GC-MS 結合化學計量學方法分析桂花凈油分子蒸餾餾分的揮發性成分

郭智鑫，郝丹丹，卞建明，謝秋濤，孫亞麗，汪 凱，李高陽，朱向榮,*

（1.湖南大學生物學院隆平分院，湖南長沙 410125；2.湖南省農業科學院農產品加工研究所，湖南長沙 410125；3.紅牛維他命飲料（湖北）有限公司，湖北咸寧 437000）

桂花（Osmanthus fragransLour.）是我國傳統名花之一，屬木犀科木犀屬植物[1]，主要包括4 個品種：金桂、銀桂、丹桂和四季桂[2]。桂花凈油是桂花經過提取獲得具有獨特香味的浸膏后，再使用乙醇對桂花浸膏脫除蠟質后得到的產品[3]。桂花凈油具有改善睡眠、鎮咳祛痰和提高免疫力等功效[2]，是一種不能人工合成的高級天然香料[4-5]。桂花凈油具有天然綠色、環保安全和可藥食兩用的特點，其需求量與應用范圍不斷增加[6]，被廣泛用于食品和醫藥等領域[7-8]。

現階段桂花浸膏提取主要采用溶劑提取法[9-10]、超臨界CO2萃取法[11]和亞臨界流體萃取[12-13]等方法。溶劑提取法提取率較高，但提取純度較低，溶劑殘留難以除去[9-10]；超臨界CO2萃取技術所獲取凈油的蠟質含量較高[11]。亞臨界萃取具有可較好地保留桂花中的天然組分，具有提取率與純度較高的特點[12-13]。提取得到的桂花浸膏含有大量蠟質，因此需要對其進行分離純化得到桂花凈油。

分子蒸餾技術是一種在高真空條件下進行高效液-液分離純化技術，該技術主要根據不同物質分子運動平均自由程的不同，從而對物質進行分離純化[14-15]。對于桂花凈油的分離純化，分子蒸餾技術具有操作條件簡單，適用于桂花凈油這類熱敏性強、易氧化物質的分離提取，其具有分離效率高等優點，在分離過程可有效降低雜質，保障提取物質不受污染，保持其原有品質[15]。目前分子蒸餾技術具有廣闊的發展前景，已被廣泛應用于香精香料提取[16-17]、油脂精煉[18]等領域。但采用分子蒸餾技術分離純化桂花凈油進行揮發性成分的相關研究鮮有報道。

因此，本文首先采用亞臨界技術提取干桂花得到桂花浸膏，再采用分子蒸餾技術對脫蠟后的桂花凈油進行分離純化，并對各餾分物質進行氣相色譜-質譜（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，最后采用化學計量學方法建立桂花凈油各餾分揮發性成分的判別模型與相對氣味活度值（Relative odor activity value，ROAV）建立香氣輪廓，評價各餾分差異性揮發性成分與香氣特征。本研究將為分子蒸餾技術純化桂花凈油的餾分鑒別及綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

咸寧金桂桂花 于2022 年10 月于湖北省咸寧市桂花種植基地采摘，共計100 kg，采后立即進行分選，剔除雜質后，在-4 ℃冷庫進行預冷處理，冷鏈運輸至實驗室進行真空冷凍干燥處理后，20 目粉碎，裝入PE 密封袋，置于干燥皿保存備用；正丁烷、石油醚、無水乙醇、無水硫酸鈉 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；正己烷 色譜級，德國默克Merck 公司。

