燕麥蛋白耦合異源共架技術對大米蛋白水溶性的影響

黃馨禾，王長艷，范龍彬，常雅寧,*

（1.華東理工大學食品科學與工程系生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2.上海徐匯區地下空間開發有限公司，上海 200030）

大米是我國最常見的糧食之一，其中大米蛋白以極低的致敏性而備受矚目[1]，與其他谷物蛋白相比，大米蛋白表現出優良的氨基酸組成，總必需氨基酸含量約為41.1～41.7 g/100 g，賴氨酸（谷類第一限制氨基酸）的含量高達4.1 g/100 g[2]，同時凈蛋白質利用率（73.8）、生物價（61）和氨基酸評分（0.66）也遠高于其他糧食作物[3]，因此大米蛋白作為高附加值成分具有應用于多種食品體系之中的潛在價值。

盡管大米蛋白的營養價值很高，但它含有約80%的谷蛋白[4]，谷蛋白會通過分子間二硫鍵的交聯形成大分子聚合物，令大米蛋白在pH4～10 的條件下溶解度、發泡和乳化性能相對較差[5]，限制了大米蛋白作為功能組分在食品中的應用。研究人員采用了多種技術來提高大米蛋白的溶解度，其中以化學改性、生物酶法改性以及物理改性為主?；瘜W改性與酶改性的反應過程難以控制且會產生苦味成分[6]，物理改性對設備要求高，能耗成本大，不利于實際生產應用[7]。因此開發一種安全、操作簡便的增溶方式尤為重要。

異源共架技術基于pH-循環技術，利用外界環境的改變，從動力學角度出發，改變兩種不同原料之間的非共價作用，構建兩者之間的共架骨架，從而使得復合材料可以在中性水體系中獲得動態穩定性。該技術因為具備工藝簡單、安全性高、能夠保留原料的營養特性和生理活性等優點而被廣泛應用于食品行業，尤其是蛋白質改性中。在異源共架的過程中，兩種蛋白質發生共折疊，使疏水基團暴露，從而達到增溶的效果[8]。He 等[9]利用大豆蛋白耦合異源共架技術加工小麥面筋蛋白，以實現對小麥面筋蛋白的增溶效果。Wang 等[10]通過大豆分離蛋白耦合異源共架技術改變大米蛋白結構，設計新型的蛋白質復合材料，使大米蛋白的溶解度增加。但大豆蛋白的高致敏性限制了復合材料的實際應用。與大米蛋白相似，燕麥蛋白同樣具有低致敏性、氨基酸配比合理、高生物相容性的特點，因此本研究選擇燕麥蛋白與大米蛋白一同構建異源共架體，提高大米蛋白的溶解度，這是第一次使用燕麥蛋白耦合大米蛋白。

中國是全球大米的主要進口國之一，在儲存和運輸過程中，大米的主要副產品碎米的數量不可低估[11]。因此本文從碎米中提取大米蛋白，并采用異源共架的技術引入燕麥蛋白對其進行增溶改性，擴大其應用范圍，以實現從低價值資源向高價值產品的合理轉化，從而獲得良好的經濟效益和社會效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

碎米 山東鶴來香食品有限公司；燕麥蛋白粉純度98%，陜西世紀千尋生物科技有限公司；SDSPAGE 凝膠配制試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；食用大豆油 益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；透析袋 北京怡康盛世生物科技有限公司；考馬斯亮藍、氫氧化鈉、鹽酸和其余常用化學試劑均為分析純，上海泰坦科技股份有限公司。

