響應面法優化茭白多糖硫酸化工藝及其抗氧化活性分析

馬笑笑，王 兵，劉會平，張 欣，張慧慧，李 燦，劉 盈

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

茭白（Zizania latifolia），又稱菰瓜、高瓜、高筍等，原產于中國及東南亞，是禾本科孤屬多年生宿根水生草本植物感染菰黑粉菌后長成的變態肉質莖[1]，其口感肥嫩鮮美，是浙江最受歡迎的蔬菜之一[2]。茭白中含有糖類、蛋白質、維生素、多酚等多種營養物質[3]，具有化濁降脂、生津止渴、預防肝硬化[4]等保健功能，在中國以及東南亞部分地區，茭白也作為傳統中藥被使用[5]，其優越的抗氧化能力已經被證明[6-9]。

多糖是一種天然大分子活性物質，廣泛存在于自然界中，具有多種與人類生活緊密相關的重要生物活性，如降血糖、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫功能[10-14]等，同時多糖具有無毒、可生物降解、成本低易獲取[15]等優點，已成為食藥領域研究熱點。茭白中含有豐富的多糖類物質，水溶性多糖含量約為10%～20%[4,16]。目前茭白多糖的研究主要集中于抗氧化[7]、免疫調節[7,17]、緩解急性酒精中毒[5]以及復合生物膜[9]等方面。

天然多糖活性相對較弱，大量研究表明采用生物、化學等方法對多糖進行修飾能不同程度地改善多糖活性。硫酸化是多糖改性的一種常用方法，已被廣泛應用于增強多糖的抗氧化活性[14,18]。其中，氯磺酸-吡啶法、濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法等是多糖硫酸化改性最常用的幾種化學修飾方法[19]。Gong 等[20]研究發現隨著硫酸鹽基團的引入，羅漢果多糖對DPPH·和O2-·清除能力增強。Xu 等[21]研究發現硫酸化修飾顯著提高了大麥多糖的體外抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶的能力，且呈劑量依賴性。多糖的抗氧化特性是由于多糖鏈上的電子給體或氫給體官能團[14]，當這些官能團被硫酸基團取代時，其分子量、結構以及生物活性便會發生相應改變。張子木等[22]研究發現，壺瓶碎米薺多糖抗氧化活性隨著取代度的增加呈現先升后降并整體上升的趨勢；劉玉鳳等[23]研究發現，不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖其抗氧化程度不同，且隨著多糖取代度的增加而增加。

本文旨在對茭白多糖進行硫酸酯化，得到硫酸化茭白多糖，并對酯化時間、酯化溫度以及酯化劑添加量進行優化，提高茭白多糖硫酸基取代度從而提高其體外抗氧化能力，同時比較了天然茭白多糖與改性多糖的抗氧化活性，為硫酸化茭白多糖作為天然的抗氧化劑的開發提供了可能，同時也為進一步開發茭白多糖提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮茭白 產地安徽省安慶市岳西縣，雙季茭白，10 月季；濃硫酸、苯酚、三氯甲烷、氯化鋇 購于天津市化學試劑廠；無水乙醇、三氟乙酸、正丁醇、冰醋酸、氫氧化鈉、甲醇、硫酸鉀 購于天津江天化工技術有限公司；DEAE-52、S6-ff 瓊脂糖凝膠、無水葡萄糖、半乳糖醛酸、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白（BSA）、葡聚糖標準品、單糖標品、剛果紅、還原糖含量檢測試劑盒、植物總酚（TP）含量檢測試劑盒 購于北京索萊寶科技有限公司；溴化鉀 購于上海吉至生化科技有限公司；三氧化硫-吡啶復合物、甲酰胺、明膠 購于上海麥克林生化科技有限公司；所用試劑均為分析純。

