直投式酵母菌發酵對江蘺腥味及膳食纖維性質的影響

木尼熱·卡地爾，姚沅俊，蔡真珍，蔡寧，姜澤東，4，鄭明靜，4，杜希萍，4，倪輝，，4*

（1.集美大學 海洋食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門海洋職業技術學院，福建 廈門 361102；4.廈門市食品生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021）

海藻是海帶、紫菜、江蘺等海洋藻類的總稱，其養殖地主要分布在我國福建、山東、廣東、海南等東南沿海地區。其中，福建省是我國海藻大省，由《2020 中國漁業統計年鑒》可知，2020 年福建省海藻產量高達12 萬t，約占全國海藻產量的48%[1]。海藻中富含藻膠、纖維素和半纖維素等，是制備膳食纖維的優質原料[2]。海藻膳食纖維作為從海洋藻類中提取的一種天然膳食纖維，具有一定的持水性、持油性及凝膠強度等特性[3]，主要作為增稠、穩定用途的食品配料。但是，碳氫化合物、酮、醛、醇、羧酸、酯等揮發性化合物構成了海藻中廣泛的揮發性代謝物[4]，直接采用海藻制備膳食纖維具有較濃烈的腥味，影響其在下游加工產品中的應用。因此，對海藻進行脫腥處理是提高其膳食纖維品質的重要研究內容。

脫除腥味的方法主要有物理法、化學法及生物法[5]。張麗君等[6]研究發現，活性炭及β-環狀糊精對螺旋藻吸附脫腥效果不明顯；加熱法則會引起嚴重變色及沉淀產生。潘江球等[7]研究發現，用堿法進行脫腥會導致江蘺營養成分嚴重損失。楊超[8]研究發現，利用微生物發酵不僅可以有效脫除龍須菜腥味，而且還可以改善其風味。與物理和化學脫腥法相比，生物法脫腥不需要長時間的熱處理，且不引入外源化學物質，是一種綠色的脫腥方法。傳統食品發酵方法是采用微生物擴大培養的方式，近年來，直投式微生物發酵劑越來越廣泛地用于增強食品風味[9]，為簡化發酵脫腥工藝提供了方便的途徑。

酵母菌是常用的發酵脫腥微生物。相關研究表明，酵母菌體內的醇脫氫酶、醛脫氫酶能將醛類以及烯醛類等腥味物質氧化或還原成風味較柔和的醇和酸，使用酵母菌發酵能有效地降低水產品的腥味[10]。劉豪等[11]用安琪高活性干酵母對小麥麩皮進行發酵，發酵后麩皮的蛋白質及灰分含量、持水性、溶脹性均增強。研究表明，酵母菌的代謝反應不僅可將腥味成分轉化成無腥味的成分，也可能對脂肪、蛋白質和多糖等成分具有轉化作用。因此，在研究酵母菌發酵去除海藻腥味的同時，也要關注其發酵脫腥對海藻膳食纖維相關性質的影響。

目前，已有關于腥味及海藻膳食纖維相關性質的研究。例如，腥味不僅可借助人嗅覺器官感知腥味的強度，還可以通過氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）及電子鼻（electronic nose，E-Nose）等方法進行測定[12-13]。膳食纖維的持水性、持油性等理化性質通常采用離心前后的質量比來評價，凝膠強度則用質構儀進行測定[14]。這些有關海藻腥味分析檢測及海藻膳食纖維應用性質分析檢測方法為深入研究發酵對海藻腥味及其膳食纖維性質的影響提供參考。

江蘺（Gracilaria）是我國一種重要的經濟類海藻，其膳食纖維含量高達80%～90%[7]。研究顯示，江蘺藻膳食纖維能顯著降低高血脂模型小鼠血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量及肝臟脂質水平，還能降低高脂膳食導致的氧化損傷[15]。用傳統方法制備的江蘺膳食纖維具有較強烈的腥味，目前尚未開展膳食纖維脫腥的研究。因此，本研究以江蘺為原料，運用感官檢驗和固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer，SPME-GC-MS）技術，研究直投式酵母菌發酵對江蘺腥味的影響，同時，基于儀器分析評價酵母菌發酵對江蘺腥味及其膳食纖維持水性、持油性、凝膠強度等應用性質的影響。本研究可為江蘺膳食纖維的生產奠定技術基礎，同時還為其他海藻脫腥及其膳食纖維加工提供參考，對提高江蘺及其他海藻的價值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

