響應面法優化魔芋葡甘聚糖的純化工藝

包芮寧，吳衛國，廖盧艷，王 燕

（湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙 410128）

魔芋是一種多年生草本植物，主要生長在位于亞洲東南部亞熱帶的山區或丘陵地帶[1]，在我國廣泛種植于陜西、甘肅以及云、貴、川等地，是我國重要的經濟作物[2-3]。魔芋中含有不溶性淀粉、纖維素、蛋白質以及脂類[4]，其主要食用部位是球狀塊莖。魔芋葡甘聚糖（Konjac Glucommannan，KGM）作為球狀塊莖中占比最多的成分，含量可達到50%以上[5-6]，KGM 含量也常用作評價魔芋粉質量優劣的關鍵指標[7]。

KGM 由葡萄糖和甘露糖結合構成[8-9]，可作為天然的食品防腐劑用于防止食品變質以及蟲害[10]，也能夠預防多種慢性疾病，包括降低血糖、膽固醇、甘油三酯和血壓水平[11]等，還能通過調節新陳代謝、改善胃腸道環境、增加有益菌、增強飽腹感以達到減肥的目的[12-13]，現已被應用于臨床醫藥等領域[14-15]。此外KGM 還具有水溶性好、膠凝性極佳、生物可降解性強等諸多優良特性[16-17]，許多文獻也報道過其在食品包裝膜方面的進展[18-20]，已被引入許多國家用作食品添加劑和膳食補充劑，在食品、醫藥、化工[21-24]等領域均具有很好的應用價值，因此提高KGM 含量的研究對研發和應用具有重要意義。

目前KGM 的純化方法大致包括乙醇沉淀法、生物酶法、Pb（AC）2法等，但存在引入重金屬離子、KGM 得率較低、操作復雜且效率低下等問題，限制其應用于食品產業加工[25-26]。由于KGM 具有易溶于水而不溶于有機溶劑的特點[27]，本研究采用超聲波輔助乙醇沉淀法進行純化[28]，運用響應面試驗設計出魔芋粉中KGM 的最優純化條件，測定得率，并通過傅立葉紅外光譜儀（FT-IR）和X 射線衍射儀（XRD）對其優化前后的結構進行表征，以期為KGM 的進一步開發和利用提供理論基礎和思路借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魔芋粉 湖南省好味屋食品有限公司；硫酸、氫氧化鈉、無水乙醇、溴化鉀 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖標準溶液 中國氪道試劑公司；DNS 顯色液 中國飛凈生物科技有限公司。

1510-02624 全波長高速酶標儀 賽默飛世爾科技中國有限公司；101-2AB 型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；S-LC 電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫療儀器有限公司；BS224S 電子天平

賽多利斯科學儀器北京有限公司；KH-250DE 型數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；LD5-2A 離心機 北京雷勃爾離心機有限公司；IRAffinity-1 傅立葉紅外光譜儀、XRD-6000 型X 射線衍射儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的制作 分別移取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 的1 mg/mL 葡萄糖標準溶液于6 個25 mL 具塞試管中并用蒸餾水補至2 mL，加入1.5 mL DNS，100 ℃水解5 min，冷卻后定容。移取樣液于酶標板，在540 nm 處測其吸光值，繪制標準曲線。標準曲線方程為Y=0.3589X+0.0006（R2=0.9945），可見葡萄糖含量在0～1.0 mg/mL 范圍內有良好的線性關系。

1.2.2 魔芋粉中KGM 含量的測定 魔芋粉的純化[26]：稱取1 g 魔芋粉加入乙醇溶液，攪拌均勻后在一定的超聲溫度、功率和時間下進行純化，過濾后稱取0.1900～0.2000 g 濾渣加入蒸餾水，溶脹3 h 后于離心機轉速4000 r/min 下離心20 min，上清液即為提取液。

KGM 含量的測定參照NY/T 494-2010 魔芋粉標準附錄A[29]。根據公式（1）計算其含量。

魔芋粉中KGM含量(以干基計,%)=

式中：ε為KGM 水解前后葡萄糖和甘露糖殘基的分子量之比，ε=0.9；T 為KGM 水解液的葡萄糖含量，單位為毫克（mg）；T0為KGM 提取液的葡萄糖含量，單位為毫克（mg）；m 為魔芋粉樣品質量，單位為克（g）；w 為樣品含水量，%。1.2.3 魔芋粉中KGM 得率的測定 根據公式（2）計算KGM 得率[30]。

