PTBP3對食管鱗狀細胞癌細胞增殖與遷移的影響及機制研究

呂瑩 郝明碩 錢陽 王蕊 相龍全

1濟寧醫學院臨床醫學院，濟寧 272067；2濟寧市第一人民醫院病理科，濟寧 272002

食管癌是全球最常見惡性腫瘤，尤其在亞洲一些地區，其發病率和病死率均居高不下。食管鱗狀細胞癌（ESCC）占食管癌的90%，隨著手術、放療、化療等多種治療手段的發展，5年生存率不足20%［1-2］。ESCC早期癥狀不明顯，疾病進展迅速，大多數患者在診斷時已進入晚期，治療效果差。多嘧啶束結合蛋白3（PTBP3）屬于RNA結合蛋白PTB家族，與多種腫瘤發生過程密切相關，包括RNA的剪接、穩定和轉運等。既往研究發現，PTBP3在肺癌、胰腺癌、胃癌、結直腸癌中蛋白水平升高［3-4］。本研究探討PTBP3在ESCC中的表達情況及其作用機制，為ESCC的診斷及治療提供新思路和方法。

材料與方法

1.細胞培養和轉染

本研究使用的人ESCC細胞株有ECA109（北納生物）、KYSE150（諾普賽生物）、KYSE30（上海中喬新舟生物科技有限公司）。細胞培養于含有10%胎牛血清（FBS，Gibco Australia）的RPMI 1640培養基（Gibco Australia）中，在37 ℃的5% CO2加濕培養箱中培養。轉染小干擾siRNA時，將細胞接種于6孔板中，24 h后細胞密度40%～60%時用riboFECTTMCP轉染試劑（Ribobio）轉染miRNA mimic（Ribobio）。

2.組織樣本

收集2021年1月至2023年5月濟寧市第一人民醫院的6例ESCC標本及其癌旁正常組織標本。所有患者均經病理診斷，手術切除前均未接受化療或放療。ESCC組織標本均通過組織病理學檢查確定腫瘤大小、組織學分級、TNM分期和淋巴結轉移情況。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，所有患者均簽署知情同意書。

3.慢病毒感染

感染前24 h將細胞接種于6孔板，按照感染倍數加入PTBP3 shRNA的慢病毒。轉染72 h后用2 mg/L嘌呤霉素處理，選擇穩定的細胞系。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質印跡（Western blotting）檢測PTBP3的轉染效率。

4.Western blotting

細胞在含有1%磷酸酶和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中裂解，并用BCA Protein Assay Kit（Beyotime）測定蛋白濃度。使用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并將蛋白轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。將膜置于5%脫脂牛奶中，在旋轉搖床上放置1 h，阻斷非特異性結合位點，然后與一抗特異性抗體在4 ℃下孵育過夜。用1× TBST緩沖液洗滌3次（10 min/次）后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗，室溫孵育1 h。再次洗滌后，使用電化學發光（ECL）檢測試劑（Beyotime）進行免疫印跡分析。

5.qRT-PCR

用TRIZOL（Invitrogen，USA）提取RNA，用SupersmartTM6 min耐熱首鏈cDNA合成試劑盒（中實基因科技有限公司）合成cDNA。采用Ribo mRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒（Ribobio）進行實時PCR。U6、miR29a-3p、miR29b-3p及miR29c-3p引物購自銳博生物，使用miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒（Ribobio）進行實時PCR，其余用于RT-PCR分析引物如下：GAPDH Forward Primer：GAACGGGAAGCTCACTGG；GAPDH Reverse Primer：GCCTGCTTCACCACCTTCT；PTBP3 Forward Primer：TGTCCCACCAACTATTCATCCA；PTBP3 Reverse Primer：CTCTGGAACATATGCCTCAGGT。

6.細胞計數試劑盒（CCK-8）

CCK-8（Dojindo，日本）檢測細胞增殖。將慢病毒感染24 h的腫瘤細胞以每孔1 000個細胞密度接種到96孔細胞培養板中，體積為100 μl，在正常條件下培養24 h，然后每孔加入10 μl CCK-8試劑，2 h后，使用酶標儀在450 nm處測量吸光度值。每組試驗重復3次。

