀測定空腹血糖濃度，大于11.1 mmol/L的小鼠為DM小鼠（成功46只）。對正常對照組小鼠繼續常規飼料飼養，DM小鼠改為高脂高糖飼料飼養，30 d后測定24 h尿蛋白≥30 mg者則認為糖尿病腎病造模成功（43只）［8-9］。

將DN 小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組和TBWDS 高劑量組、TBWDS 低劑量組，每組10只，每日按1 mL體積灌胃治療，TBWDS高、低劑量組小鼠分別給與8 g/kg和4 g/kg TBWDS提取物，二甲雙胍組小鼠給與30 mg/kg的二甲雙胍，模型組和正常對照組小鼠均給與等量蒸餾水［8］。正常對照組依舊常規飼料飼養，其余組繼續高脂高糖飼料飼養。

1.3.3 標本采集

12周后對小鼠進行實驗標本的采集和制備。（1）處死前1 d，用尿液收集器收集小鼠24 h尿液，離心后上清液分裝保存于4 ℃冰箱；（2）用斷頭取血法采集小鼠血液，制備血清，按組4 ℃保存以備用；（3）處死后，立即解剖取腎，將部分腎皮質置于4%多聚甲醛中固定；（4）其余腎組織快速用冰冷的生理鹽水漂洗，并拭干水稱重，用生理鹽水于電動勻漿機中制成10%勻漿，離心后取上清液，-20 ℃保存備用。

1.3.4 標本生化指標檢測

取出保存的血清、尿液和腎勻漿液，分別按照試劑盒說明書，檢測各項指標。（1）采用全自動生化分析儀對血UA、BUN、Scr含量進行測定，用ELISA法測尿mAlb含量。（2）取-20 ℃保存的各組腎組織勻漿上清液，按照試劑盒操作說明，用ELISA法測ROS含量，比色法測定MDA、SOD和GSH-Px的水平。

1.3.5 觀察腎組織病理學改變及TGF-β1表達量

（1）將各組固定24 h的腎組織取出，常規制作5 μm的石蠟切片，并分別行基底膜黏多糖六胺銀染色和HE染色，光鏡下觀察腎組織的病理學改變。（2）將上述制備的各組腎組織石蠟切片，常規脫蠟至水，按照TGF-β1免疫組化檢測試劑盒進行抗原修復，過氧化氫酶阻斷，山羊血清封閉，兔抗TGF-β1多克隆抗體孵育，緩沖液洗滌，羊抗兔二抗孵育，鏈霉親合素-生物素復合物（SABC）標記；二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，常規脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照，檢測小鼠腎皮質TGF-β1的表達。

1.4 統計學方法

各組數據用xˉ±s表示。用SPSS20 軟件單因素方差分析及t檢驗進行組間比較，P＜0.05 和P＜0.01分別表示有顯著、極顯著差異。

2 結果

2.1 塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠血清UA、BUN、Scr及尿mAlb的影響

模型組與正常對照組比較，小鼠血清Scr、BUN和UA濃度以及尿mAlb含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，TBWDS高、低劑量組的血清Scr、BUN和UA濃度以及尿mAlb含量均顯著降低（P＜0.01），且與二甲雙胍組比較無明顯差異。結果見表1。

表1 各組小鼠血清UA、BUN、Scr及尿mAlb的比較Tab. 1 Comparison of serum UA，BUN，Scr and urine mAlb of mice in each groupxˉ±s，n=10

2.2 塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎組織氧化及抗氧化指標的影響

模型組與正常對照組比較，小鼠腎組織GSHPx、SOD 活性下降，而ROS、MDA 水平升高，有明顯差異（P＜0.01）；與模型組比較，TBWDS 高、低劑量組和二甲雙胍組的小鼠腎組織GSH-Px、SOD 活性均顯著上升（P＜0.01），而ROS、MDA 水平均明顯降低（P＜0.01）；TBWDS 高、低劑量組與二甲雙胍組比較，GSH-Px、SOD 活性均無統計學差異，但TBWDS 低劑量組在降低ROS、MDA 水平方面不如二甲雙胍組（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組小鼠腎組織GSH-Px、SOD、ROS及MDA的比較Tab. 2 Comparison of GSH-Px，SOD，ROS and MDA in kidney tissues of mice in each groupxˉ±s，n=10

2.3 塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎組織的影響

圖1為各組小鼠腎組織HE染色結果，光鏡下可見正常對照組腎組織中腎小體和腎小管結構清晰且較完整。模型組腎小管結構不規整，腎小管上皮細胞腫脹、有空泡，甚至細胞游離部的胞質和胞膜脫落；腎小球內毛細血管結構明顯減少，系膜細胞增生，嗜酸性的基質明顯增多，腎小囊擴張。與模型組比較，二甲雙胍組和TBWDS提取液高劑量組的腎組織結構改善較為明顯。

圖1 各組小鼠腎組織HE染色的光鏡照片Fig.1 Light microscope photos of HE staining in kidney tissue of mice in each group

各組小鼠腎組織六胺銀染色呈棕黃至棕黑色，可顯示腎小球系膜和基底膜以及腎小囊和腎小管的基底膜，見圖2。光鏡下明顯可見，模型組較其余各組小鼠腎小球系膜和基底膜染色重。正常對照組小鼠的腎小球內血管、基底膜、系膜基質結構清晰，而模型組呈現彌漫性腎小球系膜基質區增寬，基質增多，基底膜明顯增厚，球內血管管腔狹窄。二甲雙胍組和TBWDS 提取物高、低劑量組的腎小球內結構明顯改善，球內系膜和基底膜僅見局灶性改變，其中，二甲雙胍組和TBWDS提取物高劑量組改善最為明顯。

