植物提取物A對SD大鼠更年期綜合征的緩解作用

葛亞中，金鑫，歐穎儀，高藝敏

（1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 361100）

（2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

更年期是女性逐漸步入老年期的過渡階段，更年期女性的卵巢功能會從旺盛狀態逐漸衰退直到完全衰竭[1]。女性在更年期期間由于內分泌失調以及性激素的分泌紊亂，會出現一系列心理與生理上的變化。在此期間出現的一系列心理和生理方面的病癥被統稱為更年期綜合征，涉及了神經系統、心血管系統、骨代謝[2]等多方面，主要表現為頭痛、潮熱、血壓升高、記憶力減退、骨質疏松[3]等，這直接地影響月經停止后女性生理健康和老年生活質量。

更年期期間的女性體內的性激素分泌會發生變化，如雌激素、抗苗勒氏管激素分泌減少；促卵泡生成素、促黃體生成素分泌增加；這些變化極大地影響更年期女性的身體健康。激素的變化也會帶來一系列的癥狀，絕經后骨質疏松（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）是更年期綜合征的重要表現，約有25%～30%的女性在月經停止后都患有骨質疏松[4]，PMOP 人群可占到整體骨質疏松人群的80%。調查研究表明，骨質疏松在老年女性中的發病率約為男性的3 倍[5]，雌激素水平下降常常被認為是導致PMOP 的重要因素。雌激素可促進骨生成，減少骨吸收，故更年期女性體內雌激素與雄激素的平衡狀態被打破，雌激素水平大幅降低[6]，進而誘發骨質疏松。

更年期綜合征尤其是骨質疏松嚴重威脅老年女性的健康，如何預防、減輕更年期綜合征，平緩度過更年期始終是備受關注的課題。目前針對更年期綜合征在臨床上主要采用激素替代療法（HRT），直接補充雌激素可以有效緩解絕經后骨質疏松[7]。然而，有研究表明對患者進行外源性雌激素補充，若長期作用或劑量控制不佳，有導致乳腺癌、子宮內膜癌[8]等疾病的風險。且激素替代療法并不適用于所有女性，有研究表明，對于肥胖女性，使用激素替代療法可能會加劇她們的血栓風險[9]。此外，目前市面上一些用于治療更年期綜合征的藥物存在風險，如雷洛昔芬[10]，其在調節更年期綜合征、骨質疏松上的功效被廣泛認可，但是已有報道顯示它存在誘發血凝塊的風險。因此，人們更傾向于使用來源天然且安全的功能食品緩解更年期綜合征及骨質疏松[11]，但目前市面上此類產品仍存在空白。本研究將研究植物提取物A 在緩解更年期綜合征，尤其是調節更年期大鼠性激素分泌以及更年期導致的骨質疏松方面的作用，為其在功能食品方面的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

1.1.1 樣品

植物提取物A 由無限極（中國）有限公司提供，1 片為730 mg，每片含大豆提取物100.02 mg、鼠尾草提取物50 mg、百合提取物150 mg、墨旱蓮提取物15 mg、甲萘醌7（維生素K2）35 μg、d-α-生育酚琥珀酸酯8.617 mg。

1.1.2 實驗動物

使用SPF 級的雌性SD 大鼠（購入時體質量152.0～198.3 g，正式實驗時體質量（197.6～266.3 g），試驗動物由珠海百試通生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2020-0051，實驗動物質量合格證明編號44822700001637。對購入SD 大鼠檢疫7 d。檢疫期間為群養，每箱4 只，造模后為每箱4 只，飼養溫度與濕度：20～26 ℃，40%～70%，采用12 h:12 h 晝夜間斷照明；飼養室條件始終保持穩定，以保證試驗結果的可靠性。試驗期間動物均按實驗要求喂以相應顆粒飼料，所有飼料由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供。動物自由進食飲食。

1.1.3 主要儀器設備

JSB3-01 電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；Discovery A 雙能X 線骨密度儀，Hologic 公司；臺式離心機，Sigma 3K15；超純水制備機，雷磁UPW-N30UV；全自動生化分析儀，SHINOVA chemo 120V；55AA 型火焰原子吸收分光光度計，美國Agilent Technologies。日本島津高性能液體色譜儀HLPC，液質聯用儀API 5500LC-MS/M 系統。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模方法

建立大鼠卵巢摘除模型[12]（OVX），分別設置空白組，模型組，植物提取物A 低、中、高劑量組。造模時吸入異氟烷麻醉，麻醉后動物俯臥位于背部肋脊角位置剃毛備皮，于肋脊角位置剪開約1 cm切口，看到脂肪團后，手術彎鑷將脂肪團輕輕拉出，于脂肪團中可見粉紅色或黃紅色卵巢，結扎輸卵管后剪除卵巢，并將脂肪和子宮角送回腹腔，同法剪除另一側卵巢?？瞻捉M同法作背部切口，把卵