LGJ-25C 型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；HBS-2500C 高速粉碎機 東莞市華太電器有限公司；FC204 電子天平 上海精密科學儀器有限公司；MS-QP2010Plus 氣相質譜聯用儀 日本島津公司；CBE-5L21-14 亞臨界提取設備 河南省亞臨界生物技術公司；FMD-100 刮膜式玻璃分子蒸餾器 江蘇杜馬司科學儀器有限公司；Avanti J26XP型冷凍離心機 美國 Beckman 公司；SN-MS-H280D磁力攪拌器 上海尚普儀器設備有限公司；SNR1005 旋轉蒸發儀 上海尚普儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 桂花凈油提取及純化 準確稱取1 kg 干桂花，粉碎過20 目篩后裝入絹布袋，置于亞臨界萃取設備萃取罐中，采用正丁烷進行提取，料液比1:25 g/mL，提取溫度45 ℃，單次提取時間為30 min，萃取三次，減壓蒸餾后得到萃取物；根據國標GB/T 14458-2013《香花浸膏檢驗方法》方法對桂花浸膏進行脫蠟處理后，在條件為-20 ℃，12000 r/min 下進行冷凍離心分離蠟質后，得到桂花凈油。采用分子蒸餾技術進行分離純化，桂花凈油樣品置于主蒸發器中，刮膜式分子蒸餾器的參數條件調節至：蒸餾溫度170 ℃，冷凝溫度60 ℃，真空度17 Pa，刮膜轉速300 r/min，待樣品蒸餾完畢后，輕組分與重組分分別進入收集瓶中，殘留組分由外置冷凝器與冷阱捕捉回收，最終得到桂花凈油各餾出物。

1.2.2 桂花凈油各餾分揮發性成分的GC-MS 測定

取上述桂花凈油各餾分樣品10 g，用正己烷稀釋并定容至10 mL，取1.5 mL 的稀釋液進行GC-MS分析。色譜條件：色譜柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣量1.0 μL；進樣時間：2 min；載氣He，柱流量1.05 mL/min，總流量9.3 mL/min；進樣模式：不分流；進樣溫度250 ℃；柱箱溫度：50 ℃；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min 速率升溫至100 ℃，保持2 min；然后以5 ℃/min 速率升溫至230 ℃，保持20 min；再以5 ℃/min 速率升溫至300 ℃，保持20 min。

質譜條件：EI 離子源；離子源溫度：300 ℃；電子能量70 eV；發射電流：34.6 μA；掃描質量范圍m/z 45～450。

定量定性分析：移取C7～C40正構烷烴混合標準品，用正己烷溶劑將其稀釋為質量分數為1%的標準溶液，以液體進樣的形式，按照上述方法條件進樣分離，記錄各成分保留時間。保留指數RI 值（Retention index）根據 Kovats 公式進行計算，如式（1）所示：

式中：RI 為測量成分的保留指數； R Tx為待測揮發物的保留時間（min）；n 和n+1 分別為正構烷烴的碳原子數；R Tn＜ R Tx＜ R Tn+1。

樣品經過GC-MS 分析得到的質譜數據與NIST 14 標準譜庫相匹配，計算各揮發性成分的保留指數并參考相關文獻定性確定化合物，僅保留匹配度大于80%的成分，對其成分進行定性分析；采用各揮發性化合物峰面積占總峰面積比值表示相對含量計算各成分的相對百分含有量。

1.2.3 桂花凈油各餾分揮發性成分的相對氣味活度值計算 根據陳卓[19]與王赟等[20]的方法略作修改，采用ROAV 對GC-MS 所獲取得到化合物的相對含量數據進行分析，計算公式如下：

式中：Ci為GC-MS 數據通過峰面積歸一化法計算獲得化合物的相對含量（%）；Ti為化合物i 的在水中的香氣閾值（mg/kg）；Tmax為樣品中對香氣貢獻最大成分的香氣閾值（mg/kg）；Cmax為對樣品風味貢獻最大成分的相對含量（%）；當ROAV＞1 時，說明該香氣成分為此樣品的關鍵香氣貢獻成分。

1.3 數據處理

實驗重復3 次，GC-MS 分析得到的質譜數據與NIST 14 標準譜庫相匹配，最終以各揮發性化合物峰面積占總峰面積比值表示相對含量。數據使用Excel 2010 軟件進行統計；GC-MS 數據均以（平均值±標準差）表示；使用SPSS 16.0 軟件對GC-MS 數據獲取的揮發性成分數據進行方差分析和Duncan 法多重比較，P＜0.05 表示顯著；使用Orgrin 2023b軟件繪制韋恩圖、聚類熱圖與PCA 圖；采用SIMCA軟件繪制OPLS-DA 圖。

