miR-181a靶向Bcl-2調控氧糖剝奪/再灌注模型誘導的 SH-SY5Y神經細胞凋亡

袁珊 楊玉瑩 許梅梅 胡廣澤 高蕊

摘要： 目的 皮層是響應腦缺血缺氧最為敏感的組織之一，基于前期深度測序技術，我們篩選獲得響應腦缺血缺氧應激的皮層區目標基因miR-181a及Bcl-2。本研究旨在SH-SY5Y細胞株氧糖剝奪/復糖復氧模型驗證二者靶向調控關系及功能，明確miR-181a—Bcl-2調控網絡在OGD/R誘導的神經細胞凋亡中的作用。方法 采用線栓法構建大鼠缺血缺氧再灌注損傷模型，腦切片TTC染色及行為學評分法評估模型。應用qRT-PCR及Western Blot驗證目標基因的表達。生物信息學分析miR-181a與Bcl-2的靶向結合位點并比對結合位點的保守性，雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-181a與Bcl-2靶向結合的特異性。采用OGD/R細胞模型體外模擬腦缺血再灌注損傷，檢測凋亡相關蛋白表達及Hoechst熒光染色評估細胞凋亡。結果 大鼠大腦中動脈阻塞后miR-181a、Bcl-2表達變化趨勢相反。RNA hybird軟件預測miR-181a可結合Bcl-2的3′-UTR區，且結合區域高度保守。雙熒光素酶報告基因實驗發現，相對于Bcl-2 3′UTR-WT與mimic-NC共轉染組，Bcl-2 3′UTR-WT與miR-181a mimic共轉染后的熒光活性更低（P＜0.001），而Bcl-2-Mut與miR-181a mimic共轉染組，熒光活性無顯著差異（P＞0.05）。分別用miR-181a的模擬物及抑制物轉染OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞，miR-181a可以抑制Bcl-2 mRNA及其蛋白的表達水平（P＜0.001）。過表達 miR-181a顯著增加了SH-SY5Y細胞的凋亡（P＜0.001），而抑制 miR-181a 表達可使 SH-SY5Y細胞凋亡顯著降低（P＜0.001）。結論 miR-181a 可靶向結合Bcl-2，下調miR-181a可通過促進Bcl-2的表達進而抑制SH-SY5Y神經細胞OGD/R損傷誘導的細胞凋亡。

關鍵詞：miR-181a；Bcl-2；SH-SY5Y；OGD/R；凋亡

中圖分類號： R34文獻標志碼：A文獻標識碼

MiR-181a regulates the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by OGD/R model by targeting Bcl-2

YUAN? Shan，YANG? Yuying，XU? Meimei，HU? Guangze，GAO? Rui*

（Department of Biochemistry， School of Medicine/The Key Laboratory of Ministry of Education for Xinjiang Endemic & Ethnic Disease， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract：? Objective

The cortex is one of the most sensitive tissues in response to cerebral hypoxia-ischemia. Based on the previous deep sequencing technology， we screened and obtained cortical target genes miR-181a and Bcl-2 that closely respond to cerebral hypoxia ischemia stress. The aim of this study is to verify the above targeted relationships and functions in SH-SY5Y cell line induced by the oxygen-glucose deprivation/reperfusion （OGD/R）， and to clarify the role of miR-181a-Bcl-2 regulatory network in OGD/R induced nerve cell apoptosis. Methods The model of hypoxic-ischemic and reperfusion injury in rats was established by suture method， and the model was evaluated by TTC staining and behavioral score. Target gene expression was verified by qRT-PCR and Western Blot. Bioinformatics was used to analyze the target binding sites of miR-181a and Bcl-2 and compare the conservation of the binding sites. The specificity of targeted binding between miR-181a and Bcl-2 was confirmed through dual-luciferase reporter gene experiments. The OGD/R model was used to simulate cerebral ischemia-reperfusion injury in vitro. Cell apoptosis was detected by apoptosis-related protein expression and Hoechst fluorescence staining. Results The expression of miR-181a and Bcl-2 was reversed after middle cerebral artery occlusion in rats. RNA hybird software predicted that miR-181a could bind to the 3′-UTR region of Bcl-2 mRNA， and the nucleotides in the binding region were highly conserved. Dual luciferase reporter gene assay showed that compared with the Bcl-2 3′UTR-WT and mimic-NC co-transfection group， the fluorescence activity of Bcl-2 3′-UTR and miR-181a mimic co-transfection group was lower （P<0.001）. There was no significant difference in the fluorescence activity of Bcl-2-Mut co-transfected with miR-181a mimic group （P>0.05）. After the OGD/R model was constructed， SH-SY5Y cells were transfected with miR-181a mimics and inhibitors， respectively. It was found that miR-181a could inhibit the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein （P<0.001）. Overexpression of miR-181a significantly increased the apoptosis of SH-SY5Y cells （P<0.001）， while inhibition of miR-181a expression significantly decreased the apoptosis of SH-SY5Y cells （P<0.001）. Conclusion miR-181a can target Bcl-2 and down-regulation of miR-181a can inhibit the OGD/R injury induced apoptosis of SH-SY5Y nerve cells by up-regulating the expression of Bcl-2.

