植物復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠的降糖作用

黃雅晨，李瑤，李振港，李琦，杜婷，杜欣軍

（食品營養與安全國家重點實驗室，天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

糖尿病是一種治療周期久、醫療成本高的代謝性疾病，已成為威脅人類健康的第三大非傳染性疾病[1]，不僅嚴重影響了人們的生理健康、降低了生活質量，也對國家醫療和經濟發展造成了一定負擔。Ⅱ型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus，T2DM）占糖尿病患者總數的90% 以上[2]。隨著病程發展，患者會出現組織器官病變，極易導致患者死亡[3-4]。目前，臨床大多使用降血糖藥物或人工注射胰島素進行糖尿病治療[5]。然而，長期服用降血糖藥物會對患者身體造成難以挽回的損傷[6-8]。合理膳食是維持正常血糖水平的一種重要方式，研究發現許多藥食同源的植物次生代謝物具有良好的降糖功效且長期服用不會對身體造成損傷[9-10]。

青錢柳（Cyclocaryapaliurus），屬胡桃科青錢柳屬，是中國南方特有的稀有單子葉植物[11]，2013 年被列為新資源食品[12]。自20 世紀70 年代以來，青錢柳逐漸成為一種具有特殊風味的保健茶，對肥胖和糖尿病患者有益[13]，也是湖南西南地區土家族的一種常見藥材[14]。青錢柳葉中存在超過136 種化合物，主要包括黃酮類、多糖類和三萜類化合物以及酚酸、脂肪酸和多種微量元素[15-18]?！吨嗅t藥資源》第一版的典籍中記載，青錢柳的樹皮和葉片具有清熱解毒、生津止渴的潛在功效[14]。多項研究表明青錢柳葉具有較為理想的降血糖和降血脂功能[19-21]。桑葉富含多種活性成分，對降血糖、抗肥胖具有良好的功效[22-25]。我國桑葉資源極為豐富，開發基于桑葉的食品有利于拓寬桑葉應用途徑和產品價值[26]。懷山藥，是藥食同源植物，富含甾體、多糖、皂苷等多種活性成分[27-28]，具有降血糖、降血脂、降尿酸、抗炎、促進消化等多種功效[27，29-31]。市場上大部分懷山藥僅用于鮮食或者打粉等粗加工，對于其深加工綜合利用仍存在不足[32]。

目前市售降血糖產品主要以沖泡茶飲為主，由于功效成分的攝入有限，大大限制了其功效作用。本研究將青錢柳、桑葉及懷山藥提取物復配制成一款復合飲料，通過高脂飼料聯合鏈脲佐菌素注射誘導建立T2DM 小鼠模型，并評價復合飲料對糖尿病小鼠的治療效果，以期為植物基降糖飲料開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF 級C57BL/6J 雄性小鼠[體質量（19.0±1.0）g]、墊料、飼料：斯貝福（北京）生物技術有限公司；青錢柳提取物：西安瑞爾麗生物工程有限公司；懷山藥提取物：鄭州康吉元生物科技有限公司；桑葉提取物：陜西安康康元醫藥科技有限公司；仁和-鹽酸二甲雙胍緩釋片（規格0.5 g）：河北山姆士藥業有限公司；胰島素酶聯免疫檢測試劑盒、胰高血糖素樣肽-1 酶聯免疫檢測試劑盒、糖化血清蛋白檢測試劑盒、總膽固醇檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、低密度脂蛋白檢測試劑盒：南京建成生物科技有限公司。

1.2 主要儀器

安穩+型血糖儀：三諾生物傳感股份有限公司；Milli-Q?HX 7000 超純水儀：密理博儀器（上海）有限公司；GJJ-1/25 高壓均質機：上海諾尼輕工機械有限公司；SY-1-2 恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司；BSA224S-CW 分析天平：德國賽多利斯公司；JA260313 電子天平：上海精科天美科學儀器有限公司；5424C-150339 型臺式離心機：艾本德（中國）有限公司；SCIENTA-48 高通量組織研磨機：寧波新芝生物科技股份有限公司；MR-96A 酶標儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 復合飲料制作工藝及操作要點

