響應面法優化螺旋藻多糖提取及脫色工藝

吳世林，陳 冉，陳靜蕓，楊 寧，李 坤，章 真,*，張榮慶

（1.上海海洋大學水產與生命學院，上海 201306；2.浙江清華長三角研究院浙江省應用酶學重點實驗室，浙江嘉興 314000）

近些年來，螺旋藻被廣泛應用在飼料、醫藥及食品等領域，因其富含豐富的蛋白質、維生素、多糖以及多種脂肪酸和礦物質等[1]。螺旋藻多糖（Spirulina platensispolysaccharides）是一種生理活性多糖，具有抗癌、抗氧化、免疫調節、抗炎、調節腸道微生物菌群等生物活性[2]。Rajasekar 等[3]研究表明，螺旋藻多糖具有強大的抗氧化活性，具有清除自由基的功效。Zhou 等[4]在探究螺旋藻多糖抑制鎘誘導的小鼠損傷的機制時，發現螺旋藻多糖可以通過下調肝臟中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IL-γ）來改善鎘誘導的炎癥相關疾病。與已知的抗癌藥物阿霉素相比，螺旋藻多糖能夠抑制胃癌細胞的增殖，提高巨噬細胞活性，并能抑制A549 肺癌細胞的生長[5]。Lu 等[6]發現螺旋藻多糖可以調節肺癌小鼠的腸道微生物區系，并推測螺旋藻多糖通過FcεRI 信號通路和花生四烯酸代謝抑制肺癌。

如何高效地從植物、動物及微生物中提取多糖，并最大程度保留其活性，是目前國內外研究的熱點。目前，微藻多糖的提取多采用超聲提取法、熱水浸提法、微波輔助萃取法和酶法等[7]。超聲波提取法，憑借時間快效率高，被廣泛應用在多糖的提取過程中，但超聲波在工作中容易使多糖結構發生變化，會影響到其提取率以及活性[8]。熱水浸提法利用水的極性大的特點，對于細胞具有較強的穿透力，可以使胞內多糖溶解至水中，并且隨著溫度的升高，其溶解率也會相應增大[9]；其缺點是耗時長，效率低，一些酸性多糖可能無法浸提完全，造成損失[10]。微波輔助萃取法利用微波中的能量將細胞壁破壞，促進細胞胞內多糖快速溶解進提取液中[11]，但其使用條件受限，不適合大規模制備[12]。酶解法是利用纖維素酶作用微藻細胞壁，破壞其結構，使多糖成分溶解出[13]。酶解法提取效率高且具環境友好性，是一種高效綠色提取技術。但其成本較高，且酶保存條件苛刻[14]。

本研究采用熱堿液法提取螺旋藻多糖，并對其提取條件行優化，熱堿液法浸提多糖，彌補了熱水浸提的缺點，可以使酸性多糖最大程度浸提出來，堿液對于細胞壁具有更強的穿透力。由于螺旋藻粗多糖含有大量色素，不利于后續純化，因此需要對其進行脫色。近年來，使用較多的去除色素的方法是活性炭法[15]、柱色譜法[16]及過氧化氫法。過氧化氫是一種強氧化劑，能夠有效地將多糖分子中的色素氧化分解，從而達到脫色的目的，過氧化氫在分解后產生水和氧氣，不會對環境造成污染，具有無毒無害、操作簡便、脫色高效等特點，因此本研究將對過氧化氫法脫色工藝進行響應面優化，以得到最佳脫色條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻干粉 陜西寶禾生物科技有限公司；濃硫酸 浙江中星化工試劑有限公司；苯酚 上海凌峰化學試劑有限公司；丙酮 北京索萊寶科技有限公司；30%過氧化氫 國藥集團化學試劑有限公司；本實驗其他所用試劑均為分析純。

HH-3A 水浴鍋 常州國華電器有限公司；RE 2000A 旋轉蒸發儀 上海研承儀器有限公司；FD 1850 冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；UV1800PC 分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Sorvall LYNX 6000 離心機 Thermo Fisher。