Key words： miR-181a;Bcl-2;SH-SY5Y;OGD/R;apoptosis

0 前言

腦卒中通常分為兩大類：缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中病例占所有腦卒中病例的87%，它是全球第二大死亡原因，同時也是導致嚴重殘疾的主要因素［1］。與細胞主要通過壞死死亡的缺血核心不同，細胞凋亡在半影區普遍存在［2-3］卒中缺血核心區神經細胞迅速壞死，而半影區受損細胞普遍發生凋亡［2-3］，半暗帶中較弱的損傷主要引起細胞凋亡［4-5］。神經細胞特別是神經元對缺血缺氧刺激敏感且再生能力有限，挽救這類處于可逆狀態的神經細胞凋亡進程是目前主要的干預方法，因此深入了解缺血性卒中腦損傷的潛在分子及調控機制迫在眉睫。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類不具有編碼能力的單鏈RNA［6］，一般長度為21～25 nt，它在多種生物體內廣泛分布。miRNA 在不同生物中高度保守，且在組織中具有高度的特異性［7］。研究表明，miRNA主要是在轉錄后水平調控基因表達［8-10］，即負向調控mRNA的翻譯，在疾病發生發展的進程中調節靶基因的蛋白表達水平。近年來，miRNA在神經系統的作用開始被學者所認識，且被證實miRNA在急性缺血性腦卒中等神經系統疾病中發揮著重要的調控作用。例如，miR-26a可以激活AKT和ERK信號通路上調HIF-1α的表達，并通過調控VEGF轉錄活性，促進MCAO模型中血管的生成［11］；miR-190在I/R大鼠中表達顯著降低，而過表達miR-190后下調Rho/Rho激酶mRNA和蛋白表達，同時降低了細胞的凋亡率［12］。Bcl-2基因（B細胞淋巴瘤/白血病-2基因B-cell lymphoma 2， Bcl-2）是一種癌基因，亦是最重要的抗細胞凋亡基因，常作為內源性神經保護物質，當Bcl-2表達量升高時，能發揮抑制缺血所致的神經元凋亡的功能［13］，因此它在腦缺血再灌注損傷中發揮了重要保護作用。

目前已有文獻報道miR-181a通過靶向Bcl-2在疾病中發揮重要作用，例如miR-181a通過靶向Bcl-2在低侵襲性乳腺癌細胞中對阿霉素化療敏感性的功能作用［14］；miR-181a通過靶向Bcl-2使人惡性膠質瘤U87MG細胞對輻射敏感［15］；miR-181a通過靶向Bcl-2使多重耐藥白血病細胞系K562/A02對柔紅霉素敏感［16］。此外，miR-181a在細胞凋亡中發揮的調控作用也有文獻報道，例如miR-181a通過誘導細胞凋亡使耐藥白血病HL-60/Ara-C細胞對Ara-C敏感［17］；miR-181a有助于蟾蜍靈誘導PC-3前列腺癌細胞凋亡［18］。但是在OGD/R誘導神經細胞損傷模型中是否存在miR-181a與Bcl-2的靶向關系，以及miR-181a—Bcl-2軸在OGD/R誘導的SH-SY5Y細胞凋亡中發揮的功能仍需進一步探究。

本研究旨在體外實驗驗證miR-181a與Bcl-2的調控關系，并探討miR-181a—Bcl-2軸對OGD/R模型誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的影響，為miR-181a調控腦缺血再灌注神經細胞凋亡的機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本研究使用的SH-SY5Y細胞株（人神經母細胞瘤細胞）購自武漢大學生命科學學院中國典型培養物保藏中心（細胞庫）。293T細胞（人腎上皮細胞）由石河子大學醫學院生化教研室提供。miR-181a模擬物及其陰性對照（miR-181amimic/mimic-NC）、miR-181a抑制物及其陰性對照（miR-181ainhibitor/inhibitor-NC）、Bcl-2 3′UTR野生型和突變型質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司。LipofectamineTM 3000試劑購自ThermoFisher公司。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型構建