GZX-9070MBE 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司；SE-2000 高速粉碎機 浙江永康市圣象電器有限公司；B600 型低速自動平衡離心機長沙湘儀儀器有限公司；Model 680 酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；BS-100A 自動部分收集器 上海滬西儀器分析廠；RE-52AA 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50 真空冷凍干燥機 上海比郎儀器有限公司；VECTOR-220 傅里葉紅外光譜儀美國尼高利儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀 德國安捷倫儀器有限公司；CARY 50 紫外可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；JJ500 型精密電子天平、ESJ205-4 電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；FE28-Standard pH 計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101 油浴鍋 蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茭白多糖的提取與純化 新鮮茭白洗凈，切成0.5 cm 左右薄片，于60 ℃烘箱中烘干24 h，粉碎機粉碎后80 目過篩，得到茭白原料粉末。稱取定量茭白原料粉末，按1:30 料液比于95 ℃熱水提取3 h，離心取上清，沉淀重復2 次上述步驟重新提取上清液，旋蒸濃縮，加入三倍體積無水乙醇4 ℃醇沉24 h，離心取沉淀。60 ℃旋蒸除掉酒精后重溶于蒸餾水，用Savag 法除去蛋白，透析3 d，冷凍干燥后得到茭白粗多糖。

將凍干后的茭白粗多糖分別經過DEAE-52 纖維素層析柱分離（樣品用量：100 mg；樣品濃度：10 mg/mL；洗脫劑：0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaOH；流速1.5 mL/min）、瓊脂糖凝膠S-6ff 純化柱洗脫純化（樣品用量：40 mg；樣品濃度：20 mg/mL；洗脫劑：去離子水；流速2.5 mL/min），冷凍干燥得到純化后的茭白多糖（ZLP）。

1.2.2 茭白多糖硫酸化工藝優化

1.2.2.1 單因素實驗 方法參考文獻[24-25]稍作改變。將100 mg 茭白多糖溶于25 mL 甲酰胺中，室溫攪拌使多糖完全溶解。邊升溫邊加入一定量三氧化硫-吡啶復合物，待溫度達到所需反應溫度后開始計時，反應完成后立即冰水浴冷卻，2 mol/L NaOH調pH 至中性，75%乙醇醇沉，4 ℃靜置24 h 使多糖沉淀完全。離心收集沉淀，吹干除去乙醇，用水復溶，透析3 d，冷凍干燥得硫酸化茭白多糖（S-ZLP）。

對酯化溫度、酯化時間以及三氧化硫-吡啶復合物添加量進行單因素實驗，以取代度（DS）為考察指標。實驗均重復3 次。

酯化溫度：設定茭白多糖為100 mg、酯化時間為3 h、三氧化硫-吡啶復合物量為2 g 和甲酰胺量為25 mL，調節溫度為50、60、70、80、90 ℃；酯化時間：設定茭白多糖為100 mg、酯化溫度為70 ℃、三氧化硫-吡啶復合物量為2 g 和甲酰胺量為25 mL，調節時間1、2、3、4、5 h；三氧化硫-吡啶復合物添加量：設定茭白多糖為100 mg、酯化時間為3 h、酯化溫度為70 ℃和甲酰胺量為25 mL，調節三氧化硫-吡啶復合物添加量為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g。

1.2.2.2 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上，選取反應溫度（A）、反應時間（B）、三氧化硫-吡啶復合物添加量（C）為考察因子，選擇3 因素3 水平，具體試驗因素水平見表1，以Box-Behnken 設計安排進行試驗， Design-Expert 13.0.1.0 Trial 進行數據分析及響應曲面作圖。

表1 Box-Behnkens 試驗因素水平設計Table 1 Box-Behnkens test factor level design

1.2.3 取代度的測定 采用氯化鋇-明膠比濁法測定硫酸根含量，參照邱芳萍等[26]的方法。以硫酸鉀為標準品，建立標準回歸曲線。以標曲同樣方法測定樣品硫元素含量（S%）。標準回歸方程如下：y=1.6043x-0.0478，R2=0.9981。

代入公式（1）計算樣品取代度（DS）。

1.2.4 紅外光譜分析 通過傅里葉紅外光譜（FT-IR）對ZLP 和S-ZLP 的特征吸收峰進行測定。稱取1.2 mg 茭白多糖和硫酸化茭白多糖，加入140 mg 干燥的KBr 于瑪瑙研缽中迅速研磨均勻，在12 MPa壓力下壓縮成1 mm 左右的薄片，400～4000 cm-1區間掃描透射光譜16 次。