1.2 實驗方法

1.2.1 熱堿浸提螺旋藻多糖單因素實驗 技術路線[17]：取干藻粉2 g，乙醇脫脂，堿液浸提后4000 r/min離心10 min 棄去藻渣，然后使用3 倍體積無水乙醇沉淀過夜，4000 r/min 離心10 min 棄去上層溶液，沉淀經乙醚、丙酮及無水乙醇清洗數次，之后冷凍干燥，得到螺旋藻多糖，采用苯酚硫酸法測定多糖含量。

選擇以下4 個因素：提取溫度、時間、NaOH 質量分數和料液比。固定條件料液比1:20、提取溫度80 ℃、提取時間3 h、NaOH 質量分數1.25%，通過改變單一條件分別取5 份考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、提取時間（1、2、3、4、5 h）、NaOH 質量分數（0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%）對提取螺旋藻多糖效果的影響。

1.2.2 響應面優化熱堿浸提螺旋藻多糖工藝 分析比較單因素實驗結果，最終確定NaOH 質量分數、提取時間和提取溫度這3 個因素及其3 個水平，并通過Design Expert 13 進行3 因素3 水平的試驗設計。表1 為試驗的因子和等級。

表1 試驗因素及水平Table 1 Test factors and horizontal

1.2.3 過氧化氫法螺旋藻多糖脫色單因素實驗 當堿性溶液的濃度較高時，會導致多糖水解，所以pH設定為8，用6 mol/L 氫氧化鈉溶液進行調節。每個處理設定為10 mL，固定過氧化氫添加量15%，脫色時間60 min，脫色溫度50 ℃，改變單一的實驗條件：過氧化氫添加量（5%、10%、15%、20%、25%）、脫色時間（20、40、60、80、100 min）以及脫色溫度（30、40、50、60、70 ℃），用脫色率來反映不同條件的脫色效果。

1.2.4 響應面試驗優化過氧化氫法螺旋藻多糖脫色工藝 比較分析單因素實驗結果，確定脫色時間、脫色溫度和過氧化氫添加量這3 個因素，并確定各因素的3 個水平，根據常見方法Box-Behnken，設計3 因素3 水平的試驗。表2 中顯示了試驗的因子和水平。

表2 試驗因素及水平Table 2 Test factors and horizontal

1.2.5 多糖含量的測定 采用苯酚硫酸法，將標準葡萄糖干燥后，準確稱取0.025 g，使用純水配制成0.1 mg/mL 的標準葡萄糖溶液。在試管中分別準確吸取標準葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、0.9 mL，并用蒸餾水補齊至1.0 mL。再分別加入0.5 mL 6%苯酚溶液和2.5 mL 的濃硫酸，搖勻，室溫下反應30 min。以第一管為空白對照，測定各管溶液490 nm 下的吸光度（A490），應用Origin 2022 制作葡萄糖濃度（y）-A490（x）標準曲線，并計算線性回歸方程[18]。最終得到葡萄糖標準曲線方程為：y=17.166x+0.002，R2=0.996。

1.2.6 得率的測定與計算 將經過熱堿法提取得到的螺旋藻多糖提取液，利用苯酚硫酸法測出其含量，利用公式（1）計算出螺旋藻多糖得率。

式中：C 為多糖濃度（mg/mL）；V 為待測液定容體積（mL）；N 為稀釋倍數；M 為螺旋藻干粉質量（mg）。

1.2.7 多糖保留率的測定與計算 脫色前后的多糖含量使用苯酚硫酸法進行測定，然后帶入公式（2）進行多糖保留率的計算。

式中：M1為脫色后多糖總量；M2為脫色前多糖總量。

1.2.8 脫色率的測定與計算 取3 mg/mL 螺旋藻粗多糖溶液，450 nm 波長條件下，分別測定并記錄脫色處理前后的吸光值。多糖溶液脫色率由公式（3）計算。

