連翹葉提取物通過PXR/CYP17A1 影響孕馬血清促性腺激素在肝臟的代謝*

陳國雯，王中一，邱山桐，尤 婷，岳 濤，蒲思思，張雨星，王桂榮

(甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070)

孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)是在懷孕母馬血清中發現的一種重要的糖蛋白激素[1]，由馬屬(Equus)動物胎盤的尿囊絨毛膜細胞分泌，具有促進卵泡發育成熟、排卵等多種功能[2]。臨床上，PMSG 常作為治療母畜靜止性發情、隱性發情、久配不孕等癥狀的獸用藥物。研究表明：PMSG 代謝可對動物機體造成不同程度的影響。KARABULUT 等[3]研究發現：過量或頻繁使用PMSG 時，肝臟、腎臟、卵巢、子宮等會出現損傷；LIN 等[4]研究發現：高劑量PMSG 會對體外受精小鼠胚胎的發育能力產生不利影響，并導致氧化應激誘導的非整倍性；鄧凱偉等[5]研究發現：PMSG 代謝緩慢會影響動物發情。

肝臟是機體重要的代謝器官，藥物進入機體后，主要由肝臟中的藥物代謝酶進行分解代謝[6]。細胞色素酶P450 (cytochrome P450，CYP450)是電子傳遞鏈中的末端加氧酶，為含有1 個亞鐵血紅蛋白素輔助因子的超家族蛋白，是參與藥物代謝的I 相代謝酶[7-8]。細胞色素酶P450 17A1 (cytochrome P450 17A1，CYP17A1)是CYP450 超家族成員之一，主要分布于細胞質中，在卵巢和肝臟中表達較多[9-10]；其作為合成雄激素的限速酶，參與早期卵泡生長發育，同時參與調節黃體顆粒細胞分泌孕酮[11]。孕烷X 受體(pregnane X receptor，PXR)是核受體家族的重要成員之一，由NR1I2基因編碼[12]，屬于配體激活的轉錄因子，主要在肝臟、小腸、胃、腎臟等組織中表達[13]，可調控藥物代謝酶的表達，影響藥物在肝臟的轉運過程，從而影響其在機體的肝臟代謝，是機體對抗內外源物質的重要調控因子[14-15]，所以PXR 常被視為藥物代謝的關鍵因子。

連翹(Forsythia suspensa)為木犀科(Oleaceae)連翹屬(Forsythia)植物，對藥物性肝損傷具有潛在的治療和保護作用，是中藥臨床常用傳統藥物，又名青翹、落翹等[16]。有研究發現：連翹葉中含有連翹苷、連翹酯苷A、連翹脂素等多種化學成分，其中連翹苷和連翹酯苷的含量遠高于在連翹果中的含量[17]，這些化合物具有較強的抗氧化、抗菌、抗炎、保肝、降低血糖和血脂等生物活性[18]。此外，范碧玥等[19]研究發現：連翹葉酶—醇提取物可以改善由對乙酰氨基酚造成的氧化應激。目前鮮有關于PMSG 在肝臟代謝的研究，且針對PMSG 代謝緩慢而造成的機體損傷還沒有具體解決方案，本研究旨在探究連翹葉提取物對PMSG 在肝臟代謝的影響及其影響代謝的可能機制，以期改善在畜牧生產中因PMSG 代謝緩慢而造成的氧化應激。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

昆明雌鼠144 只，平均體質量(25±5) g，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所，飼養于22～26 ℃環境中。動物實驗經甘肅農業大學倫理委員會批準(GAU-LC-2020-33)。

1.1.2 主要試劑

PMSG 購自寧波三生生物科技有限公司；連翹葉采自甘肅省天水市秦嶺鎮；兔抗CYP17A1抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗GAPDH 抗體和兔抗PXR 抗體購自美國affinity 公司；谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)測定試劑盒、谷丙轉氨酶(cerealthirdtransaminase，ALT)測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；RIPA 裂解液購自北京索萊寶生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 連翹葉提取物的制備

