殼聚糖溫敏水凝膠在口腔相關組織工程的應用進展

庫得來提·阿不都克力木 ,董紅賓,多力昆·吾甫爾

自20世紀80年代第一次提出“組織工程”的概念后,因其打破外科“用創傷修復創傷”的傳統觀念,開創了通過“生物支架、干細胞、生長因子”結合修復創傷的新模式,從而受到生命科學界廣泛關注[1]。這種新型模式通過在體外用預先構建一個有生物活性的植入體,并將其植入體內以修復組織缺損及缺損處的生理功能。殼聚糖優良的生物相容性、黏膜黏附性、生物降解性、形成三維多孔結構的能力,無毒性,易于處理和低成本優點等,使得殼聚糖成為一種合適的生物材料,并且在組織工程中具有巨大的應用潛力[2]。

1 水凝膠及殼聚糖溫敏水凝膠概述

水凝膠作為一種具有三維網絡結構的交聯聚合物,高密度的親水基團可以保留大量的水或生物流體。并且其柔軟和通透性優良的特點與細胞外基質相似,能為細胞提供一個運輸營養和細胞增殖的平臺,最大程度地減少對細胞組織的損害[3]。此外,水凝膠還具有良好的孔隙率,能夠裝載和釋放各種藥物,對于纖維化和壞死的組織具有清創和脫屑的能力。同時,水凝膠的特性隨著缺損形態的不同而改變,決定了其在組織工程技術中廣泛的應用前景[4]。Finklea等[5]研究人員成功地將人類誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)封裝在聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)-纖維蛋白原微球水凝膠中,實現了對hiPSCs向功能性心肌細胞的引導和分化。值得一提的是,在分化的第8天,這些細胞已經具有了自發性的收縮,這將為心臟組織的再生和修復提供新的思路和方法。除此之外,水凝膠還廣泛用于神經組織工程中。Grimaudo等[6]報道了一種基于N-(2-羥基丙基)甲基丙烯酰胺(PHPMA)的水凝膠,該水凝膠用纖連蛋白Arg-Gly-Asp(RGD)進行功能化,模擬細胞外基質環境以繞過神經創傷后瘢痕愈合過程,并在體內大鼠脊髓中促進組織再生和支持軸突生長的能力,為神經創傷后的治療提供了新的方向和希望。在抗腫瘤治療方面,Lee等[7]設計了一種基于PEG聚合物凝膠的簡單合成方法,將氨基甲酸酯鍵引入維生素E-PEG-維生素E共聚物的嵌段鍵中。這種方法形成的凝膠在體內穩定性較高,可以持續釋放蛋白質達到17周以上,用于提供持續抗癌免疫的癌癥預防疫苗中。水凝膠以其獨特的條件敏感性、柔軟通透性、藥物載荷和釋放能力在生物醫學領域帶來了更多的希望與可能。

殼聚糖(chitosan,CS)是由隨機排列的β-(1,4)糖苷鍵連接D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖單元組成的線性多糖,其具有良好的抗菌性能與生物相容性,是目前發現的唯一的陽離子堿性多糖[8]。殼聚糖是通過對甲殼素進行脫乙?；@得的,而甲殼素是一種大量存在于甲殼類動物外骨骼及真菌細胞壁上的結構多糖,其自然來源比較豐富。此外,殼聚糖的反應性還可以通過取代其官能團來改變自身結構,從而可以與其他生物材料進行合成或結合,形成生物復合材料。這些修飾使CS的特性得以調節,例如溶解度、生物降解性和機械性能等[9]。與此同時,CS的脫乙酰程度(degrees of deacetylation,DD%)也會影響到其復合材料的生物相容性。對殼聚糖/β-甘油磷酸鹽水凝膠與降低DD%的殼聚糖的研究表明[10],低程度的脫乙酰提高了體外間充質干細胞(multipotent stromal cells,MSCs)的細胞活力,并明顯減少了材料植入Wistar大鼠皮下后的白細胞浸潤。

溫敏水凝膠是一種溫度敏感的水凝膠材料,其物理狀態會隨著環境溫度的變化而發生改變,從而導致溶膠-凝膠狀態的轉變。當受到溫度刺激時,這種具有溫度敏感性的高分子聚合物會從分散的膠束狀態轉變為致密的三維網絡結構,從而使凝膠形成并保持穩定的形態。當殼聚糖溫敏水凝膠置入缺損后,在殼聚糖自身抗菌能力、生物相容性等特性的協同作用下,可以促進組織缺損的修復。與常規水凝膠相比,溫敏水凝膠因其能隨溫度發生自身狀態的變化而適應機體缺損的形態,在藥物緩釋載體、血管神經再生、組織工程等方面具有顯著的優勢[11]。