7.細胞劃痕試驗

將細胞接種到6孔板上，孵育24 h后，用100 μl無菌吸管尖劃傷融合細胞單層，加入無血清培養基。0 h、24 h和48 h倒置顯微鏡測量劃痕間隙距離，顯微鏡拍攝圖片經Image J軟件計算細胞遷移距離。

8.生信數據分析

使用UALCAN數據庫（http：//ualcan.path.uab.edu/）、癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫分析食管癌組織及正常食管組織PTBP3的表達差異及PTBP3與miR29家族的關系。

9.統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料采用均數±標準差（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內采用配對t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.ESCC組織中PTBP3基因表達水平

利用TCGA數據研究ESCC組織和正常食管組織PTBP3的表達水平，結果顯示，ESCC組織中PTBP3基因的表達量高于正常食管組織（P＜0.001），且與食管腺癌及正常食管組織相比，ESCC組織中的PTBP3表達水平較高（P＜0.05）。PTBP3表達水平和臨床分期、病理分化程度以及淋巴結轉移程度關系不明顯（圖1A～D）。正常食管鱗狀上皮組織以及ESCC組織中PTBP3蛋白和mRNA的表達水平，結果表明，與正常食管鱗狀上皮組織相比，PTBP3在ESCC組織中高表達，與TCGA數據庫中數據一致（圖1E～G）。

圖1 PTBP3在ESCC組織中高表達。A為TCGA數據庫中PTBP3在食管癌與正常食管組織中的表達差異，B為TCGA數據庫中PTBP3基因表達與臨床分期的關系，C為TCGA數據庫中PTBP3基因表達與腫瘤分化程度的關系，D為TCGA數據庫中淋巴結轉移與PTBP3基因表達關系，E為qRT-PCR檢測ESCC和食管鱗狀上皮組織中PTBP3 mRNA的表達情況，F、G為Western blotting檢測ESCC和食管鱗狀上皮組織中的PTBP3蛋白表達水平

2.PTBP3敲低抑制ESCC細胞株遷移和增殖

慢病毒感染構建PTBP3穩定敲低的ESCC細胞，qRT-PCR和Western blotting結果顯示，ECA109細胞、KYSE150細胞、KYSE30細胞中PTBP3 mRNA和蛋白水平降低（圖2A～C）。CCK-8試驗結果顯示，敲低PTBP3能抑制ECA109細胞、KYSE150細胞及KYSE30細胞增殖能力（圖2D）。細胞劃痕試驗結果顯示，PTBP3敲低能抑制ESCC細胞遷移能力（圖2E～F）。

圖2 感染PTBP3敲低病毒能降低ESCC細胞活力和遷移能力。A、B為Western blotting檢測細胞中PTBP3蛋白表達情況，C為qRT-PCR檢測細胞中PTBP3 mRNA表達情況，D為CCK-8試驗檢測ESCC細胞活力，E、F為細胞劃痕試驗檢測ESCC細胞的遷移能力

3.PTBP3敲低可降低ESCC細胞miR-29a-3p與miR-29c-3p的表達水平

PTBP3在miRNA前體轉錄過程中發揮作用。通過TCGA數據庫篩選PTBP3潛在的下游靶點分子，結果發現，在食管癌組織中，PTBP3基因表達與hsa-miR29-3p的表達相關。qRT-PCR結果表明，與對照病毒組相比，3種ESCC細胞（KYSE30、ECA109、KYSE150）的PTBP3敲低組中miR-29a-3p與miR-29c-3p表達水平下調（t=29.007、7.057、4.844、12.625、15.612、18.861，均P＜0.05），而miR-29b-3p的表達在KYSE30、ECA109細胞中差別較大（圖3A～C）。