采用半仿生酶醇法提取連翹葉有效成分。稱取連翹葉粉末30 g，按料液比1∶8 (g∶mL)加入60%乙醇240 mL，密封后浸泡30 min，68 ℃水浴回流1 h，抽濾后收集濾液；在所得濾渣中加入纖維素酶0.15 g 和60%乙醇240 mL，50 ℃水浴回流2 h，抽濾后收集濾液。合并2 次所得濾液，50 ℃旋轉蒸發，蒸發濃縮后于-80 ℃冷凍過夜，再用冷凍干燥機凍干72 h，收集連翹葉凍干粉末，做好標記后放置于干燥陰涼處備用。

1.2.2 動物分組與處理

取連翹葉提取物粉末溶解于0.5%羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)中，分別配制成100、200 和400 mg/kg 的藥液；將PMSG 用生理鹽水稀釋，于4 ℃保存備用。適應性喂養1周后，將144 只昆明小鼠隨機分成6 組，分別為正常對照組(NC 組)、PMSG 模型組(PMSG 組)、連翹葉提取物低劑量組(LFSLE+PMSG 組)、連翹葉提取物中劑量組(MFSLE+PMSG 組)、連翹葉提取物高劑量組(HFSLE+PMSG 組)和高劑量藥物對照組(FSLE 組)。NC 組灌胃0.5% CMC 溶液，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG、HFSLE+PMSG和FSLE 組分別灌胃100、200、400 和400 mg/kg連翹葉提取物藥液，每天2 次，連續4 d；末次灌胃12 h 后，除NC 組和FSLE 組外，其余各組分別腹腔注射10 IU PMSG，后分別于12、24 和48 h采集小鼠肝臟及血清樣本，每次采集8 只小鼠。

1.2.3 血清PMSG 代謝水平的檢測

取分離后的血清作為待測樣本，按照PMSG酶聯免疫分析試劑盒說明書進行操作，得到小鼠血清中PMSG 終質量濃度。

1.2.4 氧化應激指標的測定

采集小鼠肝臟，稱取適量肝臟組織，按照質量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例加入9 倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿，用CT15RE日立卓上微量高速冷凍離心機(株式會社日立制作所)進行離心，檢測GSH、SOD 和 MDA 水平的轉速為2 500 r/min，檢測H2O2水平的轉速為10 000 r/min，之后取上清備用，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，測定SOD 活性以及GSH、MDA和H2O2的含量。

1.2.5 小鼠肝臟中PXR 和CYP17A1 蛋白表達的檢測

分別取各組小鼠肝臟20 mg，加入RIPA 裂解液200 μL，采用冷凍型組織研磨器充分研磨后28 820 r/min 離心5 min，取上清液即為蛋白原液；加入5×蛋白上樣緩沖液50 μL，混合均勻，于100 ℃恒溫變性蛋白10 min。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法轉膜，后用脫脂牛奶進行封閉，于4 ℃一抗孵育過夜(GAPDH 1∶4 000 稀釋；PXR 1∶1 500 稀釋；CYP17A1 1∶1 000 稀釋)，加入二抗室溫孵育，后用AmershamImager600 全自動化學發光成像系統(美國GE 公司)進行曝光，利用ImageJ 分析灰度值，進而得到PXR 和CYP17A1 的蛋白表達量。

1.2.6 數據統計與分析

使用SPSS 21 分析數據，采用單因素方差(one-way ANOVA)分析組間差異；使用Graphpad Prism 9.0 繪圖。

2 結果與分析

2.1 連翹葉提取物對小鼠血清中PMSG 代謝水平的影響

由圖1 可知：與NC 組相比，處理12、24 和48 h 后PMSG 組小鼠血清PMSG 水平極顯著升高(P＜0.01)；與PMSG 組相比，處理12、24 和48 h后LFSLE+PMSG 組、MFSLE+PMSG 組和HFSLE+PMSG 組小鼠血清PMSG 水平均顯著或極顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)；而不同處理時間下、同一處理組之間小鼠血清PMSG 水平均無顯著差異。說明連翹葉提取物可顯著降低不同處理時間段小鼠血清中的PMSG 水平，加快PMSG 在小鼠肝臟的代謝，且HFSLE+PMSG 組效果最佳。