江蘺：綠新（福建）食品有限公司；直投式安琪耐高溫釀酒高活性干酵母：河南洲洋生物科技有限公司；白砂糖：市售；乙醇、3-己酮、C8-C20、檸檬烯、4-萜品醇、2-辛烯-1-醇、香茅醛、肉豆蔻酸異丙酯、異植物醇、橙花醇、順，順-2，4-壬二烯醛、苯甲醇、2，4-二甲基苯甲醛、檸檬醛、2，4-二叔丁基苯酚、芳樟醇、1-辛烯-3 醇、鄰苯二甲酸二丁酯、十一醛、柏木腦、鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯、反-2-癸烯醛、反-2-壬醛、鄰苯二甲醚、2-乙基己醇、反-2-辛烯醛、苯乙酮、2，4，6-三甲基吡啶、茴香腦、癸醛、順-香葉基丙酮、壬醛（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器設備

ZSBB-712 電熱恒溫水浴箱、ZXRD-B5110 恒溫鼓風干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司；FW100高速粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；GL1241-1SCN 電子分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TA-TOUCH 質構儀：上海保圣實業發展有限公司；SX2-12-10 箱式電阻爐：濟南精密科學儀器儀表有限公司；MB25 水分測定儀：奧豪斯儀器（蘇州）有限公司；DL-1 電子調溫電爐：江陰保利科研器械有限公司；H2050R 臺式高速大容量冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；WSB-2 數顯白度儀：河北慧采科技有限公司；QP-2010Plus 氣相色譜質譜串聯儀：日本島津公司；Rtx-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）色譜柱：美國色譜科公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母菌的活化

取1 g 直投式安琪耐高溫釀酒高活性干酵母，加至1 000 mL 滅菌的3% 白糖溶液中，混合均勻，密封后置于室溫活化10 h，分別用無菌水稀釋至一定的比例備用。

1.3.2 發酵江蘺樣品的制備

采用一定條件進行發酵后，濾除酵母菌液，藻體用40 倍的自來水清洗3 次，濾干后在60 ℃干燥12 h，粉碎過40 目篩，制備江蘺粉備用。以未發酵樣品作為空白對照。

1.3.3 酵母發酵工藝參數對江蘺腥味的影響

1.3.3.1 發酵溫度對脫腥效果的影響

準確稱取20 g 江蘺藻（用15～20 倍藻體積清水清洗，除去摻雜在江蘺藻中的泥沙、碎殼等雜質）于500 mL 錐形瓶中，按料液比1∶15（g/mL）、菌液稀釋4 倍的條件進行混合，密封后分別置于15、20、25、30、35 ℃電熱恒溫水浴箱中，發酵4 h 后進行感官評價（腥味強度）。

1.3.3.2 菌液稀釋倍數對脫腥效果的影響

準確稱取20 g 江蘺藻（用15～20 倍藻體積清水清洗，除去摻雜在江蘺藻中的泥沙、碎殼等雜質）于500 mL 錐形瓶中，按料液比為1∶15（g/mL）、菌液稀釋1、2、4、8、16 倍的條件進行混合，密封后置于25 ℃電熱恒溫水浴箱中，發酵4 h 后進行感官評價（腥味強度）。

1.3.3.3 料液比對脫腥效果的影響

準確稱取20 g 江蘺藻（用15～20 倍藻體積清水清洗，除去摻雜在江蘺藻中的泥沙、碎殼等雜質）于500 mL 錐形瓶中，按菌液稀釋4 倍、料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）的條件進行混合，密封后置于25 ℃電熱恒溫水浴箱中，發酵4 h 后進行感官評價（腥味強度）。