2 結果與分析

2.1 GC-MS 檢測結果分析

采用GC-MS 對桂花凈油分子蒸餾后得到三種餾分的揮發性成分進行檢測，以峰面積法計算其相對含量，如表1 所示，共檢測到8 大類揮發性成分73 種，其中醇類22 種、醛類5 種、酸類10 種、酚類3 種、酮類5 種、酯類17 種、烷烴類5 種、烯萜類6 種。

表1 桂花凈油各餾分的揮發性成分種類及相對含量Table 1 Types and relative contents of volatile components in different fractions of Osmanthus fragrans absolute

如圖1（a）所示，在經分子蒸餾得到的桂花凈油輕組分、重組分和殘留物組分中，分別鑒定出50、43 和24 種化合物，其中三種餾分共有成分有11 種，輕組分和重組分共有成分有30 種，輕組分和殘留物組分共有成分有13 種，重組分和殘留物組分共有成分有12 種。在桂花凈油分子蒸餾的輕組分、重組分和殘留物組分中檢測到18 種、12 種、10 種獨有成分。韋恩圖顯示了桂花凈油各餾分的揮發性成分種類具有顯著差異（P＜0.05）。

圖1 桂花凈油各餾分揮發性成分韋恩圖（a）及化合物類別分析（b）Fig.1 Venn diagram of volatile components (a) and compound classes analysis (b) of different fractions in Osmanthus fragrans absolute

如圖1（b）所示，在桂花凈油各餾分中，醇類物質種類與相對含量最高，是桂花凈油揮發性成分的主要貢獻物質。輕組分含有14 種醇類物質，相對含量為21.46%；重組分含有13 種醇類物質，相對含量為22.62%；殘留物組分含有5 種醇類物質，相對含量為30.75%，各餾分之間具有顯著差異（P＜0.05）。桂花中芳香活性化合物具有典型的甜桂花的花香和甜味[21-24]，包括芳樟醇、反式氧化芳樟醇、氧化芳樟醇、4-甲氧基苯乙醇、二氫-β-紫羅蘭醇。其中芳樟醇在輕組分中相對含量最高為3.98%，反式氧化芳樟醇在殘留物組分中相對含量最高為12.22%，氧化芳樟醇在殘留物組分中相對含量最高為6.76%，4-甲氧基苯乙醇在輕組分中相對含量最高為1.91%，二氫-β-紫羅蘭醇在輕組分中相對含量最高為2.84%。醛類物質的種類與相對含量較少，共鑒定出5 種醛類物質，除熊果醛為輕組分與重組分共有物質外，正十五醛為輕組分獨有成分，壬醛與正十六醛為重組分獨有成分，辛醛為殘留物組分獨有成分，醛類物質為桂花凈油揮發性香氣貢獻了草本植物的清香與甜果香味[25]。三種餾分的酸類物質相對含量具有顯著性差異（P＜0.05），輕組分相對含量最高為20.14%，其中α-亞麻酸，花生酸等為人體必需營養物質，具有一定保健功能。酮類和酚類物質在桂花凈油的三種餾分中種類與相對含量較少，其中β-紫羅蘭酮為輕組分與重組分共有成分，具有清新花香味[26]，輕組分中的相對含量最高為0.80%；二氫-β-紫羅蘭酮為三種餾分共有成分，具有清新花香味[27]，輕組分中的相對含量最高為3.31%；維生素E 和2,4-二叔丁基苯酚是輕組分與重組分的共有成分，甲基丁香酚是輕組分的獨有成分，具有丁香-茴香香氣。酯類物質是芳香族化合物的主要類型，決定了桂花的濃郁而獨特香味[28]。三種餾分共鑒出17 種酯類物質，輕組分12 種，重組分7 種，殘留物組分7 種；三種餾分的長鏈酯相對含量差異較小，輕組分為12.23%，重組分為15.45%，殘留物組分為17.21%。殘留物組分中磷酸三異丙基酯含量最高為6.61%，而肉豆蔻酸甲酯、二氫獼猴桃內酯等具有清新甜果香味與花香味的物質，三者并未共有，這可能是導致各餾分之間揮發性香氣差異的因素之一[29]。烷烴類物質的感官閾值較高，對桂花凈油各餾分的揮發性香氣貢獻較小，具有定香的作用[30]。烯萜類物質揮發性強，其相對含量與種類較多，石竹烯、β-月桂烯、α-蒎烯是桂花凈油各餾分揮發性香氣的主要成分[31]，且各餾分之間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 桂花凈油各餾分的揮發性成分OPLS-DA 模型分析