大鼠用戊巴比妥鈉（40mg·kg-1）麻醉并固定在仰臥位。常規皮膚消毒和準備后，在頸部中線左側做一個小切口（～25mm），鈍性分離頸動脈肌肉，暴露頸內動脈、頸外動脈以及頸動脈分叉處。在頸外動脈切開一個小切口，將硅膠涂層的MCAO栓塞（中國廣東廣州嘉靈生物科技有限公司）小心地經頸內動脈插入大腦中動脈，直至出現輕微阻力。栓塞2小時后，移除栓子以進行再灌注。假手術組手術操作與MCAO組相同，只是不進行栓塞處理。

1.2.2 神經行為學評分

MCAO模型大鼠撤栓血液再灌注24 h之后開始評分，聯合采用longa評分標準進行評分，以最大程度保證模型的有效性（表1）。所有評分操作均由對實驗不知情的研究人員進行，以避免主觀因素對結果的影響。

1.2.3 TTC染色及梗死密度掃描

在冰上將大鼠鼠腦取出后，立即將鼠腦放于干凈培養皿中于-20℃冰箱下冷凍20 min固形，將組織連續切成2 mm厚的冠狀切片，在2%的TTC染色溶液中37℃培養箱內避光孵育，每隔5 min將切片翻面，注意需染色均勻。15～20 min后取出腦片，使用4%多聚甲醛固定液固定，觀察并拍照，應用Image J圖像分析軟件掃描梗死密度，并計算梗死密度百分比。

1.2.4 miR-181a 與 Bcl-2 基因 3′-UTR 區結合位點預測及保守性分析

使用 miRanda 和 targetscan 進行 miR-181a 的靶基因預測，發現 Bcl-2 為其靶基因，通過 RNA hybird 軟件預測 miR-181a 成熟體序列與 Bcl-2 基因的 3′ -UTR 區存在保守的結合位點。在 miRBase 數據庫（http：//www.mirbase. org/）下載人、大鼠、小鼠、大猩猩、獼猴、豚尾獼猴、原雞、斑馬魚、綿羊和鴨嘴獸等10個物種的 miR-181a 成熟序列進行保守性分析。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗

使用 293T 細胞用于雙熒光素酶報告基因系統檢測，按照 Lipofectamine 3000 試劑說明書，將 miR-181amimic、mimic NC 分別與 Bcl-2 3′UTR-WT、Bcl-2 3′UTR-Mut 兩兩進行共轉染，每個處理設置3孔重復。將轉染的細胞置于37 ℃共培養24 h后，使用? Dual-Luciferase 報告基因檢測系統試劑盒檢測細胞熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的比值作為相對熒光活性。

1.2.6 細胞培養與轉染

將 SH-SY5Y 細胞復蘇24 h后觀察細胞狀態，并根據細胞生長情況更換培養基。用PBS 清洗2遍 SH-SY5Y 細胞，加入 2 mL 胰蛋白酶消化。在顯微鏡下觀察到細胞呈現流沙狀時，立即加入 4 mL 完全培養基終止消化。在 800 r·min-1條件下離心5 min，棄上清液后加入 1 mL 完全培養基重懸 SH-SY5Y細胞，并將其接種至 10 cm 細胞培養皿，在37 ℃，5% CO2環境下培養；293T 細胞的操作步驟與之相同。在6孔板中根據試劑盒說明書進行，使用 Lipofectamine 3000 轉染miR-181a的mimic和inhibitor，并在轉染后24 h收取細胞待檢。

1.2.7 OGD/R 模型的構建

將 SH-SY5Y 細胞培養至狀態良好后按照接種量進行細胞鋪板，等到第二天細胞生長至所需狀態及數量后（16～24 h），用1×無菌PBS清洗3次，之后將皿內10%完全培養基置換成無糖DMEM培養基。將神經細胞置于預先充95% N2、0% O2、5% CO2混合氣的三氣培養箱中，進行缺糖缺氧處理。OGD處理結束后，棄去無糖DMEM培養基，加入10%完全培養基，然后將細胞置于5% CO2的常氧培養箱繼續培養，在復糖復氧24 h后，收集細胞用于后續實驗研究。

1.2.8 qRT-PCR 檢測

莖環引物及 PCR 引物信息見表2。qRT-PCR 使用 TB Green Premix Ex TaqTM 試劑盒（RR800A， Takara， Japan），采用15 μL體系，PCR 體系及反應條件見表3、表4。

