PD-L1激活NF-κB促進子宮內膜癌細胞上皮間質轉化的作用研究

牛玉苗 黃浩 陳曉靜

[摘要]?目的?探討程序性死亡蛋白配體-1（programmed?death?ligand-1，PD-L1）過表達對子宮內膜癌細胞Ishikawa上皮間質轉化的影響及可能機制。方法?使用實驗室構建的PD-L1過表達穩轉細胞株Ishikawa/PD-L1及穩轉空載對照組Ishikawa/EV，qPCR及Western?blot法檢測PD-L1過表達效率，Transwell和劃痕實驗檢測細胞遷移能力和侵襲活性，Western?blot法檢測上皮間質轉化相關蛋白表達和核轉錄因子-κB（nuclear?factor?kappa-B，NF-κB）磷酸化水平。結果?與對照組相比，Ishikawa/PD-L1遷移能力與侵襲活性顯著增強，Vimentin、N-cadherin、p-p65蛋白表達明顯升高，E-cadherin表達明顯下調。結論?PD-L1可通過誘導NF-κB信號通路激活，促進上皮間質轉化，進而增強子宮內膜癌細胞的遷移、侵襲能力。

[關鍵詞]?子宮內膜癌；程序性死亡蛋白配體-1；核轉錄因子-κB；上皮間質轉化

[中圖分類號]?R737??????[文獻標識碼]?A????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2024.08.014

Role?of?PD-L1?on?promoting?epithelial-mesenchymal?transition?by?activating?NF-κB?in?endometrial?cancer

NIU?Yumiao，?HUANG?Hao，?CHEN?Xiaojing

Zhejiang?Provincial?Key?Laboratory?of?Precision?Diagnosis?and?Therapy?for?Major?Gynecological?Diseases，?Womens?Hospital，?School?of?Medicine，?Zhejiang?University，?Hangzhou?310006，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?effect?of?programmed?death?ligand-1?（PD-L1）?overexpression?on?epithelial?mesenchymal?transformation?（EMT）?in?endometrial?cancer?cells?and?its?possible?mechanism.?Methods?Ishikawa/PD-L1，?a?PD-L1?stable?overexpression?cell?line?constructed?in?the?laboratory?and?the?control?Ishikawa/EV?were?used.?The?efficiency?of?PD-L1?overexpression?was?detected?by?qPCR?and?Western?blot?assay.?The?cell?migration?ability?and?invasion?activity?were?detected?by?scratch?assay?and?Transwell?assay.?The?EMT-related?protein?and?the?phosphorylation?level?of?nuclear?transcription?factor-κB（NF-κB）?were?detected?by?Western?blot.?Results?Compared?with?the?control?group，?the?migration?ability?and?invasion?activity?of?Ishikawa/PD-L1?were?significantly?enhanced，?and?the?expression?of?E-cadherin?was?significantly?down-regulated，?whereas?vimentin，?N-cadherin?and?p-p65?were?significantly?increased.?Conclusion?PD-L1?can?promote?EMT?by?inducing?the?activation?of?NF-κB?pathway，?and?thus?enhance?the?migration?and?invasion?ability?of?endometrial?cancer?cells.

[Key?words]?Endometrial?carcinoma;?programmed?death?ligand-1;?Nuclear?factor?kappa-B;?Epithelial?interstitial?transformation

子宮內膜癌近年來呈現總體發病率持續上升和年輕化趨勢。據中國癌癥中心2022年統計數據顯示，我國子宮內膜癌發病率居女性生殖系統惡性腫瘤的第2位，新發病例約為8.2萬，嚴重威脅女性健康[1]。盡管大多數患者為早期病變且預后較好，但仍有約13%的患者存在轉移和復發風險，晚期或復發性疾病患者預后不良，5年生存率僅為17%[2]。因此，深入研究并闡明促進子宮內膜癌轉移的分子機制對疾病的治療有著關鍵作用。

程序性死亡蛋白配體-1（programmed?death?ligand-1，PD-L1）是一種重要的免疫檢查點蛋白，通過與受體PD-1結合，抑制T細胞殺傷活性，促進腫瘤免疫逃逸。PD-L1在多個癌種中均有表達，部分晚期和轉移性腫瘤中表達水平明顯升高[3-4]。高表達的PD-L1可促進腫瘤細胞生長及遷移，導致疾病惡性進展[5]。PD-1/?PD-L1免疫檢查點抑制劑治療在晚期、復發性子宮內膜癌中的應用目前已逐步得到臨床研究的證實，但PD-L1在子宮內膜癌轉移復發中的角色和相關機制報道仍十分有限。