1.2.5 總糖含量測定 總糖含量采用苯酚-硫酸法進行測定，參考Chen 等[27]的方法。以葡萄糖為標準品建立標準回歸曲線。代入樣品溶液的光吸收值計算總糖的含量。標準曲線方程為：y=6.1676x+0.1475，R2=0.9970。

1.2.6 蛋白質含量測定 蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法，按照沈育伊等[28]的方法稍作修改。準備1 mg/mL BSA 標準試劑及考馬斯亮藍G-250 試劑，在4 ℃避光存儲。

向試管中加入0.1 mL BSA 標準試劑（0、0.01、0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10 mg/mL），隨后加入5 mL G-250 試劑。待混合均勻后，室溫靜置5 min，于595 nm 處測定吸光度值。繪制標準曲線，分別代入兩種多糖溶液的吸光度值計算蛋白質的含量。標準曲線方程為：y=3.587x+0.5756，R2=0.9943。

1.2.7 糖醛酸含量測定 糖醛酸含量測定采用間羥基聯苯法，參照米合熱尼沙等[29]的方法。以半乳糖醛酸為標準品建立標準回歸曲線。代入樣品吸光度值計算糖醛酸的含量。標準曲線方程為：y=5.2041+0.1104，R2=0.9921。

1.2.8 還原糖和總酚含量測定 還原糖測定使用還原糖含量檢測試劑盒（可見光分光光度法）；總酚測定使用植物總酚（TP）含量檢測試劑盒（可見分光光度法）。

1.2.9 紫外全波長掃描分析 通過紫外-可見光分光光度計對ZLP 和S-ZLP 的純度進行評估。將兩種多糖溶于超純水配制成濃度為1 mg/mL 的溶液，以超純水為參比校準基線，在200～500 nm 范圍內掃描多糖溶液。通過測定260 和280 nm 處的吸收峰，即可評估核酸、蛋白質及總酚在兩種多糖樣品中的存在情況[30]。

1.2.10 多糖分子量的檢測 以不同分子量的葡聚糖T-10（10 kDa）、T-40（40 kDa）、T-110（110 kDa）、T-500（500 kDa）、T-1000（1000 kDa）、T-2000（2000 kDa）為標準品，通過HPGPC 對ZLP 和S-ZLP 的分子量進行評估。以超純水配制1 mg/mL 的待測樣品。以超純水為流動相，洗脫流速為0.6 mL/min，進樣體積20 μL，檢測溫度35 ℃，柱溫30 ℃，示差檢測器，Tskgel G4000PWxl（7.8 mm×300 mm）色譜柱，測定各個標準品的保留時間，建立lg Mw-Rt 標準曲線。以一致的運行條件測定樣品溶液的保留時間，帶入標準曲線即可計算出ZLP 和S-ZLP 的分子量分布情況。標準曲線方程為：lg Mw=-0.3555Rt+9.3736，R2=0.9906。

1.2.11 多糖微觀結構的掃描電子顯微鏡觀察 使用SEM 觀察ZLP 和S-ZLP 的分子形態[31]。在顯微鏡的金屬支架上固定碳導電雙面膠，兩種多糖樣品凍干后平鋪到雙面膠上，并吹掃掉多余的樣品。隨后利用離子濺射噴鍍儀在導電膠上均勻地沉積一層薄金涂層進行觀察。

1.2.12 多糖熱力學性質的檢測 通過TGA 測定ZLP 和S-ZLP 熱穩定性。在微量天平中分別稱量5 mg 多糖粉末，將樣品置于分析儀的氧化鋁坩堝中，以氮氣為載氣，流速為20 mL/min，設置初始和結束溫度分別為30 ℃ 和600 ℃，以10 ℃/min 的速度進行加熱測試。

