解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株對擬石蓮花屬多肉植物黑腐病的生防效果*

劉 爽，唐 銳，譚 丹，薛治峰，李夢杰，張廷萍，秦世雯

(云南大學 農學院/資源植物研究院，云南 昆明 650500)

多肉植物是一類營養器官肥厚的觀賞植物，品種繁多，易栽培，深受全球消費者喜愛[1]。多肉植物是中國云南省“云花”產業的重要組成部分，截至2021 年，云南多肉植物生產面積超67 hm2，產量超3 000 萬盆[2]。景天科(Crassulaceae)擬石蓮屬(Echeveria)是近年來熱門的多肉植物種類，具有蓮花狀樁型，品種繁多，葉色和花色美麗，被廣泛應用于室內盆栽、城市綠化及園林景觀中。黑腐病是多肉植物生產和家庭種植過程中的主要病害之一，在全球多肉種植地均有發生，給多肉植物產業造成了一定的損失[3]。該病引起多肉植物的水層組織和維管束組織腐爛和萎蔫，造成葉片出現透明水漬狀病斑并脫落，莖部呈黑腐癥狀，最終導致植株枯萎死亡[4]。研究發現：擬石蓮屬黑腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，能夠危害血色羅密歐(E.agavoidescv.‘Romeo’)[5]、靜夜(E.derenbergiicv.‘Purpus’)[6]、彩虹(Echeveriacv.‘Rainbow’)[7]、東云(E.agavoides)[8]和紫珍珠(Echeveriacv.‘Perle von Nürnberg’)[9]等品種。

尖孢鐮刀菌作為全球防控難度最大的土傳病原真菌之一，能夠在無寄主的情況下長期存活于土壤中，而現有的化學藥劑和農業防治手段無法將其根除[3]。多肉植物黑腐病的防治主要采取化學防治手段，由于多肉植物多用于家庭種植，對其化學藥劑的毒性有較高要求。生物防治是使用生物拮抗劑(細菌、真菌等)，通過“以菌治菌”達到防病和促進寄主生長的目標[10]。生防菌劑具有綠色、環保、對人體安全等特點，是理想的多肉植物黑腐病防治手段。然而，多肉黑腐病的生物防治研究目前還處于空白。本研究從小粒野生稻(Oryza minuta)根部分離鑒定了1 株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) OMR1-7 菌株，通過測定其拮抗效果、產鐵載體和生物膜能力、定殖能力和溫室防效，以期明確其對擬石蓮屬多肉品種血色羅密歐和靜夜的生防效果，為多肉植物黑腐病的生物防治提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物品種：小粒野生稻，由農業農村部多年生稻生物學與種質創新重點實驗室提供；擬石蓮屬多肉植物血色羅密歐和靜夜購于云南昆明一多肉植物商業大棚。

供試病原菌：血色羅密歐黑腐病菌F.oxysporumKMEARM-2[5]和靜夜黑腐病菌F.oxysporumKMJY6[6]均由云南大學農學院植物病理學研究室鑒定和提供。

供試載體：GFP 標記解淀粉芽孢桿菌OMR 1-7 菌株所用遺傳轉化載體pGFP4 412 由中國農業大學王埼教授惠贈。

1.2 生防細菌的分離

采用組織分離法[11]，從健康的小粒野生稻上剪取根部組織，無菌水沖洗干凈表面污漬后用濾紙吸干表面水分。根部組織經75%酒精浸泡5 min、無菌水漂洗1 次、2.5%次氯酸鈉浸泡3 min、無菌水漂洗3 次后，用無菌濾紙吸干表面水分。將根部組織放入無菌研缽中，加入適量無菌水，研磨后對研磨液進行梯度稀釋，吸取組織液100 μL涂布于LB 固體培養基[12]上；同時吸取第3 次漂洗液100 μL 涂布于LB 固體培養基，若無細菌生長表明根部表面已徹底消毒。將以上平板置于37 ℃黑暗培養1～3 d 直至有菌落長出，挑取形態不同的細菌菌落進行純化和保藏。