式中：KGM 質量與魔芋粉質量，單位均為毫克（mg）。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 料液比對KGM 含量的影響 準確稱量魔芋粉每份1.0 g，將乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間以及超聲功率分別設定為80%、50 ℃、45 min、200 W，料液比分別調為1:40、1:60、1:80、1:100、1:120（g/mL），在該條件下進行實驗，考察料液比對其含量的影響。

1.2.4.2 乙醇濃度對KGM 含量的影響 準確稱量魔芋粉每份1.0 g，將料液比、超聲溫度、超聲時間以及超聲功率分別設定為1:100（g/mL）、50 ℃、45 min、200 W，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，在該條件下進行實驗，考察乙醇濃度對其含量的影響。

1.2.4.3 超聲溫度對KGM 含量的影響 準確稱量魔芋粉每份1.0 g，將乙醇濃度、料液比、超聲時間以及超聲功率分別設定為70%、1:100（g/mL）、45 min、200 W，超聲溫度在30、40、50、60、70 ℃下進行實驗，考察超聲溫度對其含量的影響。

1.2.4.4 超聲功率對KGM 含量的影響 準確稱量魔芋粉每份1.0 g，將乙醇濃度、料液比、超聲溫度以及超聲時間分別設定為70%、1:100（g/mL）、50 ℃、45 min，超聲功率分別為125、150、175、200、225 W，在該條件下進行實驗，考察超聲功率對其含量的影響。

1.2.4.5 超聲時間對KGM 含量的影響 準確稱量魔芋粉每份1.0 g，將乙醇濃度、料液比、超聲溫度以及超聲功率分別設定為70%、1:100（g/mL）、50 ℃、175 W，超聲時間分別為15、30、45、60、75 min，在該條件下進行實驗，考察超聲功率對其含量的影響。

1.2.5 響應面試驗設計 基于單因素實驗結果，排除對含量影響不顯著（P＞0.05）的因素，選擇料液比、乙醇濃度和超聲時間的相關水平進行Box-Behnken 試驗設計以確定最優條件，具體試驗水平參照表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factor level design of response surface test

1.3 結構表征

1.3.1 FT-IR 測定 將樣品與溴化鉀烘干，按質量比1:50 混合研磨，壓片后放入紅外光譜儀，在波數范圍4000～500 cm-1，分辨率4 cm-1下測定[31]。

1.3.2 XRD 測定 將樣品置于載玻片壓片，放入X 射線衍射儀測試。測試條件：室溫，管壓40 kV，電流40 mA，2θ掃描范圍4°～40°，速率2°/min 條件下進行[32]。

1.4 數據處理

每組實驗進行三次平行，結果用平均值表示。運用IBS SPSS Statistics 26 進行單因素顯著性分析，Origin2022 軟件進行圖形繪制，Design-Expert 13.0進行響應面試驗結果分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 料液比對KGM 含量的影響 如圖1 所示，料液比較少時，魔芋粉中大分子物質難以解聚溶出，KGM 的含量因此較低[33]。隨著料液比的增大，乙醇量相對增多，KGM 含量逐漸升高。當料液比為1:100（g/mL）時，KGM 含量達到最大值77.88%后逐漸下降。因為其在乙醇量相對較多的情況下發生過度溶脹，包埋大量水分[34]，過多水溶劑的存在導致部分KGM 溶解于水中，含量在此情況下開始下降。通過統計學分析，料液比對KGM 含量的影響有顯著差異（P＜0.05），其中料液比為1:100（g/mL）時極顯著，選取料液比1:80、1:100、1:120（g/mL）進行響應面試驗。

圖1 料液比對KGM 含量的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the content of KGM