1.2.13 抗氧化活性的檢測

1.2.13.1 DPPH·清除活性測定 參考 Wu 等[32]的方法稍作修改，配制0.2 mmol/L DPPH 溶液并在黑暗中貯存。分別準備0.05、0.1、0.3、0.5、1、3、5、8、10 mg/mL ZLP 和S-ZLP 溶液。在96 孔板中，取60 μL多糖溶液與120 μL 0.2mmol/L DPPH 溶液，混合靜置30 min，測量510 nm 處吸光度。以維生素C（VC）為陽性對照，平行3 次。根據公式（2）計算ZLP 和S-ZLP DPPH·清除率。

式中：A—DPPH·清除率，%；A0—去離子水代替樣品溶液的吸光度；A1—樣品溶液吸光度；A2—無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度。

1.2.13.2 ·OH 清除活性測定 采用Fenton 反應體系法[33]。參照宋佳敏等[34]的方法稍作修改。使用去離子水配制不同濃度的樣品溶液。在96 孔板中，將160 μL 樣品溶液與40 μL 9 mmol/L FeSO4溶液和40 μL 8.8 mmol/L H2O2溶液充分混合，再加入20 μL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液混合均勻后，于37 ℃靜置30 min，并于酶標儀上測定510 nm 處吸光度。以VC作為陽性對照，平行3 次。吸光度值代入公式（3）計算·OH 清除率：

式中：A—·OH 清除率，%；A0—去離子水代替樣品溶液的吸光度；A1—樣品溶液吸光度；A2—去離子水代替H2O2工作液的吸光度。

1.2.13.3 ABTS+·清除活性測定 ABTS+·清除率參考樊海燕等[35]的方法稍作修改。7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液按照1:1 混合均勻，避光放置12 h 以上。用去離子水調734 nm 吸光度為0.7±0.01，即ABTS+·工作液。

使用去離子水配制不同濃度的多糖溶液。在96 孔板中，將40 μL 多糖溶液與120 μL ABTS+·工作液溶液混合均勻，在室溫下靜置5 min，并于酶標儀上測定734 nm 處吸光度。VC作為陽性對照，以去離子水替代多糖溶液作為空白，每組設置3 個重復孔，計算ABTS+·清除率：

式中：A—ABTS+·清除率，%；A0—去離子水代替樣品溶液的吸光度；A1—樣品溶液吸光度；A2—去離子水代替ABTS+·工作液的吸光度。

1.2.13.4 亞鐵離子還原力的測定 樣品還原能力的測定參考Zhou 等[11]的方法稍作修改。離心管中分別加入2.5 mL 配制好的0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH6.6）、1%鐵氰化鉀溶液、10%的三氯乙酸溶液和0.1%的氯化鐵溶液以及1 mL 不同濃度ZLP 和S-ZLP 溶液，混勻。50 ℃水浴30 min 后以5000 r/min離心20 min，取2.5 mL 上清液加入2.5 mL 去離子水和1.5 mL 0.1%氯化鐵溶液，靜置10 min 后測量700 nm 處吸光度值。平行測定3 次，以VC作為對照。測得吸光度越大說明樣品還原力越強[36]。

1.3 數據處理

采用SPSS 進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比較，Microsoft Excel 2021、Design expert13、Origin 2022 進行統計分析及繪圖。其中，P＜0.05 被認為是顯著的。

2 結果與分析

2.1 茭白多糖的提取與純化

透析后得到的茭白粗多糖，得率為3.56%±0.46%。如圖1a，通過DEAE-52 纖維素分離柱洗脫，發現其只在去離子水洗脫出峰，收集峰上洗脫液，冷凍干燥后利用瓊脂糖凝膠S-6ff 純化柱純化，如圖1b，只產生對稱單峰，表明純化后的多糖為分子量相對均一的化合物。將洗脫液凍干得到的多糖組分命名為ZLP，得率為2.73%±0.26%。

圖1 茭白多糖DEAE-52（a）、S-6ff（b）分離純化洗脫曲線Fig.1 DEAE-52 (a), S-6ff (b) separation, purification and elution curves of Zizania latifolia polysaccharide

