宮頸癌組織中DACT2啟動子甲基化與宮頸癌細胞侵襲和轉移的關聯

謝 旭

南陽市第一人民醫院婦科，河南 南陽 473000

宮頸癌是最常見的癌癥之一，是女性癌癥死亡的第三大原因。越來越多的研究［1］表明，長期感染高危人類乳頭瘤病毒（HPV）、HPV16、HPV18 等是宮頸癌患者的主要組成部分。事實上，并不是所有的轉移性宮頸癌患者都被診斷為HPV感染，這表明許多不確定因素可能導致宮頸癌的開始和發展。盡管手術結合放療和/或化療已經取得進展，但部分宮頸癌患者出現原發腫瘤侵襲和早期轉移，導致預后不良，治療效果不佳［2］。因此，闡明宮頸癌轉移的分子機制非常重要。

通過篩選與Wnt 信號中樞的散亂蛋白相互作用的蛋白，研究者分離出了β-環連蛋白抑制基因（DACT）支架蛋白家族，包括DACT1、DACT2 和DACT3。DACT 又名Dapper／Frodo，DACT 家族最初是在非洲爪蟾中發現的，其能夠結合Dsh 并且穩定β-catenin 降解復合物。DACT 編碼可以調節細胞間信號通路的脊椎動物細胞內蛋白，根據以往的報道，DACT 蛋白在不同的腫瘤類型中都具有抑制腫瘤的作用［3］。此外，在肝癌、乳腺癌、肺癌、結直腸癌等部分原發腫瘤和腫瘤細胞系中發現DACT1 和DACT2 表達下降和啟動子高甲基化，但在宮頸癌組織中DACT2的基因啟動子甲基化作用機制尚不清楚［4］。在本研究中，研究者試圖檢測DACT2 在宮頸癌組織中的作用和甲基化狀態，并闡明其與宮頸癌細胞侵襲和轉移的關聯性，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020 年1 月—2022 年3 月在南陽市第一人民醫院就診的60 例宮頸癌患者作為觀察組，再選擇同期60 例健康體檢者作為對照組。納入標準：經組織病理學檢查均確診為宮頸癌且均首次確診，此前未通過任何方式進行治療，患者臨床資料完整。排除標準：處于妊娠期或者哺乳期，除宮頸癌之外患有其他各種惡性腫瘤，患有宮頸婦科炎癥，由于各種原因無法配合完成本次研究。本研究獲得醫院醫學倫理委員會的批準，并提供了參與研究的知情同意書。術后采集其宮頸癌組織及配對正常相鄰宮頸癌組織，立即用液氮保存，宮頸癌及癌旁正常組織切片均于醫院病理科取得。

1.2 方法

1.2.1 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和實時熒光定量RT-PCR 檢測mRNA 表達 根據試劑盒的使用說明書，使用Trizol 試劑從組織中分離總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度法評價RNA 的質量和數量，其中引物按照RT-PCR 試劑盒說明書中推薦完成選擇，以甘油醛—3—磷酸脫氫酶（GAPDH）基因作為內對照。對于PCR 產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色顯示，并使用圖像分析系統進行定量。采用Stepone Plus 熱循環儀和SYBR 綠色PCR Master Mix 進行實時PCR 反應，目的基因表達量采用2-△△CT 法，用GAPDH 歸一化，每個樣品重復進行3 次上述反應［5］。

1.2.2 DACT2免疫組化觀察 采用親和素—生物素復合物免疫過氧化物酶免疫染色法檢測組織中DACT2、DACT 表達。阻斷內源性過氧化酶和非特異性反應后，用兔抗人多克隆抗體DACT2（1∶100稀釋）孵育載片，然后用生物素化二抗和ABC 試劑孵育，以3,3’—二氨基聯苯胺為顯色劑，蘇木精反染，陰性對照用非免疫血清代替一抗作為陰性對照，以DACT2染色陽性的載玻片為陽性對照。DACT2表達按照評分方法進行評估，評分與陽性細胞的強度和百分比有關［6］。

1.2.3 甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）和亞硫酸氫鹽基因組測序（BGS）分析DACT 甲基化 用DNAzol 組織中分離總DNA，用蛋白酶K 消化法從組織中制備基因組DNA?；蚪MDNA 用Epitect Fast 亞硫酸氫鹽轉換試劑盒完成相關處理，未甲基化的胞嘧啶經亞硫酸氫鈉處理后可轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不能轉化，仍然是胞嘧啶?；趤喠蛩釟溻c處理后甲基化和非甲基化等位基因的DNA 序列電位差，研究者設計了MSP 引物來分析DACT2的區域。DACT2的甲基化狀態在包含轉錄起始點位區域內測定，用2%瓊脂糖凝膠和溴化乙錠對MSP產品進行分析，并在紫外照明下進行可視化?；蚪MDNA 使用CpG 甲基轉移酶處理，作為陽性對照，以水空白為陰性對照。為保證質量控制，對每個樣品進行重復甲基化分析。針對BGS，設計了用于識別亞硫酸氫鈉轉化DNA 的引物，純化BGS PCR產物的目的片段，克隆到pGEM-T載體上，每個標本的10個克隆進行熒光自動測序［7］。