PHS-3CU 數顯臺式pH 計 上海越平科學儀器有限公司；CP213 電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上海秋佐科學儀器有限公司；DL-5-B 多管離心機上海安亭科學儀器廠；FJ200-T 高速均質乳化機 韜越上海機械科技有限公司；UV-2000 紫外分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Scientz Z-10N 真空冷凍干燥機 鄭州科達機械儀器設備有限公司；FTIR5700 傅里葉紅外光譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；JSM-6390A 掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社；S3500 激光粒度儀 美國麥奇克有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大米蛋白的制備 參照Qadir 等[12]的方法并稍加修改。將碎米粒浸入去離子水中，在4 ℃環境下冷藏12 h，浸泡過的碎米粒與4 ℃的去離子水以1:10（w/v）的比例混合打漿。將混合漿料稀釋10倍，用1 mol/L NaOH 將pH 調至12，在室溫下攪拌4 h。在4 ℃下10000 r/min 離心15 min，取上清液。上清液用1 mol/L HCl 調節pH 至4.5 進行蛋白質沉降，在4 ℃下以10000 r/min 離心15 min，收集沉淀。用去離子水洗滌3 次，再用1 mol/L NaOH將pH 調至7。冷凍干燥后，得到大米蛋白粉末，在4 ℃的環境下儲存備用。

1.2.2 大米-燕麥蛋白新型復合材料的制備 參照Zhu 等[13]的方法并稍加修改。向1%（w/v）的大米蛋白中加入不同質量的燕麥蛋白，將大米蛋白與燕麥蛋白的質量比記作1:0.2、1:0.4、1:0.6、1:0.8、1:1，得到大米-燕麥蛋白溶液。另取大米蛋白和燕麥蛋白分別制得1%（w/v）的溶液作為對照組。將上述大米-燕麥蛋白溶液、大米蛋白溶液和燕麥蛋白溶液用1 mol/L NaOH 調至pH 為12，在室溫下用磁力攪拌器攪拌4 h 后，用0.1 mol/L HCl 緩慢中和溶液至pH 為7 后，在4 ℃下以10000 r/min 離心15 min，將上清液用透析袋（3500 Da）在4 ℃下透析24 h 除去鹽分，冷凍干燥后，得到大米-燕麥蛋白粉末和對照組大米蛋白粉末、燕麥蛋白粉末，在4 ℃的環境下密封儲存，用以后續表征分析。沉淀經冷凍干燥后，采用SDS-PAGE 進行分析。

1.2.3 蛋白質濃度的測定 蛋白質的濃度使用考馬斯亮藍法[14]進行測定。

1.2.4 溶解度的測定 參照趙方園等[15]的方法并稍加修改，取大米-燕麥蛋白、大米蛋白和燕麥蛋白粉末各0.1 g，分別分散于10 mL 去離子水中，配制成7 份1%（w/v）的大米-燕麥蛋白、大米蛋白和燕麥蛋白溶液，攪拌2 h 后置于4 ℃冰箱過夜，使其充分水合，再將溶液以5000 r/min 離心15 min。溶解度的計算公式如下：

其中，M1是上清液中蛋白質的含量，單位mg；M2是樣品中總蛋白質的含量，單位mg。

1.2.5 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 參照Laemmli 等[16]的方法并稍加修改。分別取0.2 g 大米-燕麥蛋白、大米蛋白、燕麥蛋白粉末于7 個離心管中，加入10 mL 去離子水，充分分散后與4 倍體積的5×緩沖液混合均勻。將異源共架過程中產生的不溶性沉淀分別分散在緩沖液中，令其濃度為0.2%（w/v）。沸水浴3～5 min 后，各取6.5 μL，上樣加入預制膠（濃縮膠4%、分離膠12%）進行電泳。初始電壓設置為80 V，樣品進入分離膠后調整至120 V，直至電泳結束。電泳結束后染色、脫色至可以看見明顯條帶。

1.2.6 濁度的測定 參照Wang 等[17]的方法并稍加修改。分別將0.1 g 的大米-燕麥蛋白、大米蛋白、燕麥蛋白粉末加入到100 mL 去離子水中，用1 mol/L NaOH 調節pH 至12。磁力攪拌充分溶解后，用0.1 mol/L HCl 緩慢將蛋白溶液pH 調整為7，溶液pH 每降低0.5 取一次樣，在600 nm 波長下測定不同pH 下樣品的透過率。