1.3 生防菌株的鑒定

1.3.1 形態學鑒定

將OMR1-7 菌株劃線培養于LB 培養基，37 ℃培養24 h 后觀察其單菌落形態，隨后進行革蘭氏染色并觀察其菌體形態特征。

1.3.2 分子序列特征鑒定

利用TIANGEN 細菌基因組DNA 提取試劑盒提取OMR1-7 菌株的DNA；利用16S rDNA 引物27F (5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492-R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)以及gyrA基因引物gyrAF (5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′)和gyrAR (5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′)進行PCR 擴增；擴增片段經電泳和測序檢測后，在NCBI 數據庫進行Blastn 比對分析，并提交至國家生物信息中心Genbase 數據庫(https://ngdc.cncb.ac.cn/genbase)；利用MEGA11.0軟件以鄰接法構建16S rDNA 和gyrA系統發育樹，Bootstrap 值設為1 000。

1.4 拮抗效果的測定

1.4.1 菌絲抑制率的測定

采用平板對峙法，將5 mm2黑腐病菌KMJY6 和KMEARM-2 菌塊分別接種于PDA 平板[13]中央，將OMR1-7 菌株劃線培養于LB 固體培養基，37 ℃培養24 h 后，挑取單菌落接種至LB液體培養基，28 ℃、180 r/min 振蕩培養12 h，制成1×108CFU/mL 的菌懸液。將OMR1-7 菌懸液劃線接種于病原菌菌塊兩側2.5 cm 處，設3 次重復試驗。以僅接種病原菌菌塊的PDA 平板為對照。將PDA 平板置于28 ℃恒溫培養箱中培養6 d，待對照組菌絲長滿平板后，按公式計算OMR1-7 菌株對黑腐病菌的菌絲抑制率：抑制率=[(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/對照菌落直徑 ]×100%。

1.4.2 菌體抑制率的測定

將OMR1-7 菌懸液與融化、冷卻至約40 ℃的PDA 培養基按體積比1∶10 混合，制成OMR1-7毒板，將5 mm2黑腐病菌KMJY6 和KMEARM-2 菌塊接入毒板中心，設3 次重復試驗。以PDA平板為對照。將毒板和PDA 平板置于28 ℃恒溫培養5～7 d，然后計算OMR1-7 菌株對黑腐病菌的菌體生長抑制率，計算公式同1.4.1 節。

1.5 生防菌株產鐵載體能力測定

1.5.1 產鐵載體定性分析

采用濾紙片法，將生防菌株接種于CAS 培養基[14]上，28 ℃倒置培養2～3 d 后觀察是否有透明圈，以LB 培養基為對照。透明圈和菌落圈直徑的比值即為菌株產鐵載體能力。

1.5.2 產鐵載體定量分析

取OMR1-7 菌懸液100 μL 接種于1 mL CAS培養液，28 °C、180 r/min 振蕩培養48 h，離心后取上清液300 μL 置于96 孔板中，每個處理3 個重復，用酶標儀(Molecular Devices SpectraMax?i3，中國)檢測630 nm 處的吸光度值(As)；另取LB培養基與CAS 培養液等體積混勻，以其630 nm處的吸光度值(Ar)作為參比值，根據公式SU=1-As/Ar 計算菌株產鐵載體的相對含量(SU)。

1.6 生防菌株產微生物膜能力的測定

1.6.1 產微生物膜定性分析

將OMR1-7 菌株接種于LB 培養基培養24 h，離心后棄上清，用MSgg 培養基[15]重懸菌體。在24孔細胞培養板的培養孔中加入 MSgg 培養基2 mL，然后加入 OMR1-7 菌液5 μL，設置3 個重復，于37 ℃靜置培養72 h。以MSgg 培養基中加入LB培養基5 μL 為對照，觀察OMR1-7 菌株的成膜情況。

1.6.2 產微生物膜定量分析

將OMR1-7 菌株接種于LB 培養基，28 ℃、180 r/min 培養48 h 取出，每組設3 個重復。吸取取出后的菌液4 mL 室溫靜止培養24 h，棄培養液后用去離子水清洗，用1%結晶紫染色2 min，棄結晶紫溶液，水洗、風干后用1%結晶紫染色。吸出多余結晶紫，用蒸餾水漂洗，待風干后加入洗膜緩沖液[16]，振蕩10～15 min 后稀釋10倍，用紫外分光光度計(島津 UV2600，日本)測定570 nm 處的吸光度值。