1.3 數據處理

本次實驗所得到的數據均為3 個重復，利用Origin 2022 和Excel 2019 軟件對數據進行處理、統計計算和差異顯著性分析，利用Design Expert 13 軟件對響應面試驗設計和結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 熱堿浸提螺旋藻多糖單因素實驗結果

2.1.1 料液比對螺旋藻多糖得率的影響 合適的料液比，可以顯著提高螺旋藻多糖的得率[19]。如圖1所示，隨著料液比中提取溶劑比例的逐漸增加，螺旋藻多糖的得率曲線呈現先快速增加，然后趨于平緩的趨勢，當料液比超過1:20 g/mL 時，得率增長較慢，螺旋藻多糖得到充分提取。提高提取液的比重，對于多糖的充分溶出起促進作用，同時有利于提高后續除蛋白流程中多糖的保留率。而隨著水量的增多，會相應地增加后續工藝的能耗及試驗成本[20]，因此選擇料液比為1:20 g/mL，作為后續試驗條件。

圖1 料液比對螺旋藻多糖得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.1.2 提取溫度對螺旋藻多糖得率的影響 如圖2所示，溫度在50～80 ℃范圍內，隨著溫度升高，多糖得率迅速增加；溫度在80～90 ℃范圍內，螺旋藻多糖的得率差異不顯著，推測螺旋藻中多糖已經充分溶解在提取液里。升溫促進分子運動，促進多糖分子溶出細胞，并增大溶解度[21]，但是升高水溫的同時，導致能耗的增加，提高了提取成本。因此，綜合考慮，將溫度70、80、90 ℃作為后續響應面試驗3 水平。

圖2 提取溫度對螺旋藻多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.1.3 提取時間對螺旋藻多糖得率的影響 圖3 為不同提取時間對螺旋藻多糖得率的影響曲線圖。從圖3 中可以發現，提取時間在1～3 h，隨著時間的推移，螺旋藻多糖的得率快速提高，反應時間短，多糖溶出不充分，因此時間越長，得率會越高，當時間達到3 h 時，多糖提取接近完全，此后增加時長，得率變化并不明顯。蛋白質變性和多糖水解同時在進行，延長提取時長，將導致多糖結構發生改變以及成本的增加[22]。因此，將提取時間2、3、4 h 作為后續響應面試驗3 水平。

圖3 提取時間對螺旋藻多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.1.4 NaOH 質量分數對螺旋藻多糖得率的影響圖4 為不同NaOH 質量分數對螺旋藻多糖得率的影響曲線圖。在堿性環境下，螺旋藻細胞壁容易被破壞，有利于加快細胞內多糖及細胞壁中多糖的溶出[23]。從圖4 可以看出，螺旋藻多糖的得率，隨著NaOH 質量分數升高，呈現出逐漸增加的趨勢。過高的堿液質量分數會阻礙得率的進一步提高，過高的pH 會使多糖發生水解，并且會使蛋白質發生變性包裹部分多糖成為沉淀[24]。因此當堿液的質量分數達到一定值以后，增速緩慢，可能和蛋白變性，包裹多糖沉淀有關。因此，選擇NaOH 質量分數1%、1.25%、1.5%作為后續響應面試驗3 水平。

圖4 NaOH 質量分數對螺旋藻多糖得率的影響Fig.4 Effect of NaOH concentration on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.2 響應面試驗分析

2.2.1 響應面分析試驗設計與結果 根據單因素實驗結果，將NaOH 質量分數（A）、提取溫度（B）、提取時間 （C） 3 個因素設為自變量，螺旋藻多糖得率設為因變量，用Box-Behnken 設計法進行3 因素3 水平的響應面優化試驗，試驗設計與結果見表3。

表3 響應面分析試驗設計及結果Table 3 Response surface analysis test design and results

2.2.2 模型的建立及顯著性分析 利用Design Expert 13 軟件對表3 中的數據進行多元回歸擬合、方差分析和顯著性檢驗，得到以響應值多糖得率Y 對各條件的編碼值的二次多項式回歸方程為：