圖1 連翹葉提取物對PMSG 代謝水平的影響Fig.1 Effects of Forsythia suspensa leaves extract (FSLE)on the metabolic level of PMSG

2.2 連翹葉提取物對小鼠肝臟氧化應激水平的影響

由圖2 可知：與NC 組相比，處理12、24 和48 h 后PMSG 組小鼠肝臟中SOD 活性和GSH 含量極顯著降低(P＜0.01)，MDA 和H2O2含量極顯著升高(P＜0.01)。與PMSG 組相比，小鼠給藥12 h后，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 組小鼠肝臟中SOD 活性顯著或極顯著增強(P＜0.05 或P＜0.01)、MDA 含量極顯著降低(P＜0.01)、H2O2含量顯著或極顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 組的GSH 含量顯著或極顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)；小鼠給藥24 h 后，MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 組小鼠肝組織中SOD 活性顯著或極顯著增強(P＜0.05 或P＜0.01)，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 組的GSH 含量顯著或極顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)、MDA 和H2O2含量極顯著降低(P＜0.01)；小鼠給藥48 h 后，MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 組小鼠肝臟中SOD 活性極顯著升高(P＜0.01)、GSH 含量顯著或極顯著升高(P＜0.05 或P＜0.01)，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 組的MDA 和H2O2含量顯著或極顯著降低(P＜0.05 或P＜0.01)。綜上所述，連翹葉提取物可顯著提高SOD 活性和GSH 含量、顯著降低MDA 和H2O2含量，改善因PMSG 代謝而引起的氧化應激，且MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 組效果最佳。

2.3 連翹葉提取物對小鼠肝臟CYP17A1 蛋白表達水平的影響

由圖3 可知：與NC 組相比，處理12 h 后PMSG 組小鼠肝臟CYP17A1 蛋白表達水平極顯著升高(P＜0.01)，處理24 和48 h 后顯著升高(P＜0.05)；與PMSG 組相比，處理12 和48 h 后HFSLE+PMSG組小鼠肝臟CYP17A1 蛋白水平均極顯著降低(P＜0.01)，處理24 h 后MFSLE+PMSG 組CYP17A1 蛋白水平顯著降低(P＜0.05)，處理48 h 后MFSLE+PMSG 組CYP17A1 蛋白水平極顯著降低(P＜0.01)。說明連翹葉提取物可顯著下調小鼠肝組織中CYP17A1 蛋白的表達，且HFSLE+PMSG 組效果最明顯。

2.4 連翹葉提取物對小鼠肝臟PXR 蛋白表達水平的影響

由圖4 可知：與NC 組相比，處理12、24 和48 h 后PMSG 組小鼠肝臟PXR 蛋白表達水平顯著升高(P＜0.05)；與PMSG 組相比，處理12 h 后MFSLE+PMSG 組PXR 蛋白水平顯著降低(P＜0.05)，處理24 h 后LFSLE+PMSG 組蛋白水平顯著降低(P＜0.05)，處理48 h 后LFSLE+PMSG 組PXR 蛋白表達水平極顯著降低(P＜0.01)。說明連翹葉提取物可顯著下調小鼠肝臟中PXR 蛋白的表達，且LFSLE+PMSG 組效果最明顯。

圖4 連翹葉提取物對小鼠肝臟PXR 蛋白表達的影響Fig.4 Effects of FSLE on the PXR protein expression levels in mouse liver

3 討論

孕馬血清促性腺激素(PMSG)通常被用于提高動物的繁殖力[20]，在畜牧業生產中占據重要地位。由于PMSG 分子中N-乙酰-神經氨酸的含量較高，導致其在動物血液中的半衰期較長，一般為40～150 h[21]。有研究表明：由于PMSG 代謝較慢，長時間存在于動物機體內會引發卵巢囊腫[22]；PARK 等[23]研究也發現：PMSG 在動物機體代謝過程中會誘導氧化應激的發生。為了減少PMSG在畜牧生產使用中對動物機體造成的傷害，研究生產可以加快PMSG 代謝的藥物尤為重要。本研究表明：注射PMSG 12、24 和48 h 后，小鼠血清中PMSG 水平極顯著升高，而連翹葉提取物可以顯著降低小鼠血清中PMSG 水平，表明連翹葉提取物可以加速PMSG 在小鼠肝臟的代謝。這一結果可為解決PMSG 因代謝緩慢而造成的機體損傷提供參考，也為其他藥物因代謝而引起的動物機體氧化應激和代謝性疾病研究提供解決途徑。