正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）是一種有監督的判別統計方法，可實現對數據進行歸一化降維處理，從達到對復雜實驗數據可視化及預測判別分析[32-33]。為了更好的對桂花凈油的餾分進行區分，通過對表1 中桂花凈油各餾分的GC-MS 數據進行OPLS-DA 模型分析，結果如圖2 所示。三種餾分揮發性成分在得分圖（見圖2（a））中實現了餾分種類區分，自變量擬合指數（R2x）為0.900，因變量擬合指數（R2y）為0.994，模型預測指數（Q2）為0.982，對于桂花凈油餾分區分的預測率為98.2%。其中輕組分均勻分布在第一象限，殘留物組分分布在第二、三象限，重組分均勻分布在第四象限，表明桂花凈油不同餾分的揮發性成分存在一定差異。

如圖2（b）所示，對桂花凈油各餾分的GC-MS數據建立OPLS-DA 模型，進行200 次響應的置換檢驗，以驗證建立的OPLS-DA 模型是否出現過擬合現象[34-35]。置換檢驗得到R2=0.639，Q2=-0.796，所有左側的Q2大于右側，Q2與Y 軸的截距為負值，且R2和Q2的回歸線的斜率均大于1，說明該模型未出現擬合現象，具有較好的穩定性和預測能力。

2.3 桂花凈油各餾分的差異揮發性成分篩選

變量投影重要性（Variable important in the projection，VIP）可用于篩選出對分子蒸餾后的桂花凈油揮發性成分中有重要貢獻的物質成分，VIP 值越大，說明對樣品組間區分的貢獻率越大，組間差異越顯著[34]。通過對表1 中桂花凈油各餾分的GC-MS 數據進行VIP 值的篩選，結果由圖3 可知，VIP 值大于1 的桂花凈油揮發性物質共27 種，分別為反式氧化芳樟醇、豆甾醇、α-亞麻酸、α-松油醇、γ-谷甾醇、磷酸三異丙基酯、9,12-十八烯酸丁酯、氧化芳樟醇、芳樟醇、亞麻酸乙酯、5,11,14,17-二十碳四烯酸甲酯、正十五烷、角鯊烯、三癸酸甘油酯、γ-癸內酯、硬脂酸苯酯、棕櫚酸、二氫-β-紫羅蘭醇、α-蒎烯、苯甲酸芐酯、1-二十七烷烯、生育酚、正十四烷、香葉醇、2-甲基-3-丁烯酸、石竹烯、硬脂酸。

為了進一步分析不同揮發性成分對區分桂花凈油各餾分的貢獻率，根據P＜0.05 且VIP＞1 的標準，對圖3 中篩選出的27 種不同餾分的特征揮發性物質GC-MS 數據進行聚類熱圖分析，如圖4 所示，其中醇類8 種、酸類4 種、酚類1 種、酯類8 種、烯萜類6 種。根據聚類熱圖中揮發性成分的顏色由綠色至紅色，代表其相對含量由高到低，篩選出輕組分含量較突出的11 種揮發性成分，包括α-亞麻酸、豆甾醇、棕櫚酸等；重組分較高含量的10 種揮發性成分，包括豆甾醇、γ-谷甾醇、棕櫚酸等；殘留物組分較高含量的9 種揮發性成分，包括反式氧化芳樟醇、氧化芳樟醇、α-松油醇等。

圖4 桂花凈油各餾分的差異揮發性成分聚類熱圖Fig.4 Complex heat map of differential volatile components of different fractions in Osmanthus fragrans absolute