1.2.9 Western Blot檢測

將腦組織在液氮中搗碎，在冰上用 RIPA 緩沖液裂解30 min并進行超聲處理（30%能量，2 s持續時間，2 s間隔，總時間30 s）。在4℃下以12 000 r·min-1離心10 min。將上清液轉移到新管中。添加 PMSF（10∶1 000），并使用 BCA 試劑盒（Biomiga）測定蛋白質濃度。對于 SH-SY5Y 細胞，用 PBS 洗滌細胞，在冰上用 RIPA 緩沖液裂解30 min并進行超聲處理（30%能量，2 s持續時間，2 s間隔，總時間30 s）。添加 PMSF（10∶1 000），并使用BCA試劑盒（Biomiga）測定蛋白質濃度。蛋白質 （30 μg） 通過10% SDS-PAGE 分離并轉移到NC膜上。將膜封閉2 h（室溫下5% BSA）。將膜與抗Bcl-2（abcam，ab196495，1∶1 000）、Bax（abcam，ab53154，1∶2 000）、β-actin（中杉金橋，TA-09，1∶2 000）在 4 ℃ 過夜。將膜用TBS-Tween-20（TBS-T）洗滌3次，并與二抗在室溫下孵育2 h。將膜用TBS-T洗滌3次，并在 West Femto ECL Substrate（Beijing Solarbio Science & Technology Co.， Ltd.）下暴露于 Bio-Rad ChemiDoc XRS（Bio-Rad Laboratories， Inc.），并用 ImageJ（v. 1.6.0）進行分析。

1.2.10 Hoechst 熒光染色

OGD/R 模型結束后，每孔加入適當量 Hoechst 33258 染色液充分覆蓋住待染色的樣品（六孔板每孔加入1 mL，96孔板每孔需加入100 μL）。培養箱中放置20～30 min。棄去染色液，用1×PBS 或培養基洗滌2～3次。結果直接在熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄結果。

1.2.11 統計學方法

所有實驗均進行3次重復，用平均值± SD表示，組別比較采用方差分析和獨立樣本t檢驗，使用 SPSS 19.0 統計學軟件對其進行統計學分析。P<0.05為具有統計學意義。qRT-PCR 采用2 -ΔΔCt方法計算其相對表達水平。

2 結果

2.1 大鼠 MCAO 2 h/R 24 h 模型的構建與評估

由于大腦皮層對腦缺血十分敏感，因此在本研究中，我們選擇了皮層區域進行數據挖掘，在 SD 大鼠上構建了 MCAO 模型，腔內線栓阻斷法對大鼠大腦中動脈進行梗死2 h、再灌注24 h處理。模型結束后收集 Sham 組與 MCAO 組的大鼠大腦皮層進行高通量測序，測序結果顯示缺血缺氧損傷后，miR-181a 表達下調，Bcl-2 表達上調。我們前期發表的成果［19］上傳了該數據集，可在國家生物技術信息中心（NCBI）的短讀檔案 （SRA） 中找到，生物項目編號為 PRJNA690203（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA690203/）。

為了驗證 miR-181a 與 Bcl-2 的表達趨勢是否與測序結果一致，本研究在 SD 大鼠上構建了 MCAO 2 h/R 24 h 動物模型。在神經行為學上，longa 評分結果顯示，MCAO 組大鼠相較于 Sham 組具有明顯的神經行為缺損（P<0.05）（圖1B）。在病理上，MCAO 組全腦切片 TTC 染色顯示梗死區顏色蒼白且出現較為嚴重的水腫，對照組大腦組織顏色紅潤，無明顯梗死病灶（圖1A）；對梗死密度進行量化，結果顯示MCAO組大鼠的梗死密度顯著高于Sham組大鼠（P<0.001）（圖1C）。神經行為學與病理切片的結果均表明模型構建成功，可以進行后續實驗研究。

2.2 MCAO 模型中 miR-181a、Bcl-2 的表達變化

收集 SD 大鼠大腦皮層組織的總 RNA 和總蛋白，檢測 miR-181a、Bcl-2 表達趨勢是否與測序結果相一致。結果顯示，與 Sham 組相比，miR-181a 的表達在 MCAO 模型損傷后上調（P<0.001）（圖2A），Bcl-2 mRNA 及蛋白的表達在 MCAO 模型損傷后均下調（P<0.001），并且 Bcl-2/β-actin蛋白比值顯著降低（P<0.001）（圖2B～2D）。以上結果顯示，miR-181a 與 Bcl-2 的表達變化趨勢相反；此外，上述結果還表明在腦缺血再灌注損傷后，伴隨 miR-181a 的高表達與Bcl-2的低表達。