1.3.3.4 發酵時間對脫腥效果的影響

準確稱取20 g 江蘺藻（用15～20 倍藻體積清水清洗，除去摻雜在江蘺藻中的泥沙、碎殼等雜質）于500 mL 錐形瓶中，按料液比1∶15（g/mL）、菌液稀釋4 倍的條件進行混合，密封后置于25 ℃電熱恒溫水浴箱中，分別發酵0、2、4、6、8 h，待發酵完成后進行感官評價（腥味強度）。

1.3.4 發酵對江蘺腥味成分的影響

取20 mL 超純水于45 mL 萃取瓶中，加入5 g 發酵處理后的江蘺，再加入10μL 1 mg/mL 的3-己酮作為內標物，擰緊瓶蓋，搖勻，置于60 ℃電熱恒溫水浴箱中平衡30 min。采用老化后的65μm DVB/CAR/PDMS的萃取頭吸附30 min，進行GC-MS 分析。每組樣品處理設5 次平行。未經發酵處理的江蘺作為空白對照。

1.3.5 發酵對江蘺膳食纖維應用性質的影響

1.3.5.1 白度的測定

利用白度儀測定江蘺粉的白度。儀器調好后，將待測的江蘺粉放在試樣座上進行測定，待顯示值穩定后便即可記下其白度值。每組樣品做3 次平行，結果取平均值。

1.3.5.2 持水性的測定

參考吳興雨等[16]的方法，略微修改，取0.5 g 江蘺粉，加入10 mL 蒸餾水，充分振蕩，4 000 r/min 離心30 min，棄去上清液，稱量離心后沉淀的質量，按公式（1）計算持水性。

式中：h1為江蘺粉持水性，g/g；m0為江蘺粉初始質量，g；m1為離心后沉淀的質量，g。

1.3.5.3 持油性的測定

參考吳興雨等[16]的方法，略微修改，取0.5 g 江蘺粉，加入10 mL 玉米油，充分振蕩，4 000 r/min 離心30 min，棄去上清液，稱量離心后沉淀的質量，按公式（2）計算持油性。

式中：h2為江蘺粉持油性，g/g；m0為江蘺粉初始質量，g；m2為離心后沉淀的質量，g。

1.3.5.4 凝膠強度的測定

參照GB 1886.239—2016《食品安全國家標準食品添加劑瓊脂》[17]中1.5% 瓊脂（干基計）凝膠試樣制備的方法，根據上述測得的江蘺粉的水分含量，按公式（3）計算出稱取樣品量。

式中：X為稱取試樣質量，g；D為試樣水分的質量分數，%。

準確稱取由公式（3）計算所得到的樣品0.001 g，置于500 mL 錐形瓶中，加入100 mL 水，靜置浸泡1 h后，微沸加熱直至試樣出現膠著狀態，將膠著液平均倒入100 mL 燒杯中，冷卻至膠體形成，用保鮮膜密封，室溫放置15 h 備用。利用質構儀測定其凝膠強度。參考王鑫等[18]的研究方法，采用P/0.5 探頭，測試前、中、后速度分別為1、1、1 mm/s，觸發力5 g，壓入凝膠中心位置4 mm。

1.3.6 腥味的感官評價

采用感官評分法，對發酵后的江蘺整體氣味可接受程度進行評分。通過閱讀大量文獻及預試驗選擇了腥味參照物質，選擇10 名（男5 名，女5 名）食品專業學生作為評審人員，對不同濃度梯度的腥味標準溶液進行培訓，使評審人員熟悉腥味強度的定量感官評價方法，再按照表1 所示的評分描述進行感官評價。

表1 發酵脫腥效果評分標準Table 1 Scoring criteria for the effect of fermentation on reducing fishy odor

1.3.7 腥味成分的GC-MS 揮發性成分測定

色譜條件：Rtx-5MS 石英毛細柱（60 m×0.32 mm×0.25μm）；進樣口溫度為230 ℃；最初溫度為40 ℃并保持0 min，以1 ℃/min 升溫至57 ℃，在57 ℃保持0 min，再以5 ℃/min 升溫至230 ℃，在230 ℃保持5 min。用高純氦氣（純度99.999%）作為載氣，柱流量為3.16 mL/min，不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊（electron impact，EI）離子源；電子能量為70 eV；離子源溫度為220 ℃；接口溫度為250 ℃；通過選擇掃描模式進行定性分析，質量掃描范圍m/z 35～500。溶劑延遲時間為3 min。

