血清c-kit mRNA水平與擴張型心肌病并發心力衰竭患者心肌纖維化、心功能及預后的關系*

張展瑋,張 軍,邢雪梅,吳 松,田 煥

1.三二〇一醫院醫學檢驗科,陜西漢中 723000;2.北京中醫藥大學孫思邈醫院心內科,陜西銅川 727100

擴張型心肌病(DCM)作為一種異質性心肌病,其臨床特征以單側或雙側心室擴大同時伴有收縮障礙為主,而且心律失常、心力衰竭(簡稱心衰)等并發癥會進一步增加DCM病死率[1-2]。雖然對于DCM的具體發病機制尚未完全闡明,但既往研究已經證實感染、中毒、內分泌失調、代謝紊亂等均是引發DCM的高危因素,而且越來越多的研究表明遺傳因素也是DCM的病因[3-4]。血清干細胞因子(SCF)是由骨髓基質細胞所產生的一類多功能細胞因子。血清干細胞因子受體(c-kit)作為原癌基因編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白受體,在促進人體組織發育、生長及凋亡中具有重要作用。c-kit對心肌損傷具有逆轉作用,而且在動物模型實驗中證實心衰大鼠的c-kit表達明顯降低,但其在DCM患者中的研究報道較少[5-6]。DCM病理過程核心是以心肌纖維化及心室重構為主,因此本研究通過探討c-kit與DCM并發心衰患者心肌纖維化、心功能、預后的關系,以期為該病的發病機制研究及治療方案的制訂提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2020年5月至2022年6月于三二〇一醫院接受治療的77例DCM并發心衰患者納入研究作為研究組,另選取70例未發生過心衰的DCM患者作為對照組,兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05),見表1,具有可比性。納入標準:(1)符合《擴張型心肌病診斷和評估指南》中的DCM的診斷標準[7];(2)心衰的診斷符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》中的相關標準[8]且心衰患者的心功能分級為Ⅱ～Ⅳ級;(3)具有完整的臨床資料。排除標準:(1)伴有先天性心臟疾病;(2)隨訪過程中失訪;(3)合并其他惡性腫瘤;(4)合并免疫功能障礙。所有納入研究者均對本研究知情同意,并簽署知情同意書。本研究經三二〇一醫院醫學倫理委員會審核通過(倫理批號:20200119)。

表1 兩組一般資料比較[n(%)或

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR(qPCR)檢測血清c-kit mRNA水平 于清晨采集納入研究者空腹外周血5 mL,以3 500r/min(離心半徑13.5 cm)離心10 min,收集到上層血清標本。采用Trizol法提取血清總RNA。PCR反應條件:95 ℃ 預變性5 min,95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共40個循環。用ABI公司StepOnePlus qPCR系統進行檢測,以GAPDH為內參。GAPDH引物序列上游為5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′,下游為5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′,擴增產物長度為720 bp;c-kit引物序列上游為5′-CTAGCCAGAGACATCAGGA-3′,下游為5′-CCATAGGACCAGACATCAC-3′。采用2-ΔΔCt法計算血清c-kit mRNA相對水平。

1.2.23種心肌纖維化指標的檢測 3種心肌纖維化指標[α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白]的檢測采用酶聯免疫吸附法(ELISA)。收集納入研究者靜脈血標本,抗凝處理后放入離心機中,設置離心參數為3 500 r/min(離心半徑15 cm),離心10 min,離心完畢后分離上層血漿,置于-20 ℃的環境下儲存備用。采用雙抗夾心法進行檢測,TMB顯色后使用酶標儀(美國Bio-Rad公司)在450 nm波長處檢測吸光度(A)值,采用CurveExpert軟件進行分析,根據直線回歸方程計算各指標實際水平。

1.2.3超聲心動圖分析獲取心功能參數 采用彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司,Vivid 7型)獲取超聲心動圖,探頭為S5-1,設頻率為1.0～5.0 MHz,要求所有受檢者均采取左側臥位,依次檢測患者左心室射血分數(LVEF)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)。