1.7 GFP 標記OMR1-7 菌株的構建

將OMR1-7 菌株接種于30 mL GM 液體培養基[17]中，28 ℃、180 r/min 培養16 h 制成種子液。取種子液1 mL 接種于100 mL GM 液體培養基中，28 ℃、180 r/min 培養至600 nm 處的吸光度值為0.7。取GM 培養液1 mL 加至滅菌的1.5 mL離心管中，冰浴10 min，4 ℃、8 000 r/min 離心10 min，棄上清液。沉淀用200 μL 預冷的ETM[18]漂洗2 次，制成OMR1-7 菌株感受態細胞。取pGFP4 412 質粒1 μg 加至100 μL 感受態細胞中，溫和混合后置于電擊杯；將電擊杯放入Gene-Pulser Xcell 電擊儀(Bio-Rad，美國)進行電擊(電壓1.8 kV，電阻200 Ω)，隨后加入RM 培養基[19]1 mL，并轉移至滅菌的1.5 mL 離心管，28 ℃、200 r/min 培養4 h；取100 μL 涂布于LB 固體培養基(含100 μg/μL 新霉素)，28 ℃倒置培養24 h，待長出轉化子后，挑取轉化子單菌落進行PCR 檢測。檢測引物為gfp-F (5′-GCCTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3′)和gfp-R (5′-GCCAAGCTTTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3′)。

1.8 OMR1-7 菌株在多肉植物體內定殖的觀察

采用灌根接種法，將GFP 標記的OMR1-7 菌株單菌落接種至LB 液體培養基28 ℃、180 r/min振蕩培養，制成1×108CFU/mL 的OMR1-7-GFP菌懸液；取25 mL 分別接種于血色羅密歐和靜夜植株，5 d 后接種黑腐病菌孢子懸浮液40 mL。每個處理設置10 株植株，重復3 次。28 d 后取多肉植物的根、莖和葉進行冷凍切片，置于激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV3000，日本)下觀察，激發光波長設置為488 nm，發射光波長為510 nm。

1.9 多肉黑腐病溫室防效測定

將黑腐病菌接種于Bilai’s 培養基[20]中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養5 d；用4 層無菌紗布過濾菌絲，制備成密度為1×106mL-1的孢子懸浮液。將OMR1-7 菌液接種于LB 液體培養基中，28 ℃、180 r/min 振蕩培養12 h，制備成1×108CFU/mL 的OMR1-7 菌懸液。

分別選取大小一致的健康多肉品種血色羅密歐和靜夜，采用灌根接種法，設置以下3 個處理：①清水對照；② 接種黑腐病菌孢子懸浮液40 mL；③先接種OMR1-7 菌液25 mL，5 d 后接種黑腐病菌孢子懸浮液40 mL。每個處理接種植株10 盆，每個處理重復3 次。接種后的植株放置于溫度為25 ℃、濕度為50%的溫室中，每天觀察黑腐病發病癥狀，28 d 后統計發病率和生防效果。發病率=發病植株數/調查總株數×100%；生防效果=[(處理②發病植株數－處理③發病植株數)/處理②發病植株數 ]×100%。

2 結果與分析

2.1 OMR1-7 菌株的鑒定

OMR1-7 菌株在LB 固體培養基培養1 d 后單菌落呈圓形，淡黃色，半透明，邊緣整齊，突起形狀平展，表面濕潤且有黏稠感(圖1a)。革蘭氏染色發現該菌為短桿狀革蘭氏陽性菌(圖1b)。分子序列鑒定發現：OMR1-7 菌株16S rDNA 基因(GenBase No.：C_AA009084.1)與從栽培稻品種金剛30 中分離的Bacillus amyloliquefaciensLx-11菌株(GenBank No.：HQ179100.1)相似性最高，為99.93%；OMR1-7 菌株gyrA基因(GenBase No.：C_AA016452.1)與從番茄根際土壤中分離的B.amyloliquefaciensRNB-92 菌株(GenBank No.：LC09-6069.1)相似性最高，為100.00%。通過構建16S rDNA 和gyrA基因系統發育樹(圖1c 和1d)發現：OMR1-7 菌株與B.amyloliquefaciens聚在同一分支。結合形態學和分子序列鑒定結果可知：OMR1-7 菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

圖1 解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株的形態特征和分子序列系統發育樹Fig.1 Morphological characteristic and molecular sequence phylogenetic tree of Bacillus amyloliquefaciens OMR1-7 strain