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal?transition，EMT）是子宮內膜癌惡性進展、轉移和復發的關鍵因素，與患者不良預后關系密切[6]。核轉錄因子-κB（nuclear?factor?kappa-B，NF-κB）通路是重要的EMT上游調控通路，可抑制E-cadherin表達，使細胞極性喪失，遷移能力增強，導致腫瘤的耐藥和轉移[7]。最近研究發現，NF-κB通路相關蛋白表達水平與子宮內膜癌疾病進展相關，晚期患者中蛋白陽性表達率顯著升高[8-9]。抑制NF-κB通路激活，能有效抑制子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡。在彌漫大B細胞淋巴瘤、非小細胞肺癌等多個癌種中，PD-L1與NF-κB的表達呈明顯的正相關[10-12]。PD-L1是否可以通過NF-κB信號通路調控子宮內膜癌EMT而發揮作用亟待研究。

本研究利用實驗室自主構建的PD-L1穩定過表達Ishikawa細胞株，著重觀察子宮內膜癌細胞中PD-L1表達與EMT及NF-κB的關系，在細胞水平上初步探討PD-L1對EMT的作用及可能的機制，為臨床上抗PD-L1免疫療法應用于子宮內膜癌提供理論依據。

1??材料與方法

1.1??實驗細胞及主要試劑

人子宮內膜癌細胞Ishikawa購買自ATCC；細胞總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、實時定量聚合酶反應試劑盒購自美谷生物科技（浙江）有限公司；RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；ECL化學發光超敏顯色試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；PD-L1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、NF-κB?p65、NF-κB?p-p65、β-actin等抗體購自美國Cell?Signaling?Technology公司；Transwell小室購自Millipore公司；劃痕實驗2孔插件購自德國Ibidi公司；無菌胎牛血清購自美國Gibco公司，DMEM培養基購自美國Invitrogen公司。

1.2??PD-L1過表達穩株構建

實驗室使用慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-?copGFP-T2A-Puro質粒（以下簡稱pCDH），EcoRI、XhoI內切酶對質粒進行雙酶切并回收；合成含酶切位點的PD-L1引物序列：F：3-gattctagagctagcgaattcG?CCACCATGAGGATATTTGCTGTCTTTATATTCA-5，R：3-gtctttgtagtccatctcgagCGTCTCCTCCAAATGTGT?ATCACT-5。以細胞cDNA為模板擴增目的基因；將擴增后的目的基因與回收載體同源重組，經轉化、擴增、抽提后進行測序。測序成功后，與包裝質粒共轉染293T細胞，獲取病毒液；感染Ishikawa細胞，經嘌呤霉素篩選獲得穩定轉染慢病毒的細胞株。穩定轉染PD-L1過表達載體的細胞株命名為Ishikawa/?PD-L1組，穩定轉染pCDH空載質粒的細胞株命名為Ishikawa/EV對照組。

1.3??RT-qPCR分析

收集對數生長期細胞，依照試劑盒說明書提取細胞總RNA，分光光度計分析測定濃度及質量，取1000ng反轉錄合成cDNA。采用2X?Universal?SYBR?Green?Fast?qPCR?Mix進行熒光定量PCR檢測。PD-L1引物序列上游為3-GCCGAAGTCATCTGGACAAG-?5，下游為3-AGTGTGCTGGTCACATTGAA-5；β-actin引物序列上游為3-GTCATTCCAAATAT?GAGATGCGT-5，下游為3-GCTATCACCTCCCCTG?TGTG-5。反應體系：cDNA?1μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，SYBR?green?5μl，RNase-Free?H2O補至10μl。以β-actin作為內參，2?ΔΔCt法相對定量計算穩轉細胞株中PD-L1?mRNA表達變化。

1.4??Western?blot法檢測

取對數生長期細胞，每孔加入100μl含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，離心收集上清，經濃度檢測、制樣后進行凝膠電泳，轉膜后分別用PD-L1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、NF-κB?p65、NF-κB?p-p65、β-actin一抗（依照說明書用一抗稀釋液進行配置）4℃孵育過夜，清洗后二抗室溫孵育1h，Azure400成像系統顯影拍照。以β-actin蛋白作為內參，用Image?J軟件處理圖像后得到各組蛋白表達的灰度值及蛋白相對表達量。

1.5??劃痕實驗

取對數生長期細胞清洗消化，用含10%?FBS的DMEM培養基重懸計數，將細胞密度調整至????5×105個/ml待用。取24孔板，將Ibidi插件有黏性的一面平穩放置于孔板中，固定插件。每孔加入70μl細胞懸液，置于37℃培養箱中培養。待細胞貼壁后小心移除插件，PBS洗去殘余液體，每孔加入500μl無血清DMEM培養基。在倒置熒光顯微鏡下觀察0、24、48h兩組細胞的遷移情況并進行拍照記錄。使用Image?J軟件處理圖片計算相對愈合率。