2.4 塔本文都蘇提取物對糖尿病腎病小鼠腎組織中TGF-β1蛋白表達的影響

TGF-β1在機體的腎臟細胞中都有廣范表達。TGF-β1免疫組化染色呈棕黃至棕黑色。圖3顯示，各組腎組織中腎小體、腎小管以及腎間質均呈陽性染色，但與正常對照組比較，模型組的腎小體、腎小管以及腎間質的染色均明顯加深，而二甲雙胍組和TBWDS提取物高、低劑量組的各部位染色則明顯較模型組的染色淺，尤其是二甲雙胍組和TBWDS提取物高劑量組染色更淺。這些結果表明，模型組腎組織細胞中TGF-β1表達明顯增強，而二甲雙胍組和TBWDS提取物可降低腎組織細胞中TGF-β1的表達。

圖3 各組小鼠腎組織TGF-β1免疫組化染色的光鏡照片Fig.3 Light microscope photos of immunohistochemical staining of TGF-β1 in kidney tissue of mice in each group

3 討論

糖尿病腎?。―N）從早期病變逐漸發展到腎衰竭，以往大家認為，DN的早期病變發生在腎小球，但現在越來越多的研究發現，腎小管病變不僅具有獨立性且病變的程度與腎功能的相關性更為密切，無論從發病時間上還是發病機制上均具有獨立性［10］。本實驗的病理學觀察結果顯示，DN模型組小鼠的腎小球結構以及腎小管上皮細胞的損傷較為嚴重，而TBWDS提取物能明顯改善腎組織的損傷。

活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）是多種氧自由基統稱，少量的ROS具有免疫和信號轉導作用［11］，但過多的ROS 會破壞人體的組織細胞，而高血糖、高血脂、缺血等會刺激ROS 的產生，引起組織細胞損害［12-13］；ROS還可作為類似于第二信使，激活多種信號轉導通路，TGF-β1通路就是其中最重要的一個［14］。ROS使TGF-β1表達增加，而TGF-β1促進腎間質纖維化［15］。本實驗通過分子生物學和形態學結合的手段，觀察到糖尿病腎病模型組小鼠的腎小球、腎小管以及腎間質部位的TGF-β1表達明顯增強，這就意味著隨病情的發展，不僅出現腎小球纖維化，腎間質也發生了纖維化。TGF-β1反過來又可刺激ROS的產生，從而加劇腎臟的損傷［16］。TBWDS提取物能明顯降低腎組織ROS含量并降低TGF-β1的表達，表明其具有抗氧化、保護腎組織纖維化的作用。

高糖高脂環境刺激下，機體產生的大量氧自由基使脂質過氧化產生MDA，同時降低SOD、GSH-PX的活性，使后兩者清除氧自由基和過氧化物的能力不足，MDA堆積，進一步引起腎組織損傷［17］。本研究結果顯示，TBWDS 提取物高、低劑量組的SOD、GSH-PX 活性較模型組升高明顯，MDA 明顯降低，說明TBWDS提取物可提高機體抗氧化能力，減少MDA產生，加速其清除，保護腎組織免受氧化應激的損傷，從而改善腎功能。

由于腎小球基底膜的分子屏障和電荷屏障，在健康人和小鼠尿液中僅含有微量的白蛋白，尿微量白蛋白是反映腎早期損害的指標［18］。腎小球基底膜受損，屏障破壞，致使通透性增加，引起大量白蛋白尿。血尿素氮和肌酐是反映腎損害的晚期指標，反映腎小球濾過功能隨著腎纖維化的發生發展，腎小球濾過功能逐漸下降，導致血尿素氮和肌酐水平升高［19］。TBWDS提取物可以顯著降低糖尿病腎病小鼠尿mAlb含量和血肌酐、尿素氮的水平，能夠修復腎小球的損傷，改善腎功能。

糖尿病患者其不良飲食習慣，攝入高嘌呤食物，再加上高糖引起的氧化應激反應，使組織細胞損傷，細胞中的嘌呤化合物分解代謝增強，產生尿酸增多，而由于其溶解度低，一旦含量升高就會沉積在腎臟，引起腎損傷；腎損傷后又引起尿酸的排泄障礙，進一步使血尿酸升高［18］。近來發現，在2型糖尿病和糖代謝異常人群中高尿酸血癥者明顯高于正常人群，并且血尿酸在腎臟疾病進展中發揮著重要作用，可能是慢性腎臟?。–KD）進展的獨立危險因素［20］。因此，越早控制高尿酸血癥越有利于延緩DN的進展，達到防止終末期腎衰竭。TBWDS 提取液具有明顯降低糖尿病腎病小鼠血尿酸水平的作用，進而可以改善腎功能。

綜上所述，TBWDS提取物能夠提高DN小鼠腎組織細胞的抗氧化能力，改善和保護腎小球和腎小管的損傷，降低腎組織細胞對促纖維化因子TGF-β1的表達，從而保護腎功能。TBWDS提取物具體藥效成分及改善DN小鼠腎功能的作用機制仍有待進一步開發和研究。