氧化應激是機體抵御外源性有害物質攻擊的自我保護方式，同時也是調控有害物質攻擊機體的復雜過程[24]。機體發生氧化應激反應時會產生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，當ROS 的含量大于正常水平時會破壞細胞內蛋白質、脂質、DNA 等生物大分子的結構，從而發生脂質過氧化反應[25]。GSH 是一種水溶性的抗氧化物，其活性巰基結構是重要的功能基團，可維持機體內氧化還原平衡，抵抗氧化應激損傷[26]。SOD 是體內催化歧化反應的一種抗氧化保護酶，對機體的氧化和抗氧化平衡起著重要的作用，它可通過歧化反應將氧自由基轉變為H2O2和O2[27]，其強弱在一定程度上可反映機體對抗氧化應激的能力。MDA 由機體氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化而產生，其含量反映機體內脂質過氧化及細胞損傷的程度[28]。本研究表明：注射PMSG 12、24 和48 h 后，小鼠肝組織中SOD 和GSH 水平均顯著降低、MDA 和H2O2水平均顯著升高，但連翹葉提取物可顯著提高SOD 和GSH 水平并顯著降低MDA 和H2O2水平，與安志霞等[29]的研究結果基本一致，表明連翹葉提取物具有良好的抗氧化作用，可以明顯改善動物機體因PMSG 代謝而引起的氧化應激。

CYP450 是I 相代謝酶，主要參與藥物代謝[30]。CYP17A1 作為其家族成員之一，可以在肝臟高表達，CYP17A1 編碼產生的P450c17 蛋白具有17a-羥化酶和17,20-碳鏈裂解酶活性，是類固醇激素合成途徑的關鍵酶[31]。KONG 等[32]研究發現：CYP17A1 酶活性高表達可以觸發ROS 在機體內大量積累，從而引起機體發生氧化應激；王旭等[33]研究表明：CYP17A1 上調時可以引起腎臟發生氧化應激；本研究也表明：小鼠注射PMSG后CYP17A1 蛋白表達水平上調，同時誘導機體發生氧化應激。給予小鼠不同含量的連翹葉提取物，CYP17A1 蛋白表達水平下調，表明連翹葉提取物可以通過下調CYP17A1 來緩解PMSG 對CYP17A1 上調誘導的氧化應激反應，這為連翹葉提取物可緩解因藥物代謝引起的氧化應激提供了更有利的證據。

PXR 是肝臟解毒的重要核轉錄因子，也是調控CYP450 家族基因轉錄的關鍵因子，可影響外源性物質的毒性[34]。PXR 也被稱為類固醇和異源感應核受體，最初在小鼠中被發現，可被天然類固醇(如孕烯醇酮和孕酮)以及合成糖皮質激素激動劑和拮抗劑激活，在肝臟和腸道高度表達[35-36]。PXR 可通過調節其下游靶基因的表達直接參與機體脂質、膽固醇和糖代謝，維持機體內環境的穩態[37]。KIM 等[38]研究發現：PXR 上調伴有氧化應激的發生；本研究也顯示：小鼠注射PMSG 后PXR 蛋白表達水平上調，同時伴有小鼠機體的氧化應激；給予小鼠不同含量的連翹葉提取物藥液后PXR 蛋白表達水平下調，表明連翹葉提取物可以通過下調PXR 的表達來緩解PMSG 誘導的氧化應激。

4 結論

PMSG 代謝會引起小鼠機體發生氧化應激，連翹葉提取物可以加速PMSG 的代謝，并可以通過下調CYP17A1 和PXR 蛋白的表達減緩PMSG誘導的氧化應激。