定性定量分析：運用質譜數據庫（NIST11、NIST11s、FFNSC1.3）進行相似度檢索，根據不同物質的基峰、質荷比和相對峰度做串連檢索與人工解析，質譜匹配度大于80% 作為物質鑒定標準；按公式（4）計算待測組分的保留指數（retention index，RIx），與文獻報道的保留指數進行對比定性。

式中：R為待測定成分的保留指數；ti為待測成分i的調整保留時間，min；tn為具有n個碳原子數的正構烷烴的調整保留時間，min；tn+1為具有n+1 個碳原子數的正構烷烴的調整保留時間，min。

此外，采用面積歸一法進行定量，按公式（5）計算各組分百分含量。

式中：Xi為組分i的百分含量，%；A1、A2…Ai為組分1、2…i的峰面積；f1、f2…fi為組分1、2…i的相對校正因子。

1.4 數據處理

采用Excel 2017 對江蘺脫腥工藝及其揮發性成分進行定性、定量等統計分析，并繪制相關圖表；利用IBM SPSS 26.0 對試驗數據進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 直投式酵母菌發酵工藝對江蘺腥味的影響

直投式酵母菌發酵工藝參數對江蘺腥味的影響如圖1 所示。

圖1 直投式酵母菌發酵工藝參數對江蘺腥味的影響Fig.1 The effects of directed vat set yeast fermentation parameters on fishy odor of Gracilaria

由圖1A 可知，腥味強度隨發酵溫度的升高先降低后升高，當發酵溫度為25 ℃時，腥味強度最低。由圖1B 可知，腥味強度隨菌液稀釋倍數增加呈先下降后上升的趨勢，當活化菌液稀釋倍數為4 時，腥味最淡。由圖1C 可知，腥味強度隨溶劑添加量的增加先降低后升高，當料液比為1∶20（g/mL）時腥味強度最低。由圖1D 可知，隨著發酵時間的延長，腥味強度呈先下降后上升的趨勢，當發酵至4 h 時，腥味強度最低。相關研究表明，發酵時間、菌液稀釋倍數、料液比以及發酵溫度是影響酵母菌發酵的主要因素，發酵溫度過高或者過低都會對酵母菌活性造成一定的影響，從而影響其最終的脫腥效果[19]。顧賽麒等[5]研究表明脫除海帶腥味時酵母菌發酵溫度在25 ℃左右較適宜。本研究的發酵溫度條件與文獻[5]的研究結果相似，但活化菌液稀釋倍數、料液比及發酵時間存在差異，其主要原因是發酵的藻類原料不同。

2.2 發酵對江蘺揮發性成分的影響

GC-MS 分析結果如表2 所示。

表2 發酵前后江蘺揮發性化合物定性定量結果Table 2 Qualitative and quantitative results of volatile compounds before and after fermentation