2 常見CS溫敏水凝膠

2.1 殼聚糖/甘油磷酸鈉溫敏凝膠

殼聚糖/甘油磷酸鈉(CS/GP)溫敏水凝膠是由殼聚糖和甘油磷酸鈉兩種天然高分子材料交聯形成的溫敏型水凝膠。這種水凝膠的特點是其在室溫下可以保持液態,同時隨著溫度升高,高于生理溫度(37 ℃)時,水凝膠由液態變為固態。通過利用β-甘油磷酸鹽用作殼聚糖溫度敏感水凝膠的催化劑,并在適合的pH和生理溫度下將殼聚糖溶液中的流體轉化為凝膠相。這一變化的相關機制為:①殼聚糖鏈之間的氫鍵靜電相互作用和疏水鍵相互作用;②殼聚糖的加入增加了離子強度,從而減少了殼聚糖鏈之間的靜電排斥;③殼聚糖中的氨基反作用力和甘油磷酸中的磷酸基之間發生靜電吸引[12]。在Rahmanian-Devin等[13]的研究中發現,β-甘油磷酸鹽被認為是人骨髓干細胞培養基中的成骨因子,可導致骨髓干細胞向骨細胞分化。

2.2 殼聚糖/膠原水凝膠

膠原蛋白是機體中主要的細胞外基質蛋白,其功能是為反作用力提供機械支持,以抵抗最終的反復塑性形變。同時,膠原蛋白種類和纖維方向決定了組織中不同的細胞類型[14]。此外,膠原蛋白是動物體內中最豐富的蛋白質,其中富含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸等活性氨基酸。從生物學角度來看,膠原蛋白具有生物相容性和降解性突出、抗原性低等特點[15]。殼聚糖中添加的膠原蛋白可以獲得類似于天然骨骼的仿生結構,增加鈣和硫酸鹽糖胺聚糖的產生,并具有成骨和軟骨形成的潛力。這會使殼聚糖/膠原凝膠材料的機械性能得到了改善,同時顯示出更高的耐酶降解性[16]。

2.3 殼聚糖/羥基丁基水凝膠

羥基丁基CS(hydroxybutyl chitosan,Hbcs)是最重要的CS醚之一,通過醚化反應將羥基丁基與CS骨架的羥基和氨基偶聯而合成。Hbcs在水溶液中具有較低的臨界溶液溫度,約為19 ℃,且可在60 s內形成凝膠,是一種很有潛力的熱敏聚合物[17]。Hbcs水凝膠具有良好的生物相容性和降解性,植入機體幾周后會分解成無毒性的高度多孔結構,類似于細胞外基質的結構,有利于細胞的黏附與增殖。Dang等[18]評估了不同配方的Hbcs水凝膠作為可注射干細胞載體的潛力,用于輸送治療藥物,以促進退化椎間盤的生物學重建。目前,基于Hbcs的水凝膠在組織工程領域備受關注。其應用涉及多個方面,其中最重要的是應用Hbcs水凝膠來模擬細胞外基質的三維環境,從而實現血管化的組織結構和器官的逐層構建[19]。除此之外,基于Hbcs的水凝膠還廣泛應用于術后防粘連、傷口敷料、動脈栓塞劑、組織工程支架、藥物傳遞和細胞治療等領域,并且在臨床實踐中效果顯著。

3 殼聚糖溫敏水凝膠在組織工程中的應用

3.1 骨組織工程中的應用

3.1.1 頜面骨組織工程

作為頜面部的重要組成部分,頜骨在維持口頜系統的穩定性、咀嚼功能和面部外觀方面具有關鍵作用。先天性異常、藥物使用、局部炎癥、牙周炎、創傷性損傷、惡性腫瘤和拔牙等原因都可能導致頜面部骨缺損[20]。為了恢復骨缺損,臨床上常采用骨移植來恢復骨缺損,無論是自體骨移植還是異體骨移植都存在相應的缺陷。自體骨移植植骨區吸收且供區骨量不足、供區受創、感覺異常、功能受損、感染等問題,限制自體骨移植在臨床上的應用[21]。而對于異體骨移植來說,也需要面對相應的免疫排斥、組織相容、疾病交叉傳播,以及材料生物學或力學性能等方面潛在的問題。溫敏水凝膠的良好物理性質和合適的生物降解性已被證明是一種有價值的骨替代材料,骨組織基質中的糖胺聚糖結構與殼聚糖分子結構相似,有利于成骨細胞的附著、生長、增殖和分化[22]。