1.2.4隨訪、主要不良心血管事件(MACE)的評定及分組 研究組患者出院后,由本科室1位工齡超過5年的護士通過電話、走訪等方式進行隨訪,隨訪時長為6個月,隨訪截至2022年12月。隨訪期間發生心絞痛、急性心肌梗死、嚴重心律失常、急性心衰、冠心病死亡等視為發生MACE[9]。隨訪期間若發生MACE的患者納入預后不良組,未發生MACE的患者納入預后良好組。

1.3觀察指標 (1)比較研究組與對照組的血清c-kit mRNA水平、心肌纖維化指標及心功能參數;(2)血清c-kit mRNA水平與心肌纖維化指標及各心功能參數之間的相關性;(3)比較預后良好組與預后不良組血清c-kit mRNA水平、心功能參數、心肌纖維化指標水平及臨床資料;(4)分析影響DCM并發心衰患者預后的危險因素;(5)分析血清c-kit mRNA水平用于評估DMC并發心衰患者預后的效能。

2 結 果

2.1研究組與對照組血清c-kit mRNA水平比較 研究組血清c-kit mRNA水平低于對照組,差異有統計學意義(0.68±0.15vs.1.15±0.18,t=-17.253,P<0.001),見圖1。

圖1 研究組與對照組血清c-kit mRNA水平比較

2.2研究組和對照組心肌纖維化指標水平比較 研究組α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白水平均高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

2.3研究組與對照組心功能參數比較 超聲心動圖分析顯示,研究組LVEF低于對照組,而LVEDV、LVESV高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 研究組與對照組心功能參數比較

2.4血清c-kit mRNA水平與心肌纖維化指標、心功能參數的相關性分析 Pearson相關分析顯示,研究組血清c-kit mRNA水平與3種心肌纖維化指標(α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白)、LVEDV及LVESV均呈負相關(r=-0.725、-0.748、-0.744、-0.745、-0.662,P<0.05),與LVEF呈正相關(r=0.677,P<0.05)。見表4和圖2、3。

圖2 血清c-kit mRNA水平與心肌纖維化指標的相關性

圖3 血清c-kit mRNA水平與心功能的相關性

表4 血清c-kit mRNA水平與心肌纖維化指標及心功能參數的相關性分析

2.5預后良好組與預后不良組血清c-kit mRNA水平、心功能參數、心肌纖維化指標水平及臨床資料比較 隨訪期間研究組共有21例患者發生MACE,納入預后不良組;另外56例未發生MACE,納入預后良好組。兩組間血清c-kit mRNA水平、LVEF、3種心肌纖維化指標水平比較,差異均有統計學意義(P<0.05),見表5。

表5 預后良好組與預后不良組血清c-kit mRNA水平、心功能參數、心肌纖維化指標及臨床資料比較

2.6多因素Logistic回歸分析影響DCM并發心衰患者預后的因素 將2.5中差異有統計學意義的指標納入分析作為自變量(以所有患者各指標水平的平均值作為分界點),是否發生MACE作為因變量,各變量賦值情況見表6。Logistic回歸分析顯示,血清c-kit mRNA水平為DCM并發心衰患者預后的獨立影響因素(P<0.05),見表7。

表6 多因素賦值表

表7 Logistic回歸分析DCM并發心衰患者發生MACE的影響因素

2.7ROC曲線分析血清c-kit mRNA水平用于評估DCM并發心衰患者預后的效能 ROC曲線分析顯示,血清c-kit mRNA水平用于評估DCM并發心衰患者預后的截斷值為0.660,靈敏度為82.80%,特異度為81.80%,曲線下面積為0.829(95%CI:0.745～0.912,P<0.001),具有較高的效能,見圖4。

圖4 血清c-kit mRNA水平用于評估DCM并發心衰患者預后的ROC曲線分析

3 討 論

DCM主要特征為心功能下降、心肌受損和心室擴大,其病因尚未完全明確。隨著醫療水平的不斷進步,現階段可以有效延長DCM患者的生存期,但其仍是心衰和心臟移植的重要原因之一,給患者及社會帶來沉重負擔[10]。目前臨床對于此類疾病,最常用的治療手段為抗心衰、抗心律失常治療,對于心衰癥狀較重的患者則考慮進行心臟移植或人工心臟輔助等治療,但以上治療方式均只能對臨床癥狀起到緩解作用,并不能完全治愈[11]。隨著分子生物學研究的不斷開展,關于干細胞在各種疾病中的作用成為研究熱點。c-kit作為心肌干細胞的生長因子受體,參與心肌細胞增殖過程調控[12]。目前,c-kit與DCM并發心衰關系的研究報道較少。