操作要點：

1）過篩：按青錢柳提取物∶懷山藥提取物∶桑葉提取物為15∶10∶1（質量比）混合后過60 目篩，篩出大顆粒雜質的同時使物料混合均勻。

2）復配：添加復合穩定劑之前將其先進行溶解后再與其他物料混合，防止穩定劑溶解不完全影響產品口感及狀態。

3）均質：在壓力為35 MPa，溫度為50 ℃條件下均質2 次，提高物料分布均勻性，使產品各組分均一穩定。

4）脫氣：除去液體中溶解的空氣和附著于漿質粒子表面的氣體，抑制物料起伏，減少灌裝及滅菌時起泡。

5）灌裝：采用真空灌裝以減少產品與空氣的接觸，保證產品質量。

6）滅菌：采用高溫殺菌的方法，95 ℃保持20 min。

1.3.2 動物實驗設計

選用84 只健康6～8 周齡SPF 級雄性C57BL/6J小鼠，飼養溫度為（23±2）℃，濕度為50%，12 h 光照和12 h 黑暗交替，小鼠自由攝食和飲水，定期更換墊料、飼料和無菌水，飼養1 周后，84 只C57BL/6J 小鼠被隨機分成正常組（24 只）和造模組（60 只）。正常組24 只小鼠被分為正常飼養組（normal control，NC）和正常灌胃飲料組（beverage control，BC），并飼喂標準飼料；對造模組小鼠腹腔注射60 mg/kg 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）同時持續喂食高脂飼料以誘導建立T2DM 小鼠模型，72 h 后當小鼠空腹血糖值大于11.1 mmol/L，伴隨“三多一少”癥狀且下一個72 h 的空腹血糖值穩定升高即為造模成功。將造模成功后的T2DM 小鼠隨機均分為5 組，分別為糖尿病模型組（diabetes control，DC）、二甲雙胍組（metformin，Met，60 mg/kg）、飲料低劑量組（beverage in low dose group，BL，150 mg/kg）、飲料中劑量組（beverage in middle dose group，BM，300 mg/kg）、飲料高劑量組（beverage in high dose group，BH，600 mg/kg），每組12 只。實驗期間對7 組小鼠分別灌胃對應溶劑，持續5 周，小鼠自由采食飲水，每天上午9 點灌胃。

1.3.3 生理指標測定

每周一21 時稱量小鼠體質量、飲食量、飲水量；每周二9 時測量小鼠空腹血糖值，測量前10 h 對小鼠禁食；5 周灌胃期結束，小鼠禁食10 h 后灌胃2.0 g/kg 葡萄糖溶液，并在0、30、60、90、120 min 時測定小鼠血糖值。隨后摘取小鼠眼球取血，分離血清并檢測胰島素水平，計算胰島素抵抗指數；利用各類試劑盒檢測胰高血糖素樣肽-1、糖化血清蛋白、血脂水平。脫頸處死后解剖小鼠，取肝臟、胰腺后稱重，保存于多聚甲醛溶液中用于后續病理切片分析。利用實時熒光聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測肝臟中胰島素代謝通路關鍵基因的mRNA 相對表達量，目的基因的引物序列信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers

胰島素抵抗指數（homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）計算公式如下。

式中：H為HOMA-IR；I為血清胰島素水平，mIU/mL；F為空腹血糖水平，mmol/L；22.5 為校正因子，指在正常理想個體中5μU/mL 血漿胰島素，對應4.5 mmol/L的血糖水平。

1.4 數據統計分析

使用IBM SPSS Statistics 23.0 和Graph Pad Prism 8.0 進行數據分析；組間均值比較采用單因素方差分析，使用t檢驗方法，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠飲食量、飲水量及體質量的影響

復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠飲食量、飲水量及體質量的影響見圖1。由圖1 可知，BM、BH 組小鼠飲食量有一定上升但與NC 組無明顯差異，飲水量呈上升狀態。灌胃期間，DC 組小鼠體質量持續下降，BL 組與BH 組小鼠體質量呈下降趨勢但下降程度弱于DC 組，BM 組小鼠體質量較穩定，無明顯下降。BH 組小鼠體質量減輕較多但根據血糖水平等其它指標綜合考慮，可能是由于劑量較高而產生降脂作用導致小鼠體質量減輕。上述結果表明復合飲料可以顯著改善糖尿病小鼠“三多一少”的癥狀。

圖1 復合飲料對T2DM 小鼠飲食量、飲水量及體質量的影響Fig.1 Effects of beverage on food intake，water intake and body weight in T2DM mice

2.2 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖水平的影響

復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖水平的影響見圖2。

圖2 復合飲料對T2DM 小鼠空腹血糖值的影響Fig.2 Effects of beverage on fasting blood glucose levels in T2DM mice