Y=5.8+0.13A+0.67B+0.14C-0.098AB-0.013AC-0.0025BC-0.56A2-0.52B2-0.48C2

由表4 所示，該模型的F值是149.74，P值小于0.0001，表示該模型極顯著。失擬項的P值是0.2077＞0.05，不顯著；該回歸方程的總決定系數R2=0.9948，調整決定系數R2=0.9882，說明建立的回歸方程擬合的可行度高，能夠很好地對螺旋藻多糖得率進行預測[25]。A、B、C、交互項BC 及三個平方項（A2、B2、C2）對螺旋藻多糖得率的影響達到了極顯著的效果（P＜0.01），而交互項AB 項對螺旋藻多糖得率的影響有顯著效果（P＜0.05），其他項不顯著。

表4 響應面設計試驗方差分析及回歸系數顯著性檢驗Table 4 Analysis of variance and significance test of regression coefficient in response surface design test

由方差分析結果可以比較出各因素對螺旋藻多糖得率影響力的大小關系：提取溫度＞提取時間＞NaOH 質量分數。由圖5 可知，控制提取溫度不變時，隨著堿液NaOH 質量分數的增加，螺旋藻多糖的得率曲線呈現先迅速增加，后逐漸趨于平緩，在高濃度NaOH 的條件下，得率出現下降的趨勢。因為藻細胞在堿性環境下，細胞壁容易發生破裂，細胞內以及細胞壁中的水溶性多糖進而溶解進提取液中，同時螺旋藻酸性多糖更容易溶出，但是，多糖水解也同時在進行，高堿液溶液多糖還會出現脫酯和β-消去反應[26]。圖6 顯示了NaOH 質量分數和提取時間對螺旋藻多糖得率的影響，圖中響應面描繪了不同NaOH質量分數和提取時間下螺旋藻多糖得率的變化趨勢。圖7 展示了提取溫度和提取時間對螺旋藻多糖得率的影響，圖中的響應面展示了不同提取溫度和提取時間下螺旋藻多糖得率的變化情況，提取溫度和提取時間二者交互作用達到極顯著水平。通過該模型的預測，螺旋藻多糖提取工藝最佳參數：NaOH 質量分數1.46%、提取溫度為90 ℃與提取時間3.79 h，多糖得率5.25%。

圖6 NaOH 質量分數與提取時間對螺旋藻多糖得率的影響Fig.6 Effect of NaOH concentration and extraction time on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

圖7 提取溫度與提取時間對螺旋藻多糖得率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature and time on the yield of polysaccharides from Spirulina platensis

2.2.3 驗證實驗 根據以上所做的單因素實驗和多因素試驗的響應面分析得到螺旋藻多糖熱堿液提取的最優提取工藝條件，即NaOH 質量分數1.5%、提取溫度為90 ℃、提取時間4 h 及料液比1:20 g/mL進行實驗，平行3 組實驗，得到螺旋藻多糖得率為5.18%±0.23%，與模型預測基本一致，說明該模型能夠較好地預測多糖得率。

2.3 過氧化氫法螺旋藻多糖脫色單因素實驗結果

2.3.1 過氧化氫添加量對脫色率的影響 根據圖8分析發現，隨著過氧化氫溶液添加量的增加，粗多糖溶液中色素的脫色率曲線呈現先快后慢的增加趨勢；過氧化氫與色素分子發生反應，因此隨著過氧化氫添加量的增加，色素分子與過氧化氫反應更充分，直至色素分子被氧化完全[27]。在過氧化氫添加量為25%時，色素分子已基本被氧化，且其脫色率相對于20%時變化不顯著。鑒于多糖水解、降解、成本等問題，故選擇10%、15%和20%這3 個水平進行后續響應面試驗。

圖8 過氧化氫溶液添加量對脫色率的影響Fig.8 Effect of addition amount of hydrogen peroxide solution on decolorization rate