1.2.7 粒徑的測定 由1.2.4 的結果可知當大米蛋白/燕麥蛋白（w/w）為1:0.6 時溶解度達到最高，選擇此樣品進行后續實驗。制備2 mg/mL 的大米-燕麥蛋白（1:0.6）、大米蛋白、燕麥蛋白的溶液，采用S3500 激光粒度儀對蛋白溶液的粒徑進行濕法測定，光源為專利Tri-Laser 激光系統，固體二極管激光器，粒度測試范圍0.01～2000 μm，測定溫度為25 °C。

1.2.8 掃描電子顯微鏡（Search Engine Marketing，SEM） 將大米-燕麥蛋白、大米蛋白、燕麥蛋白粉末粘附在載物臺上，然后在真空離子噴濺設備中進行噴金操作，使用掃描電子顯微鏡JSM-6390A 在15 kV的加速電壓下觀察蛋白的微觀表面結構。

1.2.9 乳化特性的測定 采用Pearce 等[18]的方法并稍加修改。配制2 mg/mL 的大米-燕麥蛋白、大米蛋白、燕麥蛋白的溶液，取8 mL 樣品于離心管中，加入2 mL 大豆油，以10000 r/min 的速度均質60 s，迅速從底部取出100 μL 的乳濁液，加入5 mL 0.1%的SDS 溶液稀釋，搖勻后立即在500 nm 波長下測定吸光度A0。將剩余乳濁液靜置10 min 后，在底部相同位置進行同樣操作，測定吸光度A10。乳化活性指數（Emulsifying Activity Index，EAI）和乳化穩定性（Emulsifying Stability Index，ESI）計算公式如下：

式中，A0、A10分別為乳濁液剛制備完成和靜置10 min 之后在500 nm 處的吸光度值；C 為蛋白質濃度，單位g/mL；φ為油相占比，此處為0.2；D 為稀釋倍數，此處為51。

1.2.10 起泡特性的測定 參照Li 等[19]的方法并稍加修改。配制2 mg/mL 的大米-燕麥蛋白、大米蛋白、燕麥蛋白的溶液，將10 mL 樣品溶液用高速均質乳化機以10000 r/min 的速度均質2 min，迅速將混合液轉移至量筒中測量體積V0，靜置30 min 后再次測量體積V30。起泡性（Foaming Capacity，FC）和泡沫穩定性（Foaming Stability，FS）的計算公式如下：

式中，V0為均質后0 min 時的體積，單位mL；V30為靜置30 min 后剩余的體積，單位mL。

1.2.11 傅里葉紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR） 將2 mg 大米-燕麥蛋白、大米蛋白、燕麥蛋白粉末分別與200 mg KBr 混合，充分研磨后壓制成薄膜，用FTIR 5700 傅里葉紅外光譜儀對蛋白質進行掃描分析，掃描波數范圍4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3 數據處理

所有實驗數據均為3 個平行樣本，用Microsoft Office Excel 2021、Origin 2021 以及SPSS statistics 20 軟件進行數據分析并繪圖，結果以“平均值±標準偏差”表示，并使用ANOVA 程序進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 大米-燕麥蛋白復合材料的溶解度

如圖1a 和圖1b 所示，大米蛋白和燕麥蛋白在水中不能形成穩定的膠體，停止攪拌后，在極短的時間內就會沉淀。經過異源共架后，大米-燕麥蛋白（1:0.6）在水中能形成均勻的膠體（圖1c），靜置24 h后依然穩定。

圖1 大米蛋白（a）、燕麥蛋白（b）和大米-燕麥蛋白（1:0.6，c）在水中分散液的相圖Fig.1 Rice protein (a), oat protein (b) and rice protein-oat protein (1:0.6, c) dispersions in water