2.3 miR-181a 與 Bcl-2 基因 3′-UTR 區結合位點預測及驗證

通過 RNA hybird 軟件預測 miR-181a 成熟體序列與 Bcl-2 基因的 3′-UTR 區存在保守的結合位點（圖3）。miR-181a 成熟序列以及種子區序列“ACAUUC”在人、大鼠、小鼠、大猩猩、獼猴、豚尾獼猴、原雞、斑馬魚、綿羊和鴨嘴獸等物種之間高度保守（表5）；Bcl-2與 miR-181a 的結合位點“GAAUGUA”在大鼠、小鼠、人、貓、豬、兔等物種之間高度保守，這提示二者可能在多個物種之間發揮類似的生物學功能。根據其保守結合區域，我們構建了含有 miR-181a 和 Bcl-2 3′-UTR 區結合位點附近區域序列的野生型和突變型質粒，進行雙熒光素酶報告基因檢測二者的結合位點。通過熒光素酶報告基因實驗發現，293T 細胞中共轉染帶有 Bcl-2 3′-UTR 區序列的質粒和miR-181a mimic可以導致熒光素酶活性的下調，而共轉染 Bcl-2 突變型質粒和miR-181a mimic后熒光素酶活性無變化。以上結果表明miR-181a 可與 Bcl-2 3′-UTR 結合，即 miR-181a 可以靶向結合 Bcl-2。

2.4 miR-181a 可以負向調控 Bcl-2 mRNA 及蛋白表達

在 SH-SY5Y 細胞 OGD/R 探究 miR-181a 與 Bcl-2 是否具有相反的調控模式，合成了 miR-181a mimic、miR-181a inhibitor 片段及其對應的陰性對照 mimic-NC 和 inhibitor-NC。在培養的 SH-SY5Y 細胞轉染上述片段，通過 qRT-PCR 檢測其轉染效率，以確保本研究所采用的寡核苷酸能夠達到實驗要求。如圖4所示，結果顯示 mimic 組的 miR-181a 表達升高約為5 000倍，且 Bcl-2 mRNA 和蛋白表達顯著降低；inhibitor 組結果顯示 miR-181a 表達降低約為70%，且 Bcl-2 mRNA 和蛋白表達顯著升高。以上結果表明 miR-181a 可負向調控 Bcl-2 轉錄后水平的表達。

2.5 SH-SY5Y細胞構建OGD/R損傷模型

為了探究 miR-181a—Bcl-2 軸在腦缺血缺氧損傷中的生物學功能，我們首先在 SH-SY5Y 細胞上構建了氧糖剝奪/復氧復糖（OGD/R）細胞模型，用以模擬腦缺血再灌注損傷的神經細胞，之后檢測缺糖缺氧2、4、6 h后復糖復氧24 h的 SH-SY5Y 細胞的活力與氧化應激水平。CCK-8 細胞活力及臺盼藍拒染的實驗結果顯示，隨著 OGD 處理時間的持續延長，細胞存活率逐漸降低，至 OGD 6 h/R 24 h 細胞存活率降至60%（P<0.01）（圖5A、5B）。之后檢測 SOD 酶活性及 MDA 含量，結果顯示 SH-SY5Y 細胞氧化應激水平隨著缺糖缺氧時間的延長逐漸增加，SOD活力顯著下降（P<0.01），MDA 含量明顯升高（P<0.001）（圖5C、5D）。以上結果提示在 SH-SY5Y 細胞成功構建 OGD/R 模型，且隨缺糖缺氧時間延長，細胞損傷進一步加重。

2.6 在 SH-SY5Y 細胞 OGD/R 模型損傷時段構建 miR-181a、Bcl-2 的時序表達譜

為了探究 SH-SY5Y 細胞在 OGD/R 損傷后 miR-181a、Bcl-2 的表達變化，我們檢測了 SH-SY5Y 細胞缺糖缺氧不同時段、復糖復氧 24 h 后的上述兩種 RNA 及靶標蛋白的表達變化。如圖6所示，從 OGD 2 h/R 24 h 開始，miR-181a 的表達顯著升高（P<0.05），Bcl-2 mRNA 水平及蛋白水平的表達均顯著降低（P<0.01），二者的表達趨勢相反，且在OGD 6 h/R 24 h損傷時段，miR-181a 和 Bcl-2表達的反向趨勢最為顯著，因此選擇 OGD 6 h/R 24 損傷時段進行后續研究。