2.2 茭白多糖硫酸化

2.2.1 單因素實驗

2.2.1.1 酯化溫度對DS 的影響 多糖取代度隨酯化溫度上升而增加，在50～70 ℃時，DS 增加顯著（P＜0.05），由0.73 上升至1.72；70 ℃以后，DS 提高緩慢甚至有所下降（圖2a）。這與周艷等[37]、郭金英等[38]研究結果相同?？赡苁怯捎跍囟壬?，酯化劑副反應增大，抑制硫酸基團的取代[39]。同時考慮節能問題，選擇70 ℃為酯化溫度。

圖2 酯化溫度（a）、酯化時間（b）、三氧化硫-吡啶添加量（c）對茭白多糖取代度的影響Fig.2 Effects of esterification temperature (a), esterification time (b) and sulfur trioxid-pyridine complex addition (c) on the DS of Zizania latifolia polysaccharide

2.2.1.2 酯化時間對DS 的影響 茭白多糖取代度隨時間增長而增加，4 h 時DS 達到最大值1.74，繼續酯化，DS 變化不明顯（圖2b）。這與郭金英等[38]、Jayawardena 等[40]研究結果相同。說明在一定范圍內延長酯化時間可提高DS。但由于酯化反應可逆性，隨著時間延長取代度增加變得平緩，繼續酯化，可能會引起多糖部分降解[39]，使酯化率降低。因此，選擇4 h 為茭白多糖硫酸化反應時間。

2.2.1.3 三氧化硫-吡啶復合物添加量對DS 的影響

酯化劑量由1 g 增加到2.5 g，DS 由0.44 增大到1.66。繼續增加三氧化硫-吡啶復合物量，DS 不再增加甚至有下降趨勢（圖2c）。這與Zhang 等[39]的研究結果是相一致的，即由于酯化劑用量過大導致反應不均勻[41]。同時考慮到經濟成本問題，選擇酯化劑量為2.5 g。

2.2.2 響應面試驗 試驗安排及結果見表2，其中第13～17 組為5 次重復的中心點試驗用于驗證模型的準確性[24]。

表2 試驗設計及結果Table 2 Experimental scheme and results

對試驗數據進行回歸分析，得二次多元回歸方程如下：DS=1.83+0.055A+0.06B+0.04C+0.01AB-0.02AC+0.000BC-0.221A2-0.166B2-0.111C2。

方差分析（表3）表明，回歸模型極顯著（F值=129.91，P＜0.0001），失擬項不顯著（F=3.03，P＞0.05），擬合系數R2=0.9940，模型擬合程度比較好，試驗誤差較小。

表3 回歸模擬方差分析Table 3 Regression simulation analysis of variance

結合顯著性檢驗，比較響應曲面（圖3），得到優化區域中各因素對茭白多糖取代度影響的顯著程度為，酯化時間＞酯化溫度＞三氧化硫-吡啶復合物添加量。擬給出的茭白多糖硫酸酯化的最優條件為：溫度71.21 ℃、時間4.18 h、三氧化硫-吡啶復合物加入量2.58 g，產品的DS 為1.84。

圖3 酯化時間、酯化溫度、三氧化硫-吡啶復合物添加量及交互作用對茭白多糖硫酸基取代度的影響的等高線圖（a、b、c）及三維響應面圖（d、e、f）Fig.3 Contour plots (a, b, c) and three-dimensional response surface plots (d, e, f) about the effects of esterification time, esterification temperature, addition amount of sulfur trioxide-pyridine complex and interaction on the DS of sulfate of Zizania latifolia polysaccharide

考慮到實際操作方便，為驗證響應面法所得結果的準確性和可靠性，將工藝參數修正為酯化時間4 h、酯化溫度70 ℃、三氧化硫-吡啶復合物加入量2.6 g，試驗重復3 次，驗證響應面法擬給出的結果可靠性。得到實際的DS 為1.79±0.3，相對誤差為2.72%，故基于響應面法所得的優化工藝參數準確可靠。