由表2 可知，未經脫腥的江蘺樣品中共鑒定出7大類37 種揮發性成分，其中醇類8 種、烯烴1 種、醛類15 種、酮類3 種、酯類5 種、醚類1 種、其他類4 種；發酵脫腥的江蘺樣品中共鑒定出6 大類40 種揮發性成分，其中醇類12 種、醛類13 種、酮類4 種、酯類4 種、醚類1 種、其他類6 種。江蘺空白對照樣品的揮發性成分中，醇類主要有1-辛烯-3-醇（10.83%）、2-乙基己醇（25.78%），導致腥味的醛類主要有正己醛（21.83%）、（Z）-2-辛烯醛（56.86%）、（Z）-4-癸烯醛（10.57%）、（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛（46.97%），酮類主要有植酮（101.12%）。江蘺經過發酵后，醇類、醛類和酮類物質明顯減少，烯烴類和其他類物質明顯增多。相關研究表明，醛類、醇類化合物氣味閾值一般較低，通常會產生一些令人不愉快、辛辣的刺激性氣味，其中正己醛、2-辛烯醛、（Z）-4-癸烯醛、2，4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇等是腥味的主要貢獻者[20-22]。未發酵的江蘺含有一定量的1-辛烯-3-醇、正己醛、（Z）-2-癸烯醛、（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛和（Z）-4-癸烯醛，這些成分主要呈現腥味，可能是構成江蘺腥味的主要物質。酵母菌發酵后，正己醛未檢出，1-辛烯-3-醇由10.83%降至5.35%、（Z）-4-癸烯醛由10.57%降至3.92%、（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛由46.97% 降至12.13%。通過對比發現，經過發酵處理后，江蘺中的腥味成分大幅度降低，其中正己醛脫除率為100%，1-辛烯-3-醇降低率達51%，（Z）-4-癸烯醛降低率為63%，（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛降低率為74%，（Z）-2-辛烯醛降低率為13%，該結果與顧賽麒等[5]研究結果相似。此外，L-薄荷醇由0%增至6.95%，（E）-5-十二烯-1-醇由0%增至7.39%，（E）-香葉基丙酮由50.42% 增為60.94%。相關文獻報道，L-薄荷醇和（E）-5-十二烯-1-醇主要呈柑橘香和薄荷香，（E）-香葉基丙酮主要呈玫瑰花香[23]。根據Xu 等[24]研究結果，釀酒酵母發酵脫腥是在還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）/還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的前提下，烯酮還原酶、醛酮還原酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、環氧化物水解酶等催化發生醛、醇類的氧化還原反應、醚的分解以及酯化合成反應，將腥味成分轉化成無腥味的成分。以上研究結果說明，發酵后江蘺腥味的降低可能與其腥味成分大幅度降低有關，但也可能與其花香成分增加有關，其生化反應過程可能與酶催化的醛醇氧化還原反應、醚分解以及酯化合成反應相關。

2.3 發酵脫腥對江蘺粉應用性質的影響

發酵脫腥對江蘺粉應用性質的影響見表3。

表3 發酵脫腥前后江蘺粉理化性質對比Table 3 Comparison of physicochemical properties before and after fermentation

由表3 可以看出，經過發酵脫腥處理的江蘺樣品，腥味強度明顯降低，持水性、持油性、白度和凝膠強度有輕微變化。研究表明，膳食纖維多糖鏈能夠形成多孔結構，其大量親水基團可通過氫鍵作用來吸收和保持水分[25]。同時，膳食纖維結構上含有大量的疏水親油基團，使其具有良好的持油能力。此外，白度和凝膠強度對膳食纖維的應用也具有重要影響[26-27]。研究顯示，持水能力高的膳食纖維可以鎖定食品中更多水分，穩定食品的形態，減少焙烤類制品因脫水而引起的皺縮[28-29]。在酵母菌發酵過程中，江蘺粉的比表面積和親水基團增加，從而使其持水性提高。研究表明，高持油性的膳食纖維可以防止烹飪過程中脂肪流失，顯著改善食品的風味和口感，并使高脂食品更穩定，有助于延長保質期[30]。

3 結論

以江蘺為原料，研究直投式酵母菌發酵對海藻腥味強度、腥味成分、膳食纖維持水性、持油性、凝膠強度等應用性質的影響。結果表明，直投式酵母菌在發酵溫度25 ℃、菌液稀釋4 倍、江蘺與稀釋菌液比例1∶20（g/mL）、發酵時間4 h 條件下具有良好的發酵脫腥效果。酵母菌發酵后，江蘺樣品的腥味強度評分由2.28上升至9.67，腥味成分正己醛、1-辛烯-3-醇、（Z）-4-癸烯醛、（Z），（Z）-2，4-癸二烯醛明顯下降，持水性、持油性、白度及凝膠強度變化很小。本研究可為江蘺的脫腥及其膳食纖維的生產奠定技術基礎，還為其他海藻脫腥及其膳食纖維加工提供參考，對提高江蘺的加工利用價值具有重要參考意義。