2.7 下調 miR-181a 可介導 Bcl-2 上調挽救缺血缺氧損傷誘導的神經細胞凋亡

為了進一步研究下調 miR-181a 是否可通過上調 Bcl-2 基因抑制 SH-SY5Y 神經細胞凋亡，在對 SH-SY5Y 細胞進行 OGD 6 h/R 24 h 處理，之后轉染 miR-181a mimic 及 inhibitor，圖7結果顯示 OGD 6 h/R 24 h 損傷后 miR-181a 表達顯著升高（P<0.001），Bcl-2 mRNA 及蛋白表達均顯著降低（P<0.001）；與 OGD/R 組相比，OGD/R + miR-181a mimic 組 Bcl-2? mRNA 和蛋白表達顯著降低（P<0.001）、OGD/R + miR-181a inhibitor 組 Bcl-2 的 mRNA 和蛋白表達顯著升高（P<0.001）。Bcl-2 和 Bax 的比值改變可以反映凋亡的水平，當 Bcl-2/Bax 比值降低表明凋亡水平增加，Bcl-2/Bax 比值升高表明凋亡水平降低。檢測各個組別二者比值改變，圖7結果顯示與 control 組相比，OGD 6 h/R 24 h 組 Bcl-2/Bax 蛋白比值顯著降低（P<0.001）。與 OGD/R 組相比，OGD/R + miR-181a mimic 組 Bcl-2/Bax 蛋白比值顯著降低（P < 0.001）；OGD/R + miR-181a inhibitor 組Bcl-2/Bax 蛋白比值顯著增加（P < 0.001）。以上結果進一步提示 miR-181a 與 Bcl-2 具有相反的調控模式；此外Bcl-2/Bax 蛋白比值變化初步提示 miR-181a inhibitor 可以逆轉 OGD/R損傷誘導的細胞凋亡。

為了進一步研究 miR-181a—Bcl-2 軸介導 SH-SY5Y 神經細胞凋亡的影響，通過Hoechst 熒光染色檢測 SH-SY5Y 細胞凋亡情況。圖8結果顯示，與 control 組相比，OGD 6 h/R 24 神經細胞凋亡水平均顯著增加（P<0.001）。與 OGD/R 組相比，OGD/R + miR-181a mimic 組細胞凋亡水平顯著增加（P<0.001）；OGD/R + miR-181a inhibitor 組細胞凋亡水平顯著降低（P<0.001）。熒光染色結果進一步提示下調miR-181a 可以介導Bcl-2的上調從而逆轉OGD/R損傷誘導的神經細胞凋亡。

3 討論

中風是全球第二大死因，每年約有670萬人死于中風［20］，其中缺血性中風占病例的 80% 以上，主要是由于頸內動脈或大腦中動脈突然阻塞所致［21］，而 MCAO 實驗模型是最常用的短暫性局灶性腦缺血再灌注損傷動物模型，可用于臨床前研究缺血性腦卒中的病理生理學及其潛在機制研究［22］。OGD/R 模型是體外模擬腦缺血再灌注損傷的公認模型，在剝奪相應時段神經細胞中的葡萄糖和氧氣后再給予恢復，以此模擬腦缺血再灌損傷中的神經細胞［23-24］。SH-SY5Y 細胞是一種可以分化為具有成熟神經元形態和生物特征的神經細胞［25］，常被用于神經損傷性疾病機制的研究。

在缺血核心區域，許多細胞尤其是神經元，會在僅僅5 min內死亡，而毗鄰區域的神經細胞處于可逆狀態，因此挽救這類神經細胞是目前研究的主要方向［26］。細胞凋亡是缺血性中風的關鍵機制，挽救細胞凋亡可減輕缺血和再灌注誘導的腦損傷。

目前已有許多文獻證實 microRNA 在缺血性中風誘導的神經細胞凋亡中發揮重要調控作用，例如 miR-124 通過靶向小鼠 DAPK1 減輕缺血性中風誘導的神經元死亡，包括小鼠的整體神經功能［27］；microRNA-195 通過抑制 KLF5 介導的 JNK 信號通路激活來減輕缺血性中風大鼠的神經細胞凋亡［28］；上調 microRNA-9 通過靶向缺血性中風中的 Bcl2l11 抑制神經細胞凋亡［29］?；诖?，本研究向 OGD/R 處理的 SH-SY5Y 細胞中分別轉染了 miR-181a 模擬物和抑制物以及其陰性對照，發現過表達 miR-181a 能促進缺血缺氧誘導的 SH-SY5Y 細胞凋亡，抑制 miR-181a 的表達，SH-SY5Y 細胞凋亡率明顯降低，再次證實了下調 miR-181a 可上調 Bcl-2 從而對腦缺血再灌注損傷誘導的神經細胞凋亡發揮保護作用。