2.2.3 傅里葉紅外光譜分析 圖4a 為ZLP 紅外光譜，3417.72 cm-1處為OH 的伸縮振動峰；2925.48 cm-1為C-H 的伸縮振動的吸收峰；1637.27 cm-1處為C=O 的伸縮振動引起；1442.98 cm-1處為 C-H 的振動峰；以上四處是多糖的特征吸收峰；1745.75 cm-1及1252.54 cm-1處的吸收峰證明了O-乙?；拇嬖赱42]；1050.01 cm-1處為C-O-C 不對稱伸縮振動，表明吡喃糖的存在；919.88 cm-1表明ZLP 含有β-型糖苷鍵；833.65 cm-1處為α-型糖苷鍵[13]。

圖4 茭白多糖（a）及其硫酸化產物（b）紅外光譜圖Fig.4 Infra-red spectrogram of ZLP (a) and S-ZLP (b)

圖4b 為茭白多糖及其硫酸化產物紅外光譜對比圖。3600～3200 cm-1間為多糖中-OH 的吸收峰，峰形變窄說明羥基數量減少[24]，在1240 cm-1附近有-O-SO3的S=O 伸縮振動吸收峰，850～820 cm-1間有-C-O-S 的伸縮振動峰[43]，說明硫酸基團已經成功結合到茭白多糖分子上，利用硫酸鋇-明膠比濁法測定其DS 為1.79。

2.3 多糖組成測定

如圖5 所示，通過紫外-可見光分光光度計對ZLP（a）和S-ZLP（b）進行紫外全波長掃描，發現二者在260 以及280 nm 處沒有明顯吸收峰，說明其基本不含或含有極少量蛋白質、核酸和總酚。其基本理化性質如表4 所示。由于取代度的增加會降低硫酸化多糖的總糖含量導致S-ZLP 總糖含量降低[44]。

圖5 ZLP（a）及S-ZLP（b）紫外全波長掃描Fig.5 UV full-wavelength scan of ZLP (a) and S-ZLP (b)

表4 茭白多糖及其硫酸化產物基本組成Table 4 Basic compositions of Zizania latifolia polysaccharide and its sulfated products

2.4 多糖分子量的檢測

通過高效液相色譜對ZLP、S-ZLP 樣品進行色譜測定，ZLP 樣品保留時間為8.870 min，如圖6a；SZLP 樣品保留時間為9.243 min，如圖6b 。根據葡萄糖標準回歸曲線計算可得，ZLP 分子量約為1.66×106Da，S-ZLP 分子量約為1.22×106Da。陳群[45]的研究發現不同方法對茯苓多糖硫酸化后得到的硫酸化產物分子量均小于天然茯苓多糖；Zhang 等[39]對慈姑多糖進行研究，發現硫酸化后慈姑多糖分子量由為576.9 kDa 逐漸降低到最低水平129.6 kDa，與天然慈姑多糖相比降低了77.5%。導致此現象的原因可能是改性過程中酸的氧化使部分糖鏈發生斷裂導致多糖分子量減小。由色譜圖可以得知，ZLP 和S-ZLP 均為均勻對稱的單峰，說明其純化程度較高，多糖組分較純。

圖6 ZLP（a）和S-ZLP（b）高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatography of ZLP (a) and S-ZLP (b)

2.5 掃描電子顯微鏡分析

如圖7 為不同放大倍數下ZLP 和S-ZLP 掃描電子顯微鏡微觀結構觀測圖，多糖形態的差異表明各組分具有不同的鏈構象[46]。由圖可知，茭白多糖主要為脈絡狀結構，中間附有少量球狀結構；而經過硫酸化修飾后，茭白多糖的微觀結構發生明顯改變，組織更加細碎，脈絡結構變少，球狀組織增多?？赡苁怯捎诹蛩峄鶊F的取代導致分子間締合作用力變弱[47]，片層卷曲形成球狀。

圖7 ZLP （a）和S-ZLP （b）不同放大倍數下掃描電子顯微鏡圖Fig.7 Scanning electronic microscope images of ZLP (a) and S-ZLP (b) at different magnifications