異源共架對溶解度的改善情況如圖2 所示。相比大米蛋白和燕麥蛋白，大米-燕麥蛋白的溶解度顯著提升（P＜0.05），這可能是由于經過pH 循環后，大米蛋白和燕麥蛋白之間發生了相互作用。大米-燕麥蛋白的溶解度隨燕麥蛋白添加比例的增加而增大。當比例為1:0.6 時，復合材料的溶解度達到最大，為93.07%±2.15%，約是大米蛋白溶解度（8.49%±1.53%）的10.96 倍。但是，燕麥蛋白添加量的繼續增加導致大米-燕麥蛋白復合材料溶解度呈現下降的趨勢，這可能是由于過量的燕麥蛋白會影響大米蛋白的分散性，阻礙均一、穩定膠體的形成[20]。

圖2 大米蛋白、燕麥蛋白和大米-燕麥蛋白的溶解度Fig.2 Solubility of rice protein, oat protein and rice protein-oat protein

2.2 大米-燕麥蛋白復合材料的SDS-PAGE

破壞蛋白質的一級結構會影響其功能特性并造成營養的流失[21]。因此，通過SDS-PAGE 對樣品的一級結構進行表征，結果如圖3 所示。圖3a 泳道2、3 分別代表了大米蛋白和燕麥蛋白的主要亞基條帶。大米蛋白在15～20、25～37、49.6、70～100 kD 顯示的條帶分別對應大米谷蛋白的堿性亞基（β亞基）、酸性亞基（α亞基）、大米清蛋白和大米球蛋白[22-23]。燕麥蛋白在15～24、21、29.5、32～37 kD 以及55 和65 kD 顯示的條帶分別對應于12S 球蛋白β亞基、3S 球蛋白、清蛋白[24-25]、12S 球蛋白α亞基[26]以及7S 球蛋白的亞基[27]。

圖3 不同樣品的SDS-PAGE 圖像Fig.3 SDS-PAGE images of different samples

不同比例蛋白復合物的SDS-PAGE 圖像（圖3a泳道4～8）清晰呈現出了兩者的全部亞基，且無新的條帶出現。上述結果表明，在異源共架的過程中，大米蛋白和燕麥蛋白兩種蛋白質分子一級結構完整，且并未反應生成新的亞基。相比大米蛋白，大米-燕麥蛋白樣品在49.6 kD 處的條帶顏色更深，對應大米清蛋白的特征亞基[23]，說明異源共架增加了大米-燕麥蛋白中的大米蛋白在中性條件下的溶解度。隨著燕麥蛋白比例逐步增加，其在21、29.5 和65 kD 處的特征亞基條帶顏色也逐步加深，說明大米-燕麥蛋白中共架的燕麥蛋白含量逐漸增加。異源共架過程中所產生沉淀的SDS-PAGE 圖像如圖3b 所示，圖中只觀察到大米蛋白的主要亞基，無法觀察到燕麥蛋白的特征亞基，說明燕麥蛋白幾乎完全溶解于水中，圖2 中溶解度的增加主要來源于對大米蛋白的溶解度改善。

2.3 大米-燕麥蛋白復合材料的濁度

濁度的變化可以體現出溶液中溶質的聚集，以及溶質聚集體質量、大小的變化，在一定程度上可以反映出蛋白質的溶解性、聚集狀態和粒徑大小[28]。

如圖4 所示，樣品的濁度總體隨pH 的增加呈現下降趨勢，其中大米蛋白的下降速率最快。pH 為7 時，大米蛋白的透過率僅為13.17%，較pH 為12時降低了85.7%，說明此時大米蛋白分子聚集，懸浮于溶液中，使得透過率較低[29]。異源共架之后，大米-燕麥蛋白的透過率與大米蛋白相比明顯增加，透過率的下降速率越來越慢，當大米蛋白/燕麥蛋白（w/w）為1:0.6 時透過率變化最小，原因可能是異源共架技術使得復合蛋白分子之間的靜電斥力增加，從而形成更加均勻和穩定的蛋白質溶液[30]。透過率越大說明溶解度越好，與上文得出大米蛋白/燕麥蛋白（w/w）為1:0.6 時溶解度最高的結論相一致。