2.1.2 乙醇濃度對KGM 含量的影響 如圖2 所示，魔芋粉加入乙醇溶液后，其中的KGM、蛋白質、淀粉等物質溶于水，在乙醇濃度較低的條件下，KGM所受到的沉淀作用較小，而且其中一部分可能會溶解到水溶劑中流失，導致含量較低[30]。而隨著乙醇濃度增長至70%時，KGM 含量達到了最大值為83.41%。乙醇濃度繼續增大，抑制KGM 分子的伸展，不能有效地將其包裹、結合的雜質釋放，導致含量降低[35]。通過統計學分析，乙醇濃度對KGM 含量的影響有顯著差異（P＜0.05），其中乙醇濃度70%時極顯著，選取乙醇濃度60%、70%、80%進行響應面試驗。

圖2 乙醇濃度對KGM 含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the content of KGM

2.1.3 超聲溫度對KGM 含量的影響 圖3 所示，當超聲溫度為50 ℃時，含量達到最大值81.24%。這是由于溫度較低時，魔芋粉中大分子物質結合較為緊密，升溫使得分子從魔芋粉中擴散的速率提高[33]，超聲溫度繼續升高，可能會導致KGM 分子結構遭到破壞，含量有所下降。通過統計學分析，超聲溫度對KGM 含量的影響沒有顯著差異（P＞0.05）。因此，后續實驗中超聲溫度固定為50 ℃。

圖3 超聲溫度對KGM 含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the content of KGM

2.1.4 超聲功率對KGM 含量的影響 如圖4 所示，功率過小影響了超聲波對魔芋粉的破壞作用，未能完全打開分子鏈，使雜質不能有效溶出，因此KGM 含量較低。隨著超聲功率達175 W，含量達到了最大值82.26%。隨著功率繼續增大，在空化作用下多糖分子結構遭到破壞，細胞壁破碎加劇，導致KGM 含量逐漸減少[5,31]。通過統計學分析，超聲功率對KGM 含量的影響沒有顯著差異（P＞0.05）。因此，后續實驗中超聲功率固定為175 W。

圖4 超聲功率對KGM 含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the content of KGM

2.1.5 超聲時間對KGM 含量的影響 由圖5 可知，隨超聲時間達到60 min，KGM 含量逐漸升高至88.75%，隨后下降。因為在超聲時間較短的條件下，KGM 與其他分子物質結合緊密，分子鏈未能完全打開，雜質也未能完全釋放。而長時間的超聲作用又使KGM 的結構不穩定，空化作用導致分子鏈遭到破壞[5,31]，KGM 含量因此下降。通過統計學分析，超聲時間對KGM 含量的影響有顯著差異（P＜0.05），其中超聲時間為60 min 時極顯著，選取超聲時間45、60、75 min 進行響應面試驗。

圖5 超聲時間對KGM 含量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the content of KGM

2.2 響應面試驗結果分析

參考Box-Behnken 原理，優化試驗設計結果如表2 所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

根據表2 中的數據對試驗結果回歸擬合，得到模型對應的回歸方程為：Y=88.22-1.8A+6.41B-2.21C-0.22AB+1.98AC-0.48BC-13.19A2-13.59B2-6.77C2，對二次回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

由表3 結果分析可知，失擬項不顯著（P=0.2003），且本試驗所采用的回歸模型是極顯著水平（P＜0.01），因此該模型可取。R2adj=0.9872，意味著該模型可信度較高。一次項B 差異極顯著（P＜0.01），A、C 差異顯著（P＜0.05），二次項A2，B2，C2對含量的影響極顯著（P＜0.01）；各試驗條件下三個因素影響KGM 含量的程度大小為：乙醇濃度＞超聲時間＞料液比。

根據回歸方程，做出響應面交互效應圖，如圖6～圖8 所示。

圖6 料液比、乙醇濃度交互項對KGM 含量的影響Fig.6 Influence of material-liquid ratio and ethanol concentration interaction on the content of KGM

圖6 響應面圖可以看出，乙醇濃度比料液比的坡度稍陡峭，結合等高線圖，乙醇濃度軸向的等高線較密集，表明與料液比相比，乙醇濃度的影響稍顯著。較橢圓形的等高線圖和陡峭的響應面圖，說明了料液比和乙醇濃度具有交互效應。在不改變超聲時間、超聲溫度和超聲功率的條件下，隨料液比的增加和乙醇濃度的升高，KGM 含量會先升高達到峰值后再減小。

