寒地‘貝達’葡萄清汁的研制及理化指標分析

朱 磊，呂珊珊，史文雅，于昕楚，宋晨龍

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319）

‘貝達（Beta）’葡萄原產于美國，是由河岸葡萄（Vitis ripariaL.）和美洲葡萄（V.labrusca）雜交而成，早年引入我國[1]，具有耐干旱、抗病力強、抗寒等優點，主要作為抗性砧木進行栽培和利用[2-3]。在黑龍江地區，氣候寒冷且葡萄生長季短，栽培的加工用葡萄品種較少，除了山葡萄外，‘貝達’也可用于釀酒和制汁。

葡萄中含有大量具有抗氧化活性的植物化學物質，包括花色苷、黃酮醇、原花青素等酚類化合物以及維生素C，這些物質的攝入與降低慢性疾病的風險有關[4-7]，而葡萄汁飲品可為我們的日常飲食補充這些植物化學成分?！愡_’果實出汁率較高、含糖量低、酸度大、酚類物質豐富、具有典型的麝香氣味[8-9]。實驗室前期對其中成分進行了測定，2021 年‘貝達’果實的可溶性固形物含量為15.52°Brix、可滴定酸度為2.05%、出汁率為62.33%。如果在寒地就地取材制作葡萄汁，‘貝達’果實是潛在的良好原料。

葡萄汁是近幾年來國內外非常流行的健康飲品，它不僅味美可口、營養豐富，而且它富含酚類化合物[10-11]。目前，國內外用于制汁的葡萄品種多為歐亞種、美洲種或歐美雜種，例如：康可、康拜爾、美洲紅。我國用于制汁葡萄生產的品種以巨峰、玫瑰露等國外品種為主，但這些品種不適宜在寒地露地栽培[12-13]。我國對于葡萄果汁的開發研究，除了葡萄純汁生產工藝、調配葡萄汁的配方外[14]，還有關于復配葡萄汁的報道[15]，例如紫甘藍葡萄汁[16]、猴頭菇葡萄汁[17]等，但市場上鮮見寒地葡萄制成的果汁產品。

目前，中國是全球最大的葡萄種植國和消費國之一，葡萄皮渣是葡萄酒和果汁制造的副產品[18-19]。近年來，通過國內外學者的深入研究發現，皮渣中富含多種益于人體健康的成分，尤其是其中的原花青素、白藜蘆醇和單寧等酚類物質，具有良好的醫療和保健作用[20-21]。從葡萄皮中提取的白藜蘆醇具有很好的保健功能，有調節免疫以及抗炎等作用[22]，葡萄籽中提取的原花青素可以改善血液循環、改善缺氧和保護心臟等一系列功能，是一種純植物提取的保健品[23]。

本文以寒地栽培的抗性砧木品種‘貝達’果實為原料，為了克服原汁‘糖低酸高’的缺陷、突出其美洲種特有的風味特征，并使果實中的營養活性成分得以充分保留，研制了一款葡萄清汁的產品配方，并實現了榨汁后葡萄皮渣的二次利用，以期為葡萄皮渣綜合利用提供新方法，同時也為提高葡萄清汁的營養價值提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成熟的‘貝達’葡萄果實 購自大慶新村，無病蟲害及腐爛果；葡萄汁 購于大慶市華聯超市，3 種市售葡萄汁均標示100%，葡萄汁A 呈紅色，葡萄汁B 呈紫色，葡萄汁C 呈桃紅色；硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、福林酚試劑、碳酸鈉、甲醇、乙醇、酚酞、濃硫酸、兒茶素、香草醛、氯化鉀、醋酸鈉、鹽酸、葡萄糖 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；羧甲基纖維素鈉、黃原膠、明膠、瓊脂和果膠酶 食品級，天津大茂化學試劑有限公司。