2.6 熱力學性質分析

ZLP 和S-ZLP 的TG 曲線（圖8）顯示，在測定范圍內ZLP、S-ZLP 共出現了三次質量損失過程。第一階段，在25～100 ℃左右，開始失去吸附水；ZLP在46.38 ℃時失重最快，失重率為16.48%；S-ZLP在65.04 ℃時失重最快，失重率為2.92%。

圖8 ZLP（a）、S-ZLP（b）熱重曲線Fig.8 Thermogravimetric curve of ZLP (a) and S-ZLP (b)

第二階段，溫度變化范圍為200～400 ℃ ，此階段失重最為明顯，表明多糖在該溫度范圍內發生了劇烈的分解；ZLP 降解速率在336.44 ℃時達到最大值，此階段的失重率為73.54%，S-ZLP 降解速率在331.05 ℃時達到最大值，此階段的失重率為81.02%。

第三階段，溫度變化范圍是400～600 ℃ ，此階段樣品的重量變化趨于平緩，為緩慢碳化階段，大部分樣品在此階段內分解為灰分和無機成分[47]。

以上結果說明多糖在200 ℃以下的環境中內具有良好的熱穩定性，且S-ZLP 熱穩定性要優于ZLP。

2.7 體外抗氧化活性測定

活性氧引起的氧化應激和氧化損傷已成為機體各種器官疾病和衰老的重要原因[11]。由圖9 可知，ZLP 和S-ZLP 能一定程度上清除DPPH·（a）、·OH（b）、ABTS+·（c）及還原Fe2+（d）且均呈劑量依賴性。S-ZLP 對于四者的還原能力均優于ZLP 但均低于陽性對照。ZLP 對于DPPH·、·OH 以及ABTS＋·清除能力的IC50值分別為3.49、3.28 和12.70 mg/mL；S-ZLP 為0.39、1.00 和1.82 mg/mL；陽性對照VC為0.069、0.17 和0.077 mg/mL。IC50值越小，其自由基清除能力越強。從IC50結果來看，ZLP 和SZLP 對三種自由基清除能力均低于陽性對照，硫酸化后茭白多糖的自由基清除能力有一定程度上的提高，且對于DPPH·和ABTS＋·清除能力提高更優。Khan 等[15]研究發現含有硫酸根的紫菜多糖對·OH 及ABTS＋·的清除能力要高于不含硫酸根的多糖；Gong 等[20]研究發現，羅漢果多糖硫酸衍生物具有清除DPPH·、·OH 和超氧陰離子的能力，且清除能力隨多糖濃度的增加而增強。與本研究結果具有相似性，這證實了硫酸化改性對多糖的抗氧化能力的改善作用。

圖9 ZLP、S-ZLP 對DPPH·（a）、·OH（b）、ABTS+·（c）清除率以及Fe2+還原能力（d）Fig.9 Scavenging rates of DPPH· (a), ·OH (b), ABTS+· (c) and Fe2+ reduction capacity (d) of ZLP and S-ZLP

3 結論

本研究采用水提醇沉法從茭白膨大莖中提取出一種新型的水溶性多糖。在單因素基礎上，對硫酸化茭白多糖響應面優化，得到的最優酯化方案為：茭白多糖100 mg，酯化溫度70 ℃，酯化時間4 h，三氧化硫-吡啶復合物質量2.6 g 及甲酰胺量25 mL 條件下，DS 為1.79±0.3（n=3）。結合紅外光譜證明，硫酸基團已經結合到多糖分子鏈上。體外抗氧化實驗證明，茭白多糖具有一定的體外抗氧化活性；與硫酸化茭白多糖對比發現，硫酸改性能在一定程度上提高ZLP 的抗氧化活性，但IC50值仍低于陽性對照，并且二者對體外抗氧化活性表現出不同的質量濃度依賴性。這也為硫酸化茭白多糖在醫藥領域作為天然的抗氧化劑提供了可能，同時也為進一步開發茭白多糖提供了理論基礎。

由于本研究獲得的多糖分子量較大，其結構特征可能更為復雜，因此研究主要集中于硫酸化茭白多糖的提取純化、簡單的成分及活性探究。后續將利用核磁等方法對其結構進行深入解析，并對其構效關系進行進一步的研究。

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