由圖2 可知，DC 組小鼠空腹血糖水平在整個灌胃期間持續升高。灌胃1 周后，Met 組及飲料干預組小鼠空腹血糖持續下降。復合飲料干預5 周后，BL、BM、BH 組小鼠的空腹血糖分別下降了26.64%、38.49%、36.80%。

2.3 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影響

復合飲料對T2DM 小鼠口服葡萄糖耐量曲線及其曲線下面積的影響見圖3。

圖3 復合飲料對T2DM 小鼠口服葡萄糖耐量曲線及其曲線下面積的影響Fig.3 Effects of beverage on OGTT and area under the curve in T2DM mice

由圖3 可知，灌胃葡萄糖120 min 后，DC 組血糖稍有下降但仍未恢復至初始水平。與DC 組相比，BL、BM、BH 組的曲線下面積值分別降低了11.55%、19.81% 和14.11%（P＜0.001），BM 組效果最佳。上述結果表明復合飲料可以改善T2DM 小鼠葡萄糖的吸收狀況，降低餐后血糖水平。

2.4 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

復合飲料對T2DM 小鼠血清胰島素水平和胰島素抵抗指數的影響見圖4。

圖4 復合飲料對T2DM 小鼠血清胰島素水平和胰島素抵抗指數的影響Fig.4 Effects of beverage on serum insulin level and HOMA-IR in T2DM mice

由圖4 可知，與NC 組相比，DC 組小鼠的血清胰島素水平高度顯著升高（P＜0.001），說明小鼠出現胰島素抵抗癥狀。飲料干預組小鼠血清胰島素水平與胰島素抵抗指數均高度顯著降低（P＜0.001）。上述結果表明復合飲料能夠提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗。

2.5 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠胰高血糖素樣肽-1水平的影響

復合飲料對T2DM 小鼠血清胰高血糖素樣肽-1 水平的影響見圖5。

圖5 復合飲料對T2DM 小鼠血清胰高血糖素樣肽-1 水平的影響Fig.5 Effects of beverage on serum GLP-1 level in T2DM mice

由圖5 可知，與NC 組相比，DC 組小鼠血清胰高血糖素樣肽-1 水平高度顯著降低（P＜0.001），說明小鼠胰高血糖素樣肽-1 代謝紊亂，不能有效調控血糖。與DC 組相比，Met、BL、BM、BH 組小鼠血清胰高血糖素樣肽-1 水平均高度顯著升高（P＜0.01），分別升高了61.60%、23.04%、53.90%、46.84%。

2.6 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠糖化血清蛋白水平的影響

復合飲料對T2DM 小鼠糖化血清蛋白水平的影響見圖6。

圖6 復合飲料對T2DM 小鼠糖化血清蛋白水平的影響Fig.6 Effects of beverage on GSP level in T2DM mice

由圖6 可知，與NC 組相比，DC 組小鼠糖化血清蛋白水平高度顯著升高（P＜0.001）。與DC 組相比，BM、BH 組小鼠糖化血清蛋白水平均高度顯著降低（P＜0.001），分別降低了32.80%、29.53%。表明復合飲料能夠較好的控制小鼠血糖水平的升高。

2.7 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟組織病理學的影響

復合飲料對T2DM 小鼠肝臟組織形態學影響見圖7。

圖7 復合飲料對T2DM 小鼠肝臟組織形態學影響Fig.7 Effects of beverage on liver morphology in T2DM mice

由圖7 可知，NC 組與BC 組小鼠肝臟組織結構正常，細胞排列整齊緊密，肝細胞胞核清晰。DC 組小鼠的肝臟組織結構重度異常，肝細胞大面積重度脂肪變性，肝實質內可見炎癥細胞浸潤。復合飲料干預組小鼠肝胞質內脂滴數量明顯減少，肝實質內未見炎癥。

2.8 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠胰腺組織病理學的影響

復合飲料對T2DM 小鼠胰腺組織形態學影響見圖8。

圖8 復合飲料對T2DM 小鼠胰腺組織形態學影響Fig.8 Effects of beverage on pancreas morphology in T2DM mice

由圖8 可知，NC 組與BC 組小鼠胰腺組織結構正常，腺泡細胞胞核清晰，胞質豐富。DC 組小鼠胰腺組織結構重度異常，視野內組織結構紊亂，大面積腺泡細胞壞死，個別腺泡細胞內可見空泡。復合飲料干預組小鼠胰腺組織結構輕度異常，視野內組織結構緊密，少量腺泡細胞壞死，以中劑量組作用效果最為明顯。