R47F 型瑞彤減速機 溫州瑞通減速機有限公司；722S 型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；AR153CN 型電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；PXSJ-216 型離子計 廣州市新英電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄清汁制備工藝流程 原料→除梗破碎→壓榨→加硫處理→除酒石→調配→過濾→殺菌→灌裝密封→冷卻→成品[24]。

操作要點：選取新鮮完整、成熟良好、呈藍黑色或紫色、無霉爛及無病蟲害的果實，利用小型除梗破碎機進行除梗破碎，然后先進行自流汁的分離，再壓榨固體皮渣得到壓榨汁，將自流汁與壓榨汁混合，在果汁中加入偏重亞硫酸鉀，使二氧化硫濃度達到350 mg/L，作為抗褐變劑和澄清劑。將葡萄汁冷卻至-2 ℃使酒石析出，靜置使大部分酒石析出，將上層清汁進行過濾后，再重復2 次除酒石操作。向果汁中加入糖、酸和葡萄皮渣酚類提取物進行調配，用果膠酶進行澄清，果膠酶的添加量為0.2 g/L，采用聚偏氟乙烯超濾膜對果汁進行過濾，獲得葡萄清汁。將葡萄清汁和玻璃瓶分別在85 ℃條件下殺菌15 min，灌裝后立即將玻璃瓶密封，玻璃瓶倒置1～2 min 后迅速冷卻至低于30 ℃。

1.2.2 葡萄皮和籽酚類化合物提取

1.2.2.1 葡萄皮渣酚類提取物的制備 收集壓榨后的‘貝達’葡萄皮渣，在陰涼處室溫風干72 h，手動分離葡萄皮和葡萄籽，利用粉碎機將樣品粉碎。準確稱取1.000 g 粉碎的葡萄皮/籽，按照一定的料液比加入一定體積分數的乙醇-水（Vol）溶液，放入水浴振蕩器以300 r/min 在室溫下避光提取，提取結束后4000 r/min 離心15 min，重復提取若干次，合并上清液。提取液利用旋轉蒸發儀在40 ℃下除去乙醇并濃縮，制成10 mL 的濃縮液后，密封避光于-20 ℃下保存。

1.2.2.2 酚類化合物提取的單因素實驗 對乙醇濃度、料液比、浸提時間、浸提次數四個因素進行單因素實驗。選擇乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%，其中單因素固定條件為料液比1：25、浸提時間1.5 h、浸提1 次；料液比為1:5、1:15、1:25、1:35、1:45，其中單因素固定條件為乙醇濃度60%、浸提時間1.5 h、浸提1 次；浸提時間為0.5、1、1.5、2 h，其中單因素固定條件為乙醇濃度60%、料液比1：25、浸提1 次；浸提次數為1、2、3、4 次，其中單因素固定條件為乙醇濃度60%、料液比1：25、浸提時間1.5 h。以提取物中總酚和花色苷的提取量為指標確定最佳單因素水平，總酚和花色苷的測定方法見1.2.6。

1.2.3 葡萄皮渣酚類提取物添加量的單因素實驗通過預實驗初步確定：葡萄汁與水的配比為4.5:5.5，白砂糖含量為8.25%，檸檬酸含量為0.03%，葡萄籽酚類化合物添加量為0.4%，進行葡萄皮酚類提取物添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的單因素實驗。葡萄汁與水的配比為4.5：5.5，白砂糖含量為8.25%，檸檬酸含量為0.03%，葡萄皮酚類化合物添加量為0.3%，進行葡萄籽酚類提取物添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的單因素實驗。根據感官評定結果確定最佳添加量。

1.2.4 葡萄清汁配方的正交試驗 正交試驗包括5 個因素（表1），A 為葡萄原汁添加量，B 為白砂糖添加量，C 為檸檬酸添加量，D 為葡萄皮酚類提取物添加量（SkPP），E 為葡萄籽酚類提取物添加量（SePP），進行五因素四水平正交試驗設計。根據感官評定結果確定最優組合。