圖4 大米蛋白、燕麥蛋白和大米-燕麥蛋白水溶液的透過率隨pH 的變化Fig.4 Changes in the transmittance of rice protein, oat protein,and rice protein-oat protein aqueous solutions with pH

2.4 大米-燕麥蛋白復合材料的粒徑分布情況

不同蛋白樣的粒徑分布如圖5 所示，大米蛋白和燕麥蛋白樣品的粒徑較大，極易發生大分子間的聚集而沉降[13]，與上文2.3 所得大米蛋白和燕麥蛋白溶液透過率很低的結果相一致。而經過異源共架處理的大米-燕麥蛋白復合物粒徑為0.1 μm 左右，與單一組分蛋白相比，粒徑明顯降低，分子聚沉作用減弱，更利于在水中形成均勻穩定的膠體，從而達到增溶效果。

圖5 大米蛋白、燕麥蛋白、大米-燕麥蛋白（1:0.6）在水中的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of rice protein, oat protein, rice protein-oat protein (1:0.6) in water

2.5 大米-燕麥蛋白復合材料的結構表征

不同蛋白樣品的微觀形態可以通過SEM 觀察。如圖6 所示，大米蛋白表面光滑，且顆粒粒徑不均一；燕麥蛋白的表面粗糙、凹凸不平，且顆粒聚集。大米-燕麥蛋白相較于大米蛋白結構更松散、均一，相較于燕麥蛋白表面更加光滑。這可能是異源共架技術改變了蛋白質的分子間作用力以及二硫鍵之間交聯的平衡，使得大米蛋白和燕麥蛋白的結構展開，發生重組，蛋白顆粒變小[31]，這使其更容易分散在水中。在不同燕麥蛋白比例的蛋白復合材料中，大米-燕麥蛋白（1:0.6）的顆粒最小，與其溶解度最高的結果相一致，而隨著燕麥蛋白的比例進一步增加，顆粒逐漸增大，這可能是因為燕麥蛋白的含量過高，使得最終所得蛋白樣品中存在未完全參與反應的燕麥蛋白，影響了均一結構的形成。

圖6 大米蛋白、燕麥蛋白和大米-燕麥蛋白的微觀結構Fig.6 Microstructure of rice protein, oat protein and rice protein-oat protein

2.6 大米-燕麥蛋白復合材料的乳化特性

異源共架處理后的蛋白乳化活性指數和乳化穩定性指數的變化如圖7 所示。與大米蛋白（22.93 m2/g）不同，引入燕麥蛋白之后大米-燕麥蛋白的乳化活性顯著提升（P＜0.05），這是因為異源共架處理促進了蛋白質聚集物的部分解離和結構展開，暴露了疏水基團，從而促進了蛋白質在油水界面的擴散，提高了乳化性能[32]，但大米蛋白與燕麥蛋白比例為1:0.2、1:0.4 時和1:0.6、1:0.8 時，乳化活性并未有顯著性差異（P＞0.05），說明對于乳化活性來說，異源共架技術帶來的影響高于燕麥蛋白的加入量不同帶來的影響。此外，蛋白質的高溶解性也有利于蛋白質在微小油滴表面迅速吸附[33]，從而提高乳化活性，與圖2 中的溶解度結果相一致。蛋白的乳化穩定性在大米蛋白/燕麥蛋白（w/w）為1:0.6 時達到最高（85.38%），比大米蛋白增加了8.11%，說明異源共架技術提高了大米-燕麥蛋白 在油水界面的固化[34]，但燕麥蛋白比例進一步增加，破壞了蛋白質膜表面的結構特性穩定，反而使復合蛋白的乳化穩定性有所下降。

圖7 大米蛋白、燕麥蛋白和大米-燕麥蛋白水溶液的乳化特性Fig.7 Emulsifying properties of rice protein, oat protein, and rice protein-oat protein aqueous solutions