2.3.2 脫色時間對脫色率的影響 根據圖9 分析發現，當脫色時間在20～40 min 時間段內，隨著時間的增加，螺旋藻多糖的脫色率增速相對于后段較快；脫色時間進行到40 min 后，螺旋藻多糖的脫色率增速較慢，且80 min 和100 min 時二者的脫色率差異并不顯著。推測多糖色素分子不斷地與過氧化氫發生反應，達到一定時間后，色素分子已經充分反應，進而脫色率增加也相對緩慢[28]，因此，選擇40、60 和80 min 這3 個水平進行響應面優化試驗。

圖9 脫色時間對脫色率的影響Fig.9 Effect of decolorization time on decolorization rate

2.3.3 脫色溫度對脫色率的影響 根據圖10 分析發現，隨著脫色溫度的逐漸升高，過氧化氫法脫除螺旋藻多糖溶液中色素曲線增長幅度較大，超過50 ℃后，脫色率增長幅度逐漸減小，并且過氧化氫在60 ℃與70 ℃時的多糖脫色率無顯著差異。這是由于溫度過高時，過氧化氫分解過快[29]，失去氧化能力。因此，從能源損耗和多糖損失方面考慮，選擇40、50和60 ℃這3 個水平進行響應面優化試驗。

圖10 脫色溫度對脫色率的影響Fig.10 Effect of decolorization temperature on decolorization rate

2.4 響應面優化脫色工藝結果

按照表2 的設計因素，運用Design-Expert 設計軟件，對脫色工藝展開了試驗設計，進行了測試，并獲得了以下的試驗結果，響應面試驗的結果如表5 所示，方差分析如表6 所示。

表5 響應面分析試驗設計及結果Table 5 Response surface analysis test design and results

表6 響應面設計試驗方差分析及回歸系數顯著性檢驗Table 6 Analysis of variance and significance test of regression coefficient in response surface design test

利用Design-Expert 軟件對表5 數據進行多元回歸擬合，得到螺旋藻多糖脫色率（Y）對脫色時間（A）、脫色溫度（B）和過氧化氫添加量（C）的二次多項式回歸模型：

Y=84.99-0.1250A+0.0413B+0.03562C+0.1750AB-0.3050AC+0.1575BC-0.3478A2-0.8153B2-1.16C2

根據表6 可知該模型的F值是15.68，P值小于0.0001，表示該模型極顯著，失擬項的P值為0.0873＞0.05，差異不顯著，R2=0.9528，表明該模型選擇合理，可以對螺旋藻多糖脫色率進行預測。其中，一次項過氧化氫添加量對響應值的影響極顯著（P=0.0097＜0.01），由F值可以分析得到單因素的影響大小，從高到低是：過氧化氫添加量＞脫色時間＞脫色溫度；二次項A2對響應值的影響達到顯著水平（P＜0.05），B2、C2對響應值的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。

2.4.1 響應曲面分析 響應面圖曲面的傾斜度隨著兩因素之間交互作用的變化而變化[30]，交互作用越強，則其傾斜度越大[31]。由圖11 可知：保持脫色溫度不變化的情況下，當時間增加時，螺旋藻多糖的脫色率曲線呈現逐漸增加而后逐漸下降；控制脫色時間不變時，溫度逐漸增加，螺旋藻多糖的脫色率曲線呈現先增后減的趨勢。由圖12 可知：控制過氧化氫的添加量保持不變時，隨著時間的增加，螺旋藻多糖的脫色率曲線呈現先增后減的趨勢。

圖11 脫色時間和脫色溫度對螺旋藻多糖脫色率的影響Fig.11 Effect of decolorization time and decolorization temperature on decolorization rate of polysaccharides from Spirulina platensis

圖12 脫色時間和過氧化氫添加量對螺旋藻多糖脫色率的影響Fig.12 Effect of decolorization time and hydrogen peroxide addition on decolorization rate of polysaccharides from Spirulina platensis

由圖13 可知：控制過氧化氫添加量不發生變化時，螺旋藻多糖脫色率曲線隨著脫色溫度的升高，呈現先增后減的趨勢，溫度達到一定值后，脫色率開始顯著下降；當脫色溫度一定時，隨著過氧化氫添加量的增加，螺旋藻多糖脫色率逐漸增加，過氧化氫添加量達到一定值后，脫色率開始緩慢下降。