在先前報道中，雙熒光素酶報告基因實驗證實了 miR-181 可靶向多個 Bcl-2 家族成員（Bcl-2、Mcl-1），其中 miR-181 對 Bcl-2 和 Mcl-1 的調節有助于在體外缺血應激（葡萄糖剝奪）星形膠質細胞中觀察到線粒體功能障礙［30］。Bcl-2調控細胞凋亡機制如下［31］：Bcl-2 可競爭性地結合 Bax 蛋白，減少 Bax/Bak 寡聚化在線粒體外膜上形成孔，阻止細胞色素c等促凋亡物質釋放入胞質。細胞色素 c 與細胞質中的凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）結合形成凋亡小體，激活 caspase-3 介導凋亡。Mcl-1 在細胞凋亡機制如下［32］：Mcl-1也可以通過在線粒體外膜螯合促凋亡蛋白 Bak 阻止其寡聚化和細胞色素 c 釋放來發揮抗凋亡作用。

我們的研究為 OGD/R 誘導的神經細胞凋亡機制提供了新的思路，但本研究仍然存在不足之處：雖然下調的 miR-181a 負向調控靶標 Bcl-2 發揮抑制神經細胞凋亡的作用，但這種作用是否與 miR-181a 通過對其它 Bcl-2 家族成員的表達調控，進而協同發揮抑制神經細胞凋亡的作用還不明確；此外我們僅在細胞水平上進行了驗證，miR-181a—Bcl-2 軸在體內是否發揮同樣的功能仍需進一步探究；且 miR-181a 在缺血性腦卒中上調的原因以及 miR-181a 上游的調控因子也待進一步研究。

參考文獻（References）

［1］ KURIAKOSE D， XIAO Z. Pathophysiology and treatment of stroke： Present status and future perspectives［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2020，21（20）：7690.

［2］ RADAK D， KATSIKI N， RESANOVIC I， et al. Apoptosis and acute brain ischemia in ischemic stroke［J］. Current Vascular Pharmacology， 2017， 15（2）：115-122.

［3］ UZDENSKY A B. Regulation of apoptosis in the ischemic penumbra in the first day post-stroke［J］. Neural Regeneration Research， 2020， 15（2）：253-254.

［4］ GUO M F， YU J Z， MA C G. Mechanisms related to neuron injury and death in cerebral hypoxic ischaemia［J］. Folia Neuropathologica， 2011， 49（2）：78-87.

［5］ PUYAL J， GINET V， CLARKE P G. Multiple interacting cell death mechanisms in the mediation of excitotoxicity and ischemic brain damage： a challenge for neuroprotection［J］. Progress in Neurobiology， 2013， 105：24-48.

［6］ O′BRIEN J， HAYDER H， ZAYED Y， et al. Overview of MicroRNA biogenesis， mechanisms of actions， and circulation［J］. Frontiers in endocrinology， 2018， 9：402.

［7］ KELLER A， GROGER L， TSCHERNIG T， et al. miRNATissueAtlas2： an update to the human miRNA tissue atlas［J］. Nucleic Acids Research， 2022，50（D1）：D211-D221.

［8］ ARUR S. Context-dependent regulation of dicer activity and small RNA production： Implications to oocyte-to-embryo transition［J］. Worm， 2015， 4（4）： e1086062.

［9］ LI X， GAO Y， MENG Z， et al. Regulatory role of microRNA-30b and plasminogen activator inhibitor-1 in the pathogenesis of cognitive impairment［J］. Experimental and Therapeutic Medicine， 2016， 11（5）： 1993-1998.

［10］ LOVIS P， GATTESCO S， REGAZZI R. Regulation of the expression of components of the exocytotic machinery of insulin-secreting cells by microRNAs［J］. Biological Chemistry， 2008，389（3）：305-312.

［11］ LIANG Z， CHI Y J， LIN G Q， et al. MiRNA-26a promotes angiogenesis in a rat model of cerebral infarction via PI3K/AKT and MAPK/ERK pathway［J］. European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2018， 22（11）： 3485-3492.

［12］ JIANG C， DONG N， FENG J， et al. MiRNA-190 exerts neuroprotective effects against ischemic stroke through Rho/Rho-kinase pathway［J］. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology， 2021， 473（1）：1-10.

［13］ PARK S Y， HAN J S. Neuroprotective effect of Bcl-2 on lipopolysaccharide-induced neuroinflammation in cortical neural stem cells［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2022，23（12）：6399.

［14］ ZHU Y， WU J， LI S， et al. The function role of miR-181a in chemosensitivity to adriamycin by targeting Bcl-2 in low-invasive breast cancer cells［J］. Cell Physiol Biochem， 2013，32（5）：1225-1237.