2.7 大米-燕麥蛋白復合材料的起泡特性

起泡特性歸因于蛋白質降低水-空氣界面表面張力的能力[35]，如圖8 所示，大米蛋白的溶解性較差，界面浸潤性差，導致起泡性低。而大米-燕麥蛋白表面經過異源共架之后暴露出充足的疏水基團，同時肽鍵的展開增加[36]，可以在熱力學驅動下更容易吸附在空氣-水界面，形成厚實的泡沫層，以降低過多表面能，使得其起泡性高于大米蛋白和燕麥蛋白，在大米蛋白/燕麥蛋白（w/w）為1:0.6 時起泡性比大米蛋白提高4.9 倍。泡沫穩定性反映蛋白質穩定泡沫抵抗機械應力或重力的能力[35]，燕麥蛋白表面的靜電斥力可以有助于防止相鄰氣泡之間的接觸，從而抵消泡沫的不穩定[37]，因此，燕麥蛋白含量較高的大米-燕麥蛋白表現出更好的泡沫穩定性，隨著燕麥蛋白比例的增加泡沫穩定性分別比大米蛋白提高了18.3%、37.4%、38.3%、45.1%和58.2%。

圖8 大米蛋白、燕麥蛋白和大米-燕麥蛋白水溶液的起泡特性Fig.8 Foaming properties of rice protein, oat protein, and rice protein-oat protein aqueous solutions

2.8 大米-燕麥蛋白復合材料的傅里葉紅外光譜（FTIR）

蛋白樣品的FTIR 光譜如圖9 所示。FTIR 光譜中的酰胺I 帶（1600～1700 cm-1）是由肽鍵中C=O 拉伸振動引起的，酰胺II 帶（1500～1600 cm-1）則是由于酰胺基團的C-N 拉伸振動和N-H 彎曲振動引起的[38]。圖9 中大米-燕麥蛋白在此范圍內的吸收峰強度均低于大米蛋白，尤其是大米-燕麥蛋白（1:0.6），這可能是因為異源共架技術使得羰基和氨基基團丟失，對蛋白的二級結構產生了影響[39]。而2800～3100 cm-1處的峰與-CH3和-CH2的C-H 拉伸振動有關，在2930 cm-1左右區域的變化反映了脂肪族氨基酸的暴露，代表了疏水相互作用，C-H 拉伸振動的降低意味著該區域的疏水相互作用增強[40]。異源共架的處理使得大米蛋白的峰值位置從2939.52 cm-1紅移至2931.80～2937.59 cm-1，說明疏水相互作用可能是大米蛋白和燕麥蛋白之間的主要內驅力之一。此外，由于氫鍵效應帶來的N-H 和O-H 的拉伸振動[41]，產生了在3300 cm-1左右較寬的峰，大米蛋白的峰值位置從3288.63 cm-1藍移至3298.28～3302.13 cm-1，說明氫鍵也在兩者之間起到一定作用。

圖9 大米蛋白、燕麥蛋白和大米-燕麥蛋白的傅里葉紅外光譜圖Fig.9 FTIR of rice protein, oat protein, and rice proteinoat protein

3 結論

本文通過燕麥蛋白耦合異源共架技術對大米蛋白進行增溶以增加其應用價值。異源共架技術可以增強大米蛋白和燕麥蛋白之間的疏水相互作用和氫鍵，在不破壞大米蛋白和燕麥蛋白一級結構的基礎上，降低分子聚集程度及顆粒粒徑，使蛋白微觀結構更加松散，從而增強了大米-燕麥蛋白的溶解度。當大米蛋白/燕麥蛋白（w/w）為1:0.6 時，溶解度達到最高（93.07%±2.15%），顯著高于大米蛋白（8.49%±1.53%）（P＜0.05）。同時，大米-燕麥蛋白的乳化特性及起泡特性也隨之提高。綜上，本研究為擴大大米蛋白的應用及大米-燕麥蛋白異源共架體的進一步研究提供理論基礎。

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