圖13 脫色溫度和過氧化氫添加量對螺旋藻多糖脫色率的影響Fig.13 Effect of decolorization temperature and hydrogen peroxide addition on decolorization rate of polysaccharides from Spirulina platensis

采用響應面試驗優化過氧化氫法，預測得到最佳脫色工藝：過氧化氫溶液的添加量為16.88%、脫色時間為54.82 min、脫色溫度為50.31 ℃，色素脫除率是83.04%。進一步驗證所預測結果的準確性，將上述參數修改為：過氧化氫溶液添加量為17%，脫色時間為55 min，脫色溫度為50 ℃，得到的實際脫色率為82.54%±0.03%，多糖保留率83.45%±0.13%。實驗結果實際脫色率與模型預測相符，因此，基于響應面法所得的優化脫色工藝參數準確可靠。

螺旋藻由于其含多糖比例低，得率不高，嚴重限制了其制備及應用，因此提高其得率，除雜除色素十分必要[32]。目前，多糖的提取及脫色的方法有很多種，每一種方法都有著不同的特點。劉玉環等[33]采用內部沸騰法優化螺旋藻多糖的提取工藝，得到最佳提取條件為：40%乙醇、料液比1:14、溫度80 ℃、提取時間5 min，多糖得率是8.92%。Chaiklahan等[34]通過響應面法優化熱水浸提螺旋多糖的條件，最優條件是：料液比1:45、溫度90 ℃、時間120 min，在此條件下，螺旋藻多糖的得率為8.3%。本研究采用的熱堿液法，對酸性的螺旋藻多糖提取更充分，提取液不含有機溶劑，且用量少，大大降低了提取成本。杜玲等[35]比較了DEAE-纖維素法和活性炭法脫除螺旋藻多糖色素的效果，發現活性炭法脫除色素效果更好，確定了脫色溫度40 ℃、活性炭添加量1.5%、脫色時間50 min 是最佳脫色條件，多糖脫色率為64.58%，多糖保留率為64.09%；但是，本研究采用的過氧化氫法與其結果相比，具有更高的多糖脫色率和保留率，具有更高的脫色效率。秦宇等[36]使用過氧化氫法脫除日本蛇菰多糖色素，并采用響應面法優化其脫色條件，在pH 為8 的條件下雙氧水脫色最佳工藝為：雙氧水用量為20%、脫色時間為46 min、脫色溫度為60 ℃，在此條件下蛇菰多糖的脫色率為84.21%，其結果與本文相似，可以發現過氧化氫法在脫除色素的過程中，可以高效地去除色素，并且實驗條件簡單，易于操作。

3 結論

本文采用熱堿液法提取螺旋藻多糖，通過單因素實驗和響應面分析，分析發現影響螺旋藻多糖提取的因素，按影響大小依次為提取溫度＞提取時間＞NaOH 質量分數，同時得到最佳提取條件是NaOH質量分數1.5%、提取溫度為90 ℃、提取時間4 h 及料液比1:20 g/mL，平行3 組實驗，得到螺旋藻多糖得率為5.18%±0.23%，相對于傳統的提取方法，熱堿液浸提法可以將酸性多糖提取充分，縮短提取時間，減少提取成本。在優化螺旋藻多糖的過氧化氫法脫色工藝中發現，所考察的3 個因素中，其影響效果從高到低為過氧化氫添加量＞脫色時間＞脫色溫度，最優工藝參數：過氧化氫溶液添加量為17%，脫色時間為55 min，脫色溫度為50 ℃，得到的實際脫色率為82.54%±0.03%，多糖保留率為83.45%±0.13%。與常用的脫色方法大孔樹脂法、活性碳法及Sevage 法相比，過氧化氫法脫色具有脫色率高，時間短、效率高等特點[37]，但過量的過氧化氫也會和多糖發生氧化反應，因此需要嚴格控制過氧化氫用量。本次研究所得結論為后續螺旋藻多糖分離純化以及生物活性的研究，奠定一定基礎。

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