Wu等[23]將小胞外囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)添加到殼聚糖/β-甘油磷酸酯水凝膠(CS/β-GP)復合材料中,制備sEV/CS/β-GP水凝膠用于修復大鼠的顱骨缺陷。sEV是從細胞釋放到細胞外環境中的外泌體和微囊泡。sEV在保護其內容物(mRNA、miRNA和蛋白質)免受降解以及將其內容物遞送到細胞功能所需的受體細胞方面具有重要作用。實驗中發現,sEV/CS/β-GP水凝膠植入受體區后,sEVs從水凝膠中成功釋放,同時水凝膠的熱敏性提高了骨愈合能力,促進了顱骨缺損的修復。此外,sEV/CS/β-GP水凝膠還能夠促進血管生成和骨形成,從而為骨組織再生提供了良好的基質和支持。

在Pankongadisak等[24]的研究中,將絲膠蛋白(silk sericin,SS)加入CS/β-GP水凝膠后,可以明顯減少水凝膠的凝固時間并且加速水凝膠凝固的同時,還能釋放出更多的酚類化合物,提高水凝膠恢復功能性骨組織的潛力。與此同時,根據近期研究證實生物活性玻璃納米顆粒(bioactive glass nanoparticles,nBG)在骨組織工程技術中具有廣泛的應用前景。Moreira等[25]制備了殼聚糖/明膠/生物活性玻璃納米復合水凝膠(CH/GE/nBG hydrogels)并研究了該水凝膠對骨細胞再生效率的影響,發現該水凝膠促骨再生潛力優良,對骨細胞及組織沒有明顯毒性,生物相容性良好,為組織工程技術修復頜面骨缺損奠定了堅實基礎。

3.1.2 牙周骨組織工程

在修復牙周骨缺損方面,殼聚糖不僅可以作為組織工程支架和控制遞送載體,還具有良好的抗菌性能,對細菌或真菌具有殺菌作用[25]。重要的是,在室溫條件下,溫敏型水凝膠可以保持液體狀態,更有利于針對性地應用于通常難以觸及的深牙周袋。在Zang等[26]的研究中,他們將具有骨成骨細胞分化和牙周組織愈合的潛力的BMP-7生長因子(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)與奧硝唑(ornidazole,ORN)加載于CS/β-GP水凝膠,并且置入于比格犬的Ⅲ度根分叉病變中,術后發現所有水凝膠都形成了高度多孔的結構,這種結構利于營養物質的均勻分布及細胞的黏附增殖,促進牙周組織中血管和骨組織的再生。同時BMP-7以穩定和持續的方式從CS/β-GP水凝膠中釋放,刺激著成骨細胞增殖和分化,ORN又確保了水凝膠的抗菌性能,這些將使得根分叉病變附近有大量骨組織及牙骨質再生,并且周圍還有會有豐富的膠原纖維形成。這些實驗也證明了殼聚糖溫敏水凝膠通過成為組織工程支架及藥物緩釋系統在牙周再生工程的優勢及應用潛力。

3.2 軟組織工程中的應用

近年來,隨著對殼聚糖及殼聚糖溫敏水凝膠及其衍生物的進一步了解,殼聚糖也越來越多的應用于軟組織工程之中,例如牙髓-牙本質復合體再生、牙周軟組織再生及頜面部血管神經再生等。對于牙髓再生來說,由于牙髓系統是一種高度血管化和神經組織支配的復雜結構,因此牙本質-牙髓再生一直被認為是一個巨大的挑戰[27]。根據Wu等[28]的最新研究報告,使用殼聚糖/β-甘油磷酸鹽(CS/β-GP)水凝膠作為緩沖系統負載具有促進牙本質再生的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),并探討了其對牙髓干細胞(dental pulp stem cell,DPSC)的影響。研究發現CS/β-GP水凝膠對DPSC無細胞毒性,它還具有促進DPSC擴散、利于細胞分布的特點。同時,從后期礦化活性檢測及牙源性標志物的表達觀察,VEGF/CS/β-GP水凝膠可以持續釋放VEGF,并有助于DPSCs的牙源性分化及血管源性分化。因此,VEGF/CS/β-GP水凝膠可能成為牙髓及血管再生組織工程中具有潛力載體材料。另一方面,對于殼聚糖水凝膠的抗齲應用,在Ruan等[29]進行的一項研究中,通過將脫乙?；?5%殼聚糖與從重組DNA技術獲得的純化釉原蛋白rP172混合制備釉原蛋白-殼聚糖水凝膠(amelogenin-chitosan,CS-AMEL)作再為礦化劑用于再礦化侵襲性病變或類似齲齒病變的人類牙釉質。結果表明,CS-AMEL水凝膠有效地在具有侵襲性類齲病變表面形成了有組織的牙釉質狀晶體層。它還可以通過再生有組織的晶體來修復早期病變,并減少病變的深度。