2.9 復合飲料對Ⅱ型糖尿病小鼠肝臟胰島素通路關鍵基因表達的影響

復合飲料對胰島素受體（insulin receptor，IR）、胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）、胰島素受體底物-2（insulin receptor substrate-2，IRS-2）mRNA 表達的影響見圖9。

由圖9 可知，與NC 組相比，DC 組小鼠肝臟中IR、IRS-1、IRS-2 的表達量均高度顯著下調（P＜0.001），說明模型組小鼠胰島素轉運信號傳遞受阻。復合飲料干預組的肝臟IR、IRS-1 的mRNA 表達量與DC 組相比顯著上調（P＜0.05），而IRS-2 的mRNA 表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。BM、BH 組與Met 組小鼠肝臟中IR 的表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。此外，與陽性對照組相比，實驗組小鼠肝臟中IRS-1、IRS-2 的表達量均顯著下調。綜上結果表明復合飲料可能通過上調IR和IRS-1 的mRNA 表達水平來提升Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素信號轉導，進而促進葡萄糖轉運，緩解血糖水平。

3 討論

桑葉中的各種成分已被證明具有降血糖活性，包括1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ）、類黃酮、多糖，綠原酸和蘆丁等[33]，其中黃酮類化合物被證明能夠抑制糖尿病大鼠的小腸雙糖酶，1-DNJ 可以通過抑制α-葡萄糖苷酶來降低糖尿病模型小鼠的血糖水平[34]。

桑葉多糖被證明在體外實驗中具有清除羥基自由基和超氧陰離子自由基效應，并可以通過清除自由基和修復被破壞的胰腺β 細胞來保護糖尿病小鼠的胰島免受損傷，并修復被破壞的胰β 細胞[35]。

懷山藥中多糖含量豐富[36]，Zhang 等[37]通過體外實驗測定懷山藥多糖對α-淀粉酶抑制作用效果，驗證了懷山藥多糖的降血糖功效，Fan 等[38]發現懷山藥多糖可增加糖尿病小鼠的抗氧化酶活性水平。它被認為是預防胰腺β 細胞氧化損傷的膳食自由基清除劑的重要作用。

Wang 等[39]的試驗結果表明青錢柳活性提取物具有降血糖以及改善口服糖耐量的功效。青錢柳多糖和黃酮的降血糖機制，一方面可能是通過調節肝臟糖代謝，增加肝糖原合成及葡萄糖消耗量，抑制糖異生作用，進而降低血糖濃度；另一方面，可能是通過增加胰島細胞數目，增大胰島細胞面積，減輕胰島細胞變性程度，恢復病變胰島細胞的結構和功能，調節代謝，從而起到治療糖尿病的作用[40]。

通過建立鏈脲佐菌素注射建立Ⅱ型糖尿病小鼠模型，來評估復合飲料的體內降血糖效果，結果發現復合飲料能夠降低糖尿病小鼠空腹血糖值，其中與模型組相比中劑量飲料組小鼠空腹血糖下降了38.49%、糖化血清蛋白水平顯著升高了53.90%、糖化血清蛋白水平也顯著降低了32.80%、小鼠肝臟、胰腺組織形態未見明顯損傷，因此復合飲料可能通過抑制α-葡萄糖苷酶活性、提升胰島素信號轉導，促進葡萄糖轉運治療等機制來緩解Ⅱ型糖尿病及一系列并發癥。

4 結論

研究采用高脂飼喂聯合STZ 注射建立T2DM 小鼠模型，通過灌胃復合飲料探究其對T2DM 的糖脂代謝調節作用及劑量效應關系，并從分子水平進一步探究復合飲料調控T2DM 小鼠胰島素轉運通路關鍵基因的mRNA 表達的作用機制。結果表明復合飲料具有良好的降血糖功效。小鼠“三多一少”癥狀、空腹血糖值、血清胰島素水平、糖化血清蛋白水平、血脂水平、肝臟及胰腺組織損傷均得到改善。復合飲料可能通過上調IR 和IRS-1 的mRNA 表達水平來提升胰島素信號轉導，進而促進葡萄糖轉運。綜上所述，該植物復合飲料可調節小鼠糖脂代謝，促進胰島素信號傳遞，進而調控機體葡萄糖轉運代謝水平。