圖7 響應面圖可以看出，超聲時間比料液比的坡度更為陡峭，結合等高線圖，超聲時間軸向的等高線更加密集，表明超聲時間對KGM 含量的影響更為顯著。橢圓形的等高線圖和陡峭的響應面圖，說明了料液比和超聲時間的交互作用較強。在不改變乙醇濃度、超聲溫度和超聲功率的條件下，隨料液比的增加和超聲時間的延長，KGM 含量會先升高達到峰值后再減小。

圖7 料液比、超聲時間交互項對KGM 含量的影響Fig.7 Influence of material-liquid ratio and ultrasonic time interaction on the content of KGM

圖8 所示響應面圖可以看出，乙醇濃度比超聲時間更陡峭，結合等高線圖，乙醇濃度軸向的等高線更密集，表明與超聲時間相比，乙醇濃度對KGM 含量的影響更顯著。橢圓形的等高線圖和陡峭的響應面圖，說明了乙醇濃度和超聲時間交互效應較強。在不改變其他條件的基礎上，超聲時間的延長和乙醇濃度的升高會使KGM 含量先升高達到峰值后再減小。

圖8 乙醇濃度、超聲時間交互項對KGM 含量的影響Fig.8 Influence of ethanol concentration and ultrasonic time interaction on the content of KGM

利用Design-Expert 軟件得出，魔芋粉最佳純化條件是料液比1:101.538（g/mL），乙醇濃度72.777%，超聲時間為54.808 min，KGM 含量可達88.672%。根據實際操作進行修整，料液比、乙醇濃度、超聲時間分別為1:102（g/mL）、73%和55 min，通過三次驗證實驗得到KGM 含量為88.1%±1.05%，與預測值較為接近，說明優化模型是合理可行的。

經公式（1）計算純化前KGM 含量為59.70%±0.97%，純化后含量為88.1%±1.05%；經公式（2）計算純化前KGM 得率為52.24%±1.29%，純化后得率為62.93%±1.73%。因此，工藝優化后KGM 含量與得率均顯著提高。

2.3 結構表征

2.3.1 FT-IR 圖譜分析 為了解純化前后官能團的變化情況，采用傅里葉紅外光譜儀對其結構進行探測[36]，如圖9 紅外圖譜所示，吸收峰的形狀以及出現位置大致相同，未出現新的吸收峰，這與所報道的結果一致[37]。KGM 中-OH 的伸縮振動峰出現在3000～3700 cm-1之間，這是多糖的特征峰[38]。在2800～3000 cm-1范圍內的峰由-CH3和-CH2基團中的-CH 鍵拉伸所產生。在1647 cm-1處的吸收帶代表分子內氫鍵的特征峰。

圖9 純化前后KGM 的傅里葉紅外光譜圖Fig.9 FT-IR spectrum of KGM before and after purification

2.3.2 XRD 圖譜分析 如圖10 所示，純化前后KGM的XRD 圖譜在2θ處于4°～40°間均未表現出明顯的結晶峰，在2θ處于20°左右時均出現一個較寬的彌散峰，與報道所述一致[39]。此外，沒有觀察到新的特征峰的出現，說明純化工藝對KGM 結構、結晶度以及氫鍵作用力的影響微弱[39]。

圖10 純化前后KGM 的X 射線衍射圖Fig.10 X-ray diffraction pattern of KGM before and after purification

3 結論

本研究通過單因素和響應面試驗確定魔芋粉最佳純化工藝條件：超聲時間、乙醇濃度、料液比、超聲溫度和超聲功率分別為55 min、73%、1:102（g/mL）、50 ℃、175 W，該條件下KGM 含量與模型預測值相差較小，達到88.1%±1.05%。經計算該工藝條件下KGM 得率為62.93%。隨后對其優化前后的結構進行表征，對比兩者的FT-IR 圖譜和XRD 圖譜，未發現明顯差異，證明該優化工藝對KGM 結構影響較弱。因此在不改變KGM 結構的前提下，應用該工藝可以更加低廉、高效、無損地對魔芋粉進行純化，得到純度更高的KGM，為其應用于食品藥品等行業加工生產提供基礎理論和研究方向。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).