表1 五因素四水平正交試驗表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 葡萄汁的感官評定方法 品評人員為食品行業訓練有素的8 名學生與教師，4 男4 女，年齡20～35 歲，在評定前先熟悉葡萄汁品評試驗的評價項目及評定方法，培訓所用葡萄汁為本研究的‘貝達’葡萄清汁和市售葡萄汁。單因素實驗結果只進行基本特點描述，正交試驗結果進行系統評分。葡萄清汁感官質量鑒定評分標準參照參考文獻[22]的標準，具體見表2。

表2 葡萄清汁感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard of grape clear juice

1.2.6 理化指標的測定方法

1.2.6.1 總酸含量的測定 按照GB 12456-2021 中的滴定法進行[25]。

1.2.6.2 總糖含量的測定 按照GB 5009.8-2016 中的滴定法進行測定[26]。

1.2.6.3 維生素C 含量的測定 按照GB 5009.86-2016中的滴定法進行測定[27]。

1.2.6.4 總酚含量的測定 采用Singleton 等[28]的方法并略做修改，吸取100 μL 提取液和3 mL 蒸餾水至10 mL 具塞試管，混勻后依次加入250 μL 福林酚、750 μL 20%的Na2CO3溶液混勻，用蒸餾水定容至5 mL。測試溶液在40 ℃水浴中避光反應30 min，反應完畢于760 nm 波長下測定吸光度值。根據沒食子酸標準曲線y=0.9197x-0.0241（R2=0.9992）計算總酚含量，結果表示為毫克沒食子酸當量每克鮮果皮（mg GAE/g FM）。計算公式如下：

式中，X 為質量濃度，mg/mL；V 為樣液體積，mL；N 為稀釋倍數；m 為葡萄皮樣品質量，g。

式中，X 為質量濃度，mg/mL；N 為稀釋倍數。

1.2.6.5 黃烷-3-醇含量的測定 采用Sun 等[29]的方法并略做修改，吸取400 μL 葡萄清汁提取液至10 mL 棕色容量瓶中，加入甲醇補足至1 mL，依次加入2.5 mL 1%香草醛-甲醇溶液，2.5 mL 25%濃硫酸-甲醇溶液混勻，測試溶液在30 ℃水浴中避光反應15 min，反應完畢于500 nm 波長下測定吸光度值。根據兒茶素標準曲線y=0.823x-0.0104（R2=0.9994）計算黃烷-3-醇含量，結果表示為毫克兒茶素當量每升葡萄清汁（mg CAE/L），計算同式（2）。

1.2.6.6 花色苷含量的測定 采用pH 示差法[30]并略作修改，吸取800 μL 提取液2 份至試管中，分別加入pH1.0 和pH4.5 緩沖液，用蒸餾水定容至10 mL，測試溶液在室溫下反應2 h，反應完畢分別在500、700 nm 波長下測定吸光度值。結果表示為毫克二甲花翠素葡萄糖苷當量每克鮮果皮（mg CGE/g FM）。計算公式如下：

式中，MW 為449.2 g/mol；DF 為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；ε為26900 L·mol-1·cm；L 為光程，1 cm；m 為葡萄皮樣品質量，g。

式中，MW 為449.2 g/mol；DF 為稀釋倍數；ε為26900 L·mol-1·cm；L 為光程，1 cm。

1.2.6.7 DPPH 自由基清除能力的測定 采用Brand 等[31]的方法并略做修改，吸取200 μL 葡萄清汁提取液和7.8 mL DPPH 甲醇溶液至10 mL 棕色容量瓶中，測試溶液在室溫下反應60 min，反應完畢于515 nm 波長下測定吸光度值。根據Trolox 標準曲線y=-0.3651x+0.9007（R2=0.9995）計算DPPH 自由基清除能力，結果表示為毫摩爾Trolox 當量每升葡萄清汁（mmol Trolox/L）。