圖3 PTBP3敲低可降低ESCC細胞中miR-29a-3p與miR-29c-3p的表達量。A～C為qRT-PCR檢測ESCC細胞中miR-29家族表達情況

4.ESCC組織中miR-29與PTBP3的表達水平

qRT-PCR結果表明，與正常食管鱗狀上皮組織相比，miR-29家族在ESCC組織中高表達（圖4A～C）。ESCC組織中miR-29a-3p、miR-29b-3p、miR-29c-3p相對表達量與PTBP3相對表達量進行相關性分析，結果表明，ESCC組織中miR-29a-3p和miR-29c-3p表達量與PTBP3表達量相關。

圖4 ESCC組織中miR-29家族表達升高，且與PTBP3表達相關。A～C為qRT-PCR檢測ESCC組織中miR-29家族表達情況，D～F為ESCC組織中miR-29家族與PTBP3表達情況相關性

討論

PTBP家族成員主要參與RNA剪接，可以在細胞質和細胞核之間穿梭，優先結合富含多嘧啶的RNA片段［5］。PTBP1和PTBP2的相關研究較多，而PTBP3的相關功能近年來才引起學者們的關注［6-8］。Yamamoto等［7］文獻表明，PTBP3能夠作為調節蛋白參與細胞分化。也有文獻證實，PTBP3與多種惡性腫瘤進展密切相關，并且可能具有組織特異性，在肺癌、乳腺癌、胃癌中PTBP3蛋白水平升高，而膠質母細胞瘤中PTBP3表達水平低于周圍正常組織［3，8-10］。PTBP3通過選擇性剪接參與胃癌轉移、分化和遷移，抑制PTBP3可誘導胃癌細胞凋亡及細胞周期阻滯，增強5-氟尿嘧啶對胃癌細胞的毒性［11-12］。另外，PTBP3能夠通過調節缺氧誘導因子-1α翻譯激活，維持UBE4A mRNA穩定性，從而調控P53表達，促進結直腸癌細胞增殖與遷移［4，13］。本研究證實PTBP3在ESCC患者中高表達，PTBP3表達可抑制ESCC細胞增殖和遷移。

Treiber等［14］研究提示，PTBP3對miR-29家族成員進行轉錄后調控，促進pre-miRNA剪接在miRNA成熟過程中發揮作用。miR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c組成，它們在基因序列和生物學功能上有很高的保守性。miR-29家族已被證明在多種癌癥中起著重要作用，主要通過與靶基因3'非編碼區域結合，抑制靶基因表達，發揮抑癌或促癌作用，如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路中的重要蛋白位點［15］。有研究發現，當miR-29被沉默時，食管癌細胞增殖能力降低，細胞周期被阻斷在G1期，與食管癌進展和預后相關［16-17］。在miR-29家族中，miR-29-3p是主要發揮功能的片段，因此，選擇miR-29-3p作為主要研究對象［18-19］。本研究結果表明，PTBP3敲低之后，ESCC細胞中miR-29a-3p與miR-29c-3p表達降低。miR-29b-3p的表達具有個體差異性，在KYSE30細胞中表達升高，ECA109 細胞中表達降低，KYSE150細胞中差異不明顯，深層次的表達差異機制需要我們更進一步探索。此外，在ESCC組織中，我們發現PTBP3表達與miR-29家族成員表達均呈正相關性。因此，我們猜測PTBP3可以參與pre-miR-29家族成員的轉錄后調控，促進成熟miR-29形成，而其中的具體機制需要進一步研究。

本研究初步探討PTBP3在ESCC細胞中的表達水平以及PTBP3在ESCC細胞增殖和遷移方面的功能作用，并且證明PTBP3可通過與前體miRNA結合調控miR-29家族表達，進而調節ESCC細胞活性和遷移。PTBP3是ESCC的一個重要分子標志物和潛在治療靶點，可為ESCC早期診斷和治療提供新思路和方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明呂瑩：實施研究，采集、分析/解釋數據，起草文章，對文章的知識性內容作批評性審閱，統計分析；郝明碩：醞釀和設計試驗，實施研究，起草文章，指導，支持性貢獻；錢陽：實施研究，采集、分析/解釋數據，起草文章，統計分析；王蕊：實施研究，采集數據，起草文章，統計分析；相龍全：醞釀和設計試驗，實施研究，對文章的知識性內容作批評性審閱，行政、技術或材料支持，指導，支持性貢獻