2.4 桂花凈油各餾分揮發性成分的ROAV 分析與香氣輪廓分析

為了說明桂花凈油各餾分揮發性成分的香氣特征，本研究通過根據1.2.3 方法對桂花凈油各餾分揮發性成分進行ROAV 值的計算分析，結果如表2 所示，輕組分、重組分和殘留物組分的關鍵香氣貢獻成分（ROAV＞1）分別為14 種、9 種和11 種，在輕組分的揮發性成分中氧化芳樟醇、芳樟醇、香葉醇、二氫-β-紫羅蘭醇、正十五醛、熊果醛、甲基丁香酚、β-紫羅蘭酮、二氫-β-紫羅蘭酮、γ-癸內酯、二氫獼猴桃內酯、肉豆蔻酸甲酯、石竹烯、α-蒎烯，是其關鍵香氣貢獻成分（ROAV＞1），為樣品貢獻了花香味、果香味、草香味、甜味與松木香味；在重組分的揮發性成分中氧化芳樟醇、香葉醇、香葉基香葉醇、熊果醛、壬醛、正十六醛、β-紫羅蘭酮、二氫-β-紫羅蘭酮、γ-癸內酯是其關鍵香氣貢獻成分（ROAV＞1），為樣品貢獻了花香味、草香味與甜桃果香味；在殘留組分的揮發性成分中氧化芳樟醇、反式氧化芳樟醇、香葉醇、α-松油醇、庫貝醇、二氫-β-紫羅蘭酮、γ-癸內酯、二氫獼猴桃內酯、肉豆蔻酸甲酯、石竹烯、β-月桂烯是其關鍵香氣貢獻成分（ROAV＞1），為樣品貢獻了花香味、甜香味與甜桃果香味。

表2 桂花凈油各餾分揮發性成分的ROAV 值Table 2 ROAV values of volatile components of different fractions of Osmanthus fragrans absolute

本研究通過將表2 所示的桂花凈油各餾分同類香氣屬性的關鍵香氣貢獻成分（ROAV＞1）ROAV 值相加后，構建桂花凈油各餾分揮發性成分的香氣輪廓描述雷達圖，如圖5 所示，花香味在桂花凈油輕組分揮發性成分的中香氣程度最高，ROAV 值為508.371；草香味在桂花凈油重組分揮發性成分的中香氣程度最高，ROAV 值為312.230；果香味在殘留物組分的揮發性成分中香氣程度最高，ROAV 值為126.661。

圖5 桂花凈油各餾分揮發性成分的香氣輪廓描述雷達圖Fig.5 Radar plot describing the aroma profile of volatile components of different fractions of Osmanthus fragrans absolute

3 結論

本研究以咸寧金桂為原料，采用分子蒸餾技術對亞臨界萃取并脫蠟獲得的桂花凈油進行純化分離后，得到輕組分、重組分、殘留物組分三種不同餾分，采用GC-MS 技術對其進行揮發性成分分析，結果表明桂花凈油各餾分在種類與相對含量上差異顯著（P＜0.05），且具有明顯的特征區分。桂花凈油各餾分中共檢測出73 種揮發性成分，其中各餾分的特征性揮發性成分主要以醇類、酸類、酯類、酮類化合物為主。通過OPLS-DA 模型分析，桂花凈油的輕組分、重組分與殘留物組分的揮發性成分之間存在著明顯區分，可驗證模型具有較好的穩定性與預測性?；赑-value 與VIP 值，對桂花凈油各餾分揮發性品質相關的物質進行篩選，得到27 種相對含量差異顯著的揮發性成分后，通過聚類分析可知各餾分中含量突出的揮發性成分種類分別有輕組分11 種、重組分10 種、殘留物組分9 種，最后采用ROAV 分析與香氣輪廓分析對各餾分揮發性成分進行了整體香氣描述，輕組分表現出的花香味、甜味以及松木香味最為濃郁強烈。本研究對經分子蒸餾技術純化分離后桂花凈油的各餾分進行了揮發性成分分析，為桂花凈油的各餾分揮發性成分鑒別、香氣品質分析以及綜合利用提供理論參考。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).