1.3 數據處理

每項實驗進行三次重復，結果表示為平均值±標準偏差，采用SPSS 22.0 進行方差分析（ANOVA），采用Microsoft excel 2019 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 葡萄皮渣酚類提取最優條件的確定

乙醇濃度對酚類化合物含量影響顯著（圖1A）。在乙醇濃度為60%時，總酚和花色苷提取量達到最大值分別為27.51 mg GAE/g FM、0.19 mg CGE/g FM，乙醇能促進氫鍵的斷裂，聚合物由大分子變成小分子，更易于游離到細胞外，從而萃取到溶劑體系中，適宜的乙醇水溶液有助于酚類化合物的溶出。當乙醇濃度過大時，酚類化合物含量明顯減少，原因主要是不同酚類的極性不同。因此，最適乙醇濃度確定為60%。

圖1 乙醇濃度（A）、料液比（B）、浸提時間（C）、浸提次數（D）對葡萄皮總酚和花色苷提取量的影響Fig.1 Effects of ehanol concentration (A), mterial-liquid ratio(B), extraction duration (C) and extraction times (D) on the extractions of total phenolics and anthocyanins from grape skins

隨著料液比的增大，溶劑量增多，酚類化合物的溶解量逐漸達到飽和，在料液比為1:25 時總酚和花色苷提取量達到最大值分別為28.28 mg GAE/g FM、0.21 mg CGE/g FM（圖1B），料液比達到1:25 以后，其他雜質溶出相對增加，會抑制酚類化合物的溶出。溶劑量增加也會造成實驗試劑大量消耗，造成浪費。因此，最適料液比確定為1:25。

隨著浸提時間的增長，提取量整體呈上升趨勢，在提取時間為1.5 h 時，總酚和花色苷提取量達到最大值分別為28.82 mg GAE/g FM、0.18 mg CGE/g FM（圖1C）。浸提時間太短酚類化合物不能夠完全析出，導致提取量低，浸提時間過長則會破壞一些結構不穩定的酚類物質。因此，最適浸提時間確定為1.5 h。

隨著浸提次數的增加，酚類化合物提取量呈上升的趨勢。浸提次數3 次時總酚和花色苷提取量達到最大值分別為36.04 mg GAE/g FM、0.22 mg CGE/g FM（圖1D）?；ㄉ仗崛×吭诮? 次后開始持平，無明顯變化，達到穩定狀態，因此，選擇浸提3 次。

根據以上單因素實驗結果，葡萄皮酚類的最佳提取條件確定為：60%的乙醇濃度，料液比1:25，提取1.5 h，浸提3 次。葡萄皮中酚類物質的種類較多，且含有對果汁感官影響重要的花色苷，所以葡萄籽酚類的提取也按照此最優條件進行。

2.2 寒地葡萄清汁最優配方的確定

皮和籽的酚類成分不同，對葡萄汁感官影響不同，葡萄皮富含的花色苷主要影響葡萄汁的顏色，并帶有葡萄果實的香氣成分，有一定的單寧含量，葡萄籽富含單寧主要影響葡萄汁的澀味。這些酚類物質都能明顯提高葡萄汁的營養價值和生物活性。根據SkPP 的單因素實驗的感官評定結果（表3），添加量為0.3%和0.4%時，葡萄汁的顏色紅、香氣和葡萄風味表現較好，確定以0.2%、0.3%、0.4%、0.5%進行后續的正交試驗。SePP 的添加量為0.3%和0.4%時，葡萄汁有葡萄單寧的典型風味，口感適中，確定以0.2%、0.3%、0.4%、0.5%進行后續的正交試驗。

表3 葡萄皮渣中皮/籽酚類提取物的添加量對葡萄汁主要感官特征的影響Table 3 Effects of the addition of phenolic extracts from grape skin/seed on the main sensory characteristics of grape juice