2.2 OMR1-7 對多肉黑腐病原菌的抑制效果

OMR1-7 菌株與血色羅密歐黑腐病原菌KMEARM-2 菌株、靜夜黑腐病原菌KMJY6 菌株之間均形成了明顯的抑菌帶(圖2a)，并且造成了黑腐病菌菌絲末端膨大(圖2b)。OMR1-7 菌株對KMEARM-2 和KMJY6 菌株的菌絲生長抑制率分別為57.15%和74.29% (圖2c)。KMEARM-2 和KMJY6 菌株在OMR1-7 菌株制成的毒板上生長受到抑制，OMR1-7 菌株對2 個病原菌菌體抑制率分別為84.82%和86.15% (圖2d)，同時造成2 個病原菌孢子產量減少(圖2e)。以上結果說明解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株對血色羅密歐和靜夜黑腐病菌的菌絲和孢子生長具有顯著抑制效果，且造成病原菌侵染結構畸形。

圖2 解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株對擬石蓮屬多肉植物黑腐病菌的抑制效果Fig.2 Antagonistic effects of B.amyloliquefaciens OMR1-7 against Fusarium oxysporum causing black rot on Echeveria succulent plants

2.3 OMR1-7 菌株產鐵載體能力

OMR1-7 在CAS 培養基上其菌落周圍形成了橙黃色透明圈(圖3)，且OMR1-7 菌株產鐵載體的透明圈和菌落圈直徑的比值為4.43±0.17。通過定量測定，OMR1-7 菌株產生鐵載體的相對含量為80.98%。以上結果說明該菌株具有較強的鐵載體分泌能力，能夠與植物病原真菌競爭鐵元素進而抑制病原菌。

圖3 解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株在CAS 平板上的產鐵載體情況Fig.3 Siderophore produced by B.amyloliquefaciens OMR1-7 on CAS plates

2.4 OMR1-7 菌株產微生物膜能力

OMR1-7 菌株在MSgg 培養基中形成了密集褶皺的生物膜(圖4)。OMR1-7 菌株產生的生物膜在570 nm 處的吸光度值為1.60±0.38，說明其具有較強的能力，有利于菌株適應環境以及提高在寄主中定殖和抗菌的活性。

圖4 解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株在Msgg 液態培養基中形成生物膜Fig.4 Biofilms produced by B.amyloliquefaciens OMR1-7 in Msgg liquid medium

2.5 OMR1-7 菌株在擬石蓮花屬多肉植物中的定殖

OMR1-7-GFP 菌株能成功定殖于血色羅密歐和靜夜的根、莖和葉部(圖5)。相較于葉部，OMR1-7-GFP 菌株在寄主根部和莖部數量較多。說明OMR1-7 菌株具有內生特性，占據了擬石蓮屬多肉植物體根、莖和葉內生態位，有效阻止了黑腐病菌的侵入和擴增。

圖5 解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株在擬石蓮屬多肉植物血色羅密歐(上)和靜夜(下)中的定殖Fig.5 Colonization of B.amyloliquefaciens OMR1-7 in E. agavoides cv.‘Romeo’ (above) and E.derenbergii cv.‘Purpus’ (below)

2.6 OMR1-7 菌株對擬石蓮花屬黑腐病的生防效果

接種黑腐病菌28 d 后，血色羅密歐和靜夜植株葉部和莖部出現了黑腐癥狀(圖6a～b)，發病率分別為83.33%和100.00%；而先接種OMR1-7菌株5 d 后再接種病原菌的植株發病率分別為16.67%和33.33% (圖6c)；OMR1-7 菌株對血色羅密歐和靜夜黑腐病的盆栽防效分別達到80.08%和78.89% (圖6d)。說明解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株對擬石蓮屬多肉植物黑腐病具有顯著的生防效果。

圖6 解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株對擬石蓮屬多肉植物血色羅密歐和靜夜黑腐病的生防效果Fig.6 Biocontrol efficiency of B.amyloliquefaciens OMR1-7 against black rot diseases of E. agavoides cv.‘Romeo’ (EA) and E.derenbergii cv.‘Purpus’ (ED)

3 討論

解淀粉芽孢桿菌是目前應用最為廣泛的生防細菌之一，具有廣譜抗菌活性和較強的抗逆能力，能夠促進多種植物生長[21]。解淀粉芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、灰綠青霉(Penicillium glaucum)、葉霉病菌(Cladosporium fulvum)等植物病原真菌具有顯著的抑菌效果[22-23]。研究表明：解淀粉芽孢桿菌可產生抑菌次生代謝物(表面活性素、大環內酯H、芽孢素、豐原素、地非西丁、桿菌溶素等)以及水解酶類(幾丁質酶和蛋白酶)，抑制植物病原真菌的生長[24-25]。本研究發現：解淀粉芽孢桿菌OMR1-7菌株與擬石蓮屬多肉植物黑腐病菌F.oxysporum拮抗互作時，兩者之間形成了明顯的抑菌帶，病原菌菌絲出現畸形且產孢量降低。說明OMR1-7 菌株能夠產生抑菌物質影響擬石蓮屬多肉植物黑腐病菌侵染結構和無性繁殖體的形成，進而影響病原菌的侵入和擴繁。深入挖掘和鑒定OMR1-7 菌株的抗菌物質，有助于開發擬石蓮屬多肉植物黑腐病的生物農藥。