［15］ CHEN G， ZHU W， SHI D， et al. MicroRNA-181a sensitizes human malignant glioma U87MG cells to radiation by targeting Bcl-2［J］. Oncology Reports， 2010，23（4）：997-1003.

［16］ LI H， HUI L， XU W. MiR-181a sensitizes a multidrug-resistant leukemia cell line K562/A02 to daunorubicin by targeting Bcl-2［J］. Acta Biochimicaet Biophysica Sinica （Shanghai）， 2012，44（3）：269-277.

LI H， HUI L， XU W. MiR-181a sensitizes a multidrug-resistant leukemia cell line K562/A02 to daunorubicin by targeting Bcl-2［J］. Acta Biochimica et Biophysica Sinica， 2012， 44（3）：269-277.

［17］ BAI H， CAO Z， DENG C， et al. MiR-181a sensitizes resistant leukaemia HL-60/Ara-C cells to Ara-C by inducing apoptosis［J］. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology， 2012，138（4）：595-602.

［18］ ZHAI X F， FANG F F， LIU Q， et al. MiR-181a contributes to bufalin-induced apoptosis in PC-3 prostate cancer cells［J］. BMC Complementary and Alternative Medicine， 2013，13：325.

［19］ WANG C， YANG Y， XU M， et al. Deep sequencing of the Rat MCAO cortexes reveals crucial circrnas involved in early stroke events and their regulatory networks［J］. Neural Plasticity， 2021，2021：9942537.

［20］ WU O， WINZECK S， GIESE AK， et al. Big data approaches to phenotyping acute ischemic stroke using automated lesion segmentation of multi-center magnetic resonance imaging data［J］. Stroke， 2019， 50（7）：1734-1741.

［21］ KVISTAD C E， NOVOTNY V， KURZ M W， et al. Safety and outcomes of tenecteplase in moderate and severe ischemic stroke［J］. Stroke， 2019， 50（5）：1279-1281.

［22］ MA R， XIE Q， LI Y， et al. Animal models of cerebral ischemia： A review［J］. Biomedicine & Pharmacotherapy， 2020，131：110686.

［23］ DENG Z， OU H， REN F， et al. LncRNA SNHG14 promotes OGD/R-induced neuron injury by inducing excessive mitophagy via miR-182-5p/BINP3 axis in HT22 mouse hippocampal neuronal cells［J］. Biological Research， 2020， 53（1）：38.

［24］ XIE W， ZHU T， ZHOU P， et al. Notoginseng leaf triterpenes ameliorates OGD/R-induced neuronal injury via SIRT1/2/3-Foxo3a-MnSOD/PGC-1alpha signaling pathways mediated by the NAMPT-NAD pathway［J］. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2020， 2020：7308386.

［25］ SKOTAK M， WANG F， CHANDRA N. An in vitro injury model for SH-SY5Y neuroblastoma cells： effect of strain and strain rate［J］. Journal of Neuroscience Methods， 2012， 205（1）：159-168.

［26］ CHEON S Y， KIM E J， KIM J M， et al. Cell type-specific mechanisms in the pathogenesis of ischemic stroke： The role of apoptosis signal-regulating kinase 1［J］. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2018， 2018：2596043.

［27］ SHI Y， TIAN T， CAI E L， et al. Corrigendum： miR-124 alleviates ischemic stroke-induced neuronal death by targeting DAPK1 in Mice［J］. Frontiers in Neuroscience， 2021，15：745087.

［28］ CHANG L， ZHANG W， SHI S， et al. Retraction note： microRNA-195 attenuates neuronal apoptosis in rats with ischemic stroke through inhibiting KLF5-mediated activation of the JNK signaling pathway［J］. Molecular Medicine， 2023，29（1）：52.

［29］ WEI N， XIAO L， XUE R， et al. MicroRNA-9 mediates the cell apoptosis by targeting Bcl2l11 in ischemic stroke［J］. Molecular Neurobiology， 2016，53（10）：6809-6817.

［30］ OUYANG Y B， LU Y， YUE S， et al. miR-181 targets multiple Bcl-2 family members and influences apoptosis and mitochondrial function in astrocytes［J］. Mitochondrion， 2012，12（2）：213-219.

［31］ QIAN S， WEI Z， YANG W， HUANG J， et al. The role of BCL-2 family proteins in regulating apoptosis and cancer therapy［J］. Frontiers in Oncology， 2022，12：985363.

［32］ GOODWIN C M， ROSSANESE O W， OLEJNICZAK E T， et al. Myeloid cell leukemia-1 is an important apoptotic survival factor in triple-negative breast cancer［J］. Cell Death & Differentiation， 2015， 22（12）：2098-2106.

（責任編輯：編輯唐慧）