根據正交試驗結果，各因素對寒地葡萄清汁感官影響的順序為D=E＞A＞B＞C（表4），說明‘貝達’皮渣的皮和籽酚類提取物的加入量對果汁的感官影響最顯著，葡萄原汁添加量次之，而白砂糖和檸檬酸添加量的影響不顯著（表5）。最優組合配方為A2B2C4D3E4，即葡萄原汁添加量45%，白砂糖添加量8.2%，檸檬酸添加量0.035%，SkPP 添加量0.4%，SePP 添加量0.5%，此時‘貝達’葡萄清汁的色澤、香氣、口感和狀態表現最好，其感官評分總分為86 分。

表4 葡萄汁配方L16（45）正交試驗結果Table 4 Results of L16 (45) orthogonal test for grape juice formula

表5 正交試驗的方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test

2.2.1 驗證實驗 根據上述正交試驗的結果，使用最優配方和第五組分別進行3 次驗證實驗（表6），發現最佳配方條件下研制的寒地‘貝達’葡萄清汁評分良好，顯著高于第五組，色澤、香氣、口感和狀態均為最佳水平。

表6 最佳工藝條件下的驗證實驗Table 6 Validation test under the optimum process conditions

2.3 葡萄汁的理化指標

研制的寒地‘貝達’葡萄清汁總糖和總酸含量均顯著高于市售葡萄汁，分別為14.14、11.03 g/L（P＜0.05）（表7）。由于品種特點和寒地氣候特點，‘貝達’果實的糖度低而酸度高，調配后的‘貝達’葡萄清汁的甜度酸度得到了調整，減少了原汁的加糖量，同時保留了葡萄典型的感官特征。

表7 不同葡萄汁的理化指標Table 7 Physicochemical index of different grape juice

研制的寒地‘貝達’葡萄清汁的維生素C 含量和酚類含量均高于市售葡萄汁A 和市售葡萄汁C，但低于市售葡萄汁B，抗氧化活性高于市售葡萄汁A，與市售葡萄汁C 沒有顯著差異，但低于市售葡萄汁B。市售葡萄汁B 顏色較深，很可能是葡萄品種的原因，導致其酚類含量和抗氧化活性明顯高于其他樣品。而研制產品只有45%的原汁含量，通過添加皮渣酚類提取物來補充酚類物質，使清汁產品的活性物質含量仍高于2 種市售暢銷的原汁葡萄汁產品，具有較高的抗氧化活性。

3 結論

以寒地栽培的抗性砧木品種‘貝達’果實為原料，研制了一款葡萄清汁的產品配方，并實現了榨汁后葡萄皮渣的二次利用。利用單因素實驗，以總酚和花色苷的提取量為指標，確定了葡萄皮渣酚類化合物提取的最佳工藝條件：乙醇濃度為60%、料液比為1:25、浸提時間為1.5 h、浸提次數為3 次。通過單因素實驗和正交試驗確定了寒地‘貝達’葡萄清汁的最優配方：原汁添加量為45%、白砂糖添加量為8.2%、檸檬酸添加量為0.035%、SkPP 添加量0.4%，SePP 添加量0.5%。研制的寒地‘貝達’葡萄清汁總糖含量為14.14 g/L，總酸含量為11.03 g/L，維生素C 含量為3.27 mg/100 mL，總酚含量為831.08 mg GAE/L，黃烷-3-醇含量為25.37 mg CAE/L，花色苷含量為15.75 mg CGE/L，DPPH 自由基清除能力為3.71 mmol Trolox/L。與市售純汁葡萄汁相比，寒地‘貝達’葡萄清汁的純汁比例下降，但加糖量降低，葡萄皮渣酚類提取物的添加使產品具有較高的酚類物質含量和抗氧化活性，滿足消費者對果汁品質和健康的多元需求，并且實現了葡萄皮渣的再利用。

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