1.6??Transwell小室侵襲實驗

無血清培養基和Matrigel基質膠按8∶1比例進行配置，取50μl混合液緩慢滴入小室中，避免產生氣泡，隨后將小室置于37℃培養箱中靜置1h。取對數生長期細胞消化重懸，計數后用無血清培養基調整密度為1×106個/ml，取200μl懸空滴入小室，注意避免產生氣泡。取600μl含20%FBS的DMEM培養基加入孔板下室，小心放入培養箱中，避免孔板震蕩導致細胞鋪板不勻。培養24h后取出小室，PBS清洗2次，4%多聚甲醛與結晶紫混合液固定染色10min，顯微鏡下拍照，使用Image?J軟件進行圖像處理并計數。

1.7??統計學方法

采用GraphPad?Prism?8.0.2統計學軟件對數據進行處理分析，樣本數據符合正態分布，采用非配對t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??穩定轉染細胞株中PD-L1表達水平檢測

與對照細胞比較，Ishikawa/PD-L1細胞中PD-L1?mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），該細胞模型可用于檢測PD-L1過表達對EMT的影響，見圖1、圖2。

2.2??PD-L1過表達對細胞遷移能力與細胞侵襲活性的影響

與對照組比較，Ishikawa/PD-L1組細胞遷移距離更長，傷口愈合率更高（P<0.05，圖2）。與對照組比較，Ishikawa/PD-L1侵襲細胞數顯著增加（P

2.3??PD-L1過表達對EMT相關蛋白和p65蛋白磷酸化水平的影響

與對照組比較，Ishikawa/PD-L1組Vimentin、N-cadherin和p-p65蛋白表達明顯增加；E-cadherin蛋白明顯降低（P<0.05，圖3）。

3??討論

2013年癌癥基因組圖譜利用微陣列和測序技術對373例子宮內膜癌進行了基因組、轉錄組和蛋白質組學特征分析，將子宮內膜癌劃分為4類不同預后的亞型——POLE超突變型（7%）、微衛星高度不穩定/錯配修復缺陷型（28%）、低拷貝數變異型（39%）和高拷貝數變異型（26%）[13]。研究提示與其他癌種相比，子宮內膜癌發生微衛星高度不穩定/錯配修復缺陷的概率最高，約占初治子宮內膜癌30%，復發性子宮內膜癌13%～30%[14]。該亞型腫瘤突變負荷高，常伴有高表達的PD-1/PD-L1，CD3+/?CD8+細胞毒性T淋巴細胞占比也顯著升高，這些都為免疫檢查點抑制劑提供了理想的治療干預條件。隨著基礎研究的深入和臨床試驗的進行，越來越多的靶向藥物被嘗試用于晚期子宮內膜癌的治療，但整體有效率低和患者耐受性差等限制了抗PD-1/PD-L1藥物的一線應用[15-16]。深入研究PD-L1在子宮內膜癌疾病進展中的角色，挖掘新的藥物靶點顯得尤為重要。

最近有研究發現PD-L1在EMT、腫瘤干細胞樣表型、轉移等方面也具有重要作用。在食管癌中，PD-L1表達上調顯著增強細胞增殖、遷移和侵襲活性，促進EMT進程。在胃癌細胞中，敲降PD-L1顯著抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和G0/G1期阻滯，體內實驗也證明敲低PD-L1顯著抑制腫瘤生長。在膠質母細胞瘤中，RNA測序分析顯示PD-L1影響基因表達，且這些基因主要富集在細胞生長/遷移/侵襲通路中，進一步體外實驗證明PD-L1過表達可通過RAS/ERK通路促進EMT[17-19]。隨著研究的深入，越來越多的證據表明PD-L1表達所致的生物學行為可能與EMT存在聯系。

NF-κB通路在腫瘤轉移和復發中具有重要作用。在腦膠質瘤中，TGF-β1可通過NF-κB信號通路上調N-cadherin、Vimentin和Snail等蛋白表達，促進腫瘤細胞惡性進展。在結腸癌中，抑制NF-κB?p65/p50核轉位能顯著抑制COX-2和p-AKT等表達，反轉腫瘤細胞EMT。在卵巢癌中，SOS1蛋白可激活NF-κB信號通路，促進腫瘤轉移[20-22]。然而在子宮內膜癌中，PD-L1是否通過NF-κB通路調控EMT卻鮮有報道。

本研究發現PD-L1過表達可顯著增強子宮內膜癌細胞遷移侵襲能力，進一步研究發現其作用機制可能與下調E-cadherin及誘導NF-κB?p-p65、N-cadherin、Vimentin表達有關，豐富了PD-L1在子宮內膜癌惡性進展中的研究，為抗PD-L1治療提供了實驗基礎。然而PD-L1調控EMT更深層的機制和潛在的藥物靶點仍有待進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2023–04–26）

（修回日期：2023–11–27）