1.3 觀察指標

統計宮頸癌患者的病理特征，包括年齡、腫瘤大小、FIGO 分期、有無細胞轉移以及宮頸浸潤深度；根據1.2 方法檢測宮頸癌組織、癌旁組織和正常組織的DACT2去甲基化發生率、DACT2 mRNA 和蛋白表達水平；采用Pearson檢驗法，分析DACT2啟動子甲基化與宮頸癌細胞侵襲和轉移的關聯性，其中檢驗水準為α=0.05。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌患者的病理特征

宮頸癌患者的病理特征中分期、有無細胞轉移以及宮頸浸潤深度所占百分比比較，差異有統計學意義（P＜0.05），而年齡和腫瘤大小比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 宮頸癌患者的病理特征（n=60）

2.2 DACT2去甲基化發生情況

宮頸癌組織、癌旁組織和正常組織中DACT2去甲基化發生率分別為45.00%、6.67%和5.00%，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 DACT2去甲基化發生情況

2.3 DACT2 mRNA和蛋白表達水平

宮頸癌甲基化組DACT2 mRNA 和DACT2 蛋白表達水平低于宮頸癌非甲基化組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 DACT2 mRNA和蛋白表達水平（±s）

表3 DACT2 mRNA和蛋白表達水平（±s）

組別宮頸癌甲基化組宮頸癌非甲基化組t值P值DACT2 mRNA 0.78±0.14 1.54±0.19 11.332 0.001 DACT2蛋白1.13±0.19 2.38±0.26 8.543 0.001

2.4 DACT2 啟動子甲基化與宮頸癌細胞侵襲和轉移相關性分析

相關性分析結果表明，DACT2啟動子甲基化是引發宮頸癌細胞侵襲和轉移的因素，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。

表4 DACT2啟動子甲基化與宮頸癌細胞侵襲和轉移相關性分析結果

3 討論

DACT 家族蛋白最初在爪蟾中被發現。人類DACT 家族有3個成員，DACT1、DACT2和DACT3的編碼基因分別位于人類14q22.3、6q27 和19q13.32 染色體上。此前的研究［8-9］表明，人類DACT 在人類癌癥中經常是沉默的，例如DACT2 基因所在的6q 染色體的缺失是人類腫瘤中最常見的染色體畸變之一，除了缺失外，DACT 的表觀遺傳修飾也被報道。例如有報道稱［10］DACT1 和DACT2 在肝細胞癌、口腔鱗狀癌、胃癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、結腸癌和肺癌中被甲基化，此外，DACT3在甲狀腺乳頭狀癌中被發現有組蛋白修飾［11］。DACT2 在宮頸癌中的功能和表達調控在很大程度上是未知的。

采用RT-qPCR 和Western blot 方法檢測DACT2 啟動子甲基化在宮頸癌組織中的表達情況。結果表明，宮頸癌組織、癌旁組織和正常組織中DACT2去甲基化發生率分別為45.00%、6.67% 和5.00%。同 樣 的，有 研 究［12］發 現，DACT2在乳腺癌組織和細胞系中經常處于沉默狀態，對這些DACT2 沉默的乳腺癌組織和細胞系的MSP 分析表明，DACT2 啟動子高甲基化，且乳腺癌細胞中DACT2 的丟失主要是由于DACT2 啟動子區域的甲基化。DACT2 基因編碼的Dapper2 蛋白對Wnt 通路具有較強的抑制作用，可通過對Wnt 通路中的Dishevelled 因子相互作用并促進其降解，來減弱由GSK3β、Axin 等組成的降解復合物對通路中心因子β-catenin 的降解，以抑制該信號通路的活化，從而抑制腫瘤的發生發展。

此外，本研究結果還發現，宮頸癌甲基化組DACT2 mRNA 和蛋白表達水平低于宮頸癌非甲基化組。相關性分析結果表明，DACT2啟動子甲基化是引發宮頸癌細胞侵襲和轉移的因素。同樣有研究［13］用細胞生長曲線法評價DACT2 對乳腺癌細胞增殖的影響，用Transwell 法評價DACT2 對癌細胞侵襲能力的影響，發現DACT2 過表達可抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲，而DACT2 啟動子甲基化可促進乳腺癌細胞的增殖和侵襲。目前的數據表明，DACT2 在乳腺癌中發揮腫瘤抑制因子的作用。DNA 甲基化是一種主要的表觀遺傳機制，涉及甲基轉移到C5 碳殘基的胞嘧啶（5mC），由一個DNA 甲基轉移酶家族介導DNA 甲基化在多種生物學過程中發揮重要作用，包括基因表達調控、基因組印記、細胞分化、發育和炎癥異常甲基化，大多數DACT2 均是未甲基化的，這些DACT2 的高甲基化是腫瘤細胞中常見的改變之一，可能導致腫瘤抑制基因的沉默［14］。而DACT2 基因在肺癌細胞中被高甲基化，一些研究已經報道甲基化標記比蛋白質標記更敏感，因此，癌癥特異性甲基化標記在臨床上用于準確診斷癌癥有很大的潛力［15-16］。

綜上所述，宮頸癌細胞侵襲和轉移主要影響因素就是DACT2 啟動子甲基化，且DACT2 啟動子甲基化率越高，細胞侵襲和轉移程度就越高。因此，臨床應密切監測患者DACT2啟動子甲基化情況，有助于優化宮頸癌患者的治療方案。此外，本研究提示DACT2啟動子甲基化可能促進了乳腺癌的進展，這也為乳腺癌的治療提供了一個有希望的治療靶點。