高產鐵載體的生防細菌通過競爭土壤中的鐵元素從而抑制植物病原菌的生長，促進寄主植物健康[26]。已有研究報道不同種的芽孢桿菌均具有高產鐵載體特性[27-29]。黃瓜根際土壤中分離的B.amyloliquefaciensB2 菌株能夠產鐵載體，抑制黃瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.cucumerinum)，促進輪作環境下的黃瓜生長[30]。本研究發現：OMR1-7 菌株鐵載體產量高達80.98%，說明其與土傳性擬石蓮花屬多肉植物黑腐病菌F.oxysporum拮抗互作時，具有強鐵素競爭能力，能夠有效抑制病原菌入侵。

解淀粉芽孢桿菌寄主范圍廣泛，可穩定定殖于寄主植物根際、葉際和體內[31]。B.amyloliquefaciensX5 和BQA2 菌株在番茄根際有較強的定殖能力[32]；B.amyloliquefaciensJt84 菌株能夠在水稻葉表長期有效定殖[33]；B.amyloliquefaciensCC09 菌株在小麥根內、根表和根際均能定殖，且不影響根組織細胞結構[34]。本研究從小粒野生稻中分離到的B.amyloliquefaciensOMR1-7 菌株可在非寄主植物擬石蓮屬多肉植物的根、莖和葉部有效定殖。OMR1-7 菌株在擬石蓮屬多肉植物的根和莖部大量定殖，可有效阻止土傳性黑腐病菌F.oxysporum從根部侵入，繼而向維管束蔓延，說明OMR1-7 菌株具有與黑腐病菌進行空間競爭的能力。此外，B.amyloliquefaciens占據寄主植物根際生態位后，還能招募有益微生物群促進植物生長[35]。

細菌生物膜是細菌群體聚集形成的膜狀物，幫助其黏附寄主，提高環境適應性[36]。生物膜被認為是B.amyloliquefaciens在寄主環境定殖并與植物病原菌進行空間競爭的重要物質之一[37-39]，它還能在逆境條件下維持B.amyloliquefaciens的營養供給，減少逆境傷害[40]。本研究也發現：OMR1-7 菌株能夠產生生物膜，可以幫助其高效定殖于寄主，提高在土壤和寄主中長期存活的能力。

解淀粉芽孢桿菌對多種植物真菌病害具有良好的生防潛力，目前研究報道該菌對F.oxysporum引起病害的生防效果可達60%以上[21]。如：分離自土壤的B.amyloliquefaciensB6 菌株對F.oxysporumf.sp.lycopersicis引起的番茄枯萎病防效為64.35%[41]；B.amyloliquefaciensY-4 菌株對F.oxysporumf.sp.cubense引起的香蕉枯萎病防效為67.9%[42]；B.amyloliquefaciensHD-5 菌株對F.oxysporum引起的草莓根腐病防效達77.78%[43]；噴施解淀粉芽孢桿菌微生物葉面肥懸浮劑對葡萄白粉病的防治效果達65%以上[44]。本研究分離的B.amyloliquefaciensOMR1-7 菌株對擬石蓮屬多肉植物黑腐病的生防效果為78.89%～80.08%，且該菌株對供試2 種多肉植物黑腐病的生防效果無顯著差異，但OMR1-7 菌株在PDA 培養基上對血色羅密歐黑腐病菌的抑菌效果卻顯著低于對靜夜黑腐病菌的抑菌效果。這是由于生防細菌在植物體內的生防效果受自身定殖能力、寄主和環境等多重因素影響，因此體外抑菌防效和田間防效存在一定差異[45-46]。

4 結論

本研究首次對擬石蓮花屬多肉植物的生物防治進行了生防細菌挖掘，明確了解淀粉芽孢桿菌OMR1-7 菌株對擬石蓮屬多肉植物黑腐病的生防效果，研究結果將為多肉植物黑腐病的防控和生防藥劑開發提供參考。