殼聚糖溫敏水凝膠單獨載藥或與生長因子協同使用,為牙周軟組織再生治療提供了可行有效的新方案。Huang等[30]將具有良好抗菌性的氧化鋅納米顆粒(ZnO-NPs)負載于CS/β-GP溫敏水凝膠之中,發現ZnO-NPs/CS/β-GP水凝膠對鈦種植體周圍的牙齦卟啉單胞菌生物膜有明顯的抑制作用。同時,抗菌水凝膠可以吸收植體周圍組織滲出物,抑制生物膜形成,有利于恢復種植體周圍軟組織水平。Ammar等[31]通過將牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)置入凍干血小板濃縮物(freeze-dried platelet concentrate,FDPC)加入CS/β-GP溫敏水凝膠進行培養,培養2周后觀察PDLSC的活力。經實驗證實,在水凝膠中加入FDPC后可以顯著提高了PDLSC的活力,并且與體外標準基培養的PDLSC細胞活力相當。

神經再生組織工程領域正在密切關注一種新興治療方案,該方案利用口腔環境中易獲得的口腔間質干細胞,通過引導其定向分化來修復相關神經組織缺損。Cai等[32]使用殼聚糖溫敏水凝膠(CS/β-GP)作為培養支架,通過在水凝膠中嵌入表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管內皮生長因子等生長因子及二甲雙胍對人牙齦間充質干細胞(human gingival mesenchymal stem cells,hGMSCs)進行分化培養。研究發現,hGMSCs在負載二甲雙胍的殼聚糖溫敏水凝膠及生長因子的誘導下,表現出了功能性神經元樣的分化潛力,并探究了hGMSC最合適的生長和神經分化條件,為溫敏水凝膠聯合hGMSCs實現神經再生提供依據。

4 結 語

作為一種具有獨特特性和在生物醫學中廣泛應用的生物聚合物,殼聚糖及其衍生物一直受到各學科的廣泛關注。目前,研究中主要是通過將殼聚糖與其他天然或合成聚合物進行結合,從而改善其生物相容性及物理化學性能,降低其生物降解速率。同時,將生物活性因子、藥物或種子細胞與CS溫敏水凝膠復合誘導組織。重要的是,根據體內及體外研究結果表明,溫敏水凝膠支架大多數不但沒有細胞毒性,而且還能促進體內細胞的附著增殖,有利于機體組織的修復。

盡管在目前的臨床實踐中,CS溫敏水凝膠是一種可能的骨缺損修復替代材料,但是仍存在一些局限性:①由于機體內器官和組織的復雜性,由單一聚合物制成的殼聚糖水凝膠并不總能滿足所有要求。②用于骨再生的殼聚糖基材料的表征尚未得到標準化。雖然有許多關于殼聚糖支架作為潛在骨再生材料的研究,但使用的表征方法各不相同,這使得無法正確比較不同研究的結果并對材料的潛力得出最終結論。③如何控制水凝膠緩釋系統對釋放生物活性因子或藥物的釋放速度及釋放效能,以及如何降低分子材料自身可能引發的潛在炎癥反應對組織再生修復的不良影響等問題仍待解決。因此,未來殼聚糖溫敏水凝膠的研究重點可能會在優化殼聚糖表征的同時,能與多種生物活性因子相結合,獲得具有“智能”控制載體釋放及多層次修復組織缺損能力的新型CS溫敏水凝膠。

綜上所述,隨著對殼聚糖溫敏水凝膠的研究不斷深入和材料科學的不斷發展,相信未來殼聚糖溫敏水凝膠將能夠為口腔組織再生領域提供更為多樣化和精準化的治療方案。