本研究結果顯示,與對照組比較,研究組血清c-kit mRNA水平明顯降低。這與GHANIMATI等[13]在小鼠模型中的研究結論一致。該項研究的結果顯示,增加細胞c-kit表達水平可以增強對心臟的保護,減少心臟損傷。c-kit陽性的細胞在受到刺激時,不斷分化成為內皮細胞、心肌細胞等修補受損的心臟,但隨著疾病程度的不斷加重,c-kit在心肌梗死的刺激下分化成為心肌細胞的能力降低,無法有效分化為心肌細胞發揮修補心臟的作用[14]。國內雖鮮見研究報道血清c-kit mRNA水平與DCM并發心衰患者預后不良的關系,但國外有研究顯示,c-kit水平降低與心臟保護功能減少有關[15]。本研究通過比較預后良好組與預后不良組患者的臨床資料和各項指標并進行多因素Logistic回歸分析,發現血清c-kit mRNA水平降低是影響DCM并發心衰患者預后的獨立危險因素。c-kit水平與心室重構具有一定相關性,心室重構會誘導產生炎癥反應,大量炎癥因子釋放會抑制c-kit及miR-21 mRNA表達,而c-kit及miR-21作為與心室重構具有密切聯系的基因,其表達被抑制后將無法進一步發揮促進心肌細胞增值、分裂的作用,進而導致患者預后不良[16]。因此,檢測血清c-kit水平有助于評估DCM并發心衰患者預后。

心肌纖維化作為心衰過程中發生的病理變化之一,主要由持續且反復加重的心肌缺血、缺氧所致。本研究顯示,研究組α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平均明顯高于對照組。以上3個指標均為心肌纖維化的常見標志物,其在健康者的組織中表達水平均較低。當DCM患者并發心衰則表示其心室可能發生異常重構,心肌成纖維細胞隨之大量釋放入血,α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平則會明顯上升[17]。由于α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白水平升高會加速心室重構,進一步促使炎癥反應加重及炎癥因子的釋放,而c-kit的表達也會隨著炎癥因子表達的升高而降低,因此c-kit與α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白及Ⅲ型膠原蛋白表達呈負相關[18]。另外,通過對兩組患者的心功能參數進行檢測和比較,發現LVEDV、LVESV與血清c-kit mRNA水平呈負相關。分析原因:LVEDV及LVESV反映了左心室舒張與收縮末期的充盈量,DCM并發心衰患者心肌細胞受損,心肌運動協調性失衡,收縮與舒張能力降低,造成留于心室內的血液容積增加,導致炎癥因子水平上升,進而抑制c-kit的表達[19]。LVEF是臨床中評價左心室收縮功能的主要指標之一。DCM并發心衰患者心臟收縮、舒張功能減退,導致冠狀動脈所支配的心肌區域血流量減少,引起冠狀動脈微血管部分循環功能發生障礙,進一步加速心室重構。因此,本研究結果中LVEF與血清c-kit mRNA水平呈正相關。ROC曲線分析顯示,血清c-kit mRNA水平用于評估DCM并發心衰患者預后的靈敏度為82.80%,特異度為81.80%,曲線下面積為0.829,具有較高的效能,表明血清c-kit mRNA水平具有成為DCM并發心衰患者預后評估指標的潛在價值。

綜上所述,DCM并發心衰患者血清c-kit mRNA水平下調,并且與心肌纖維化及心功能有關,同時血清c-kit mRNA水平降低還預示著預后不良。臨床醫生可通過定時檢測血清c-kit mRNA水平掌握患者病情發展及對預后進行評估。但本研究還存在一定局限性,例如樣本量較少,有待進一步開展前瞻性多中心隊列研究以驗證結論的可靠性,而且本研究僅為臨床研究,還需進一步開展基礎研究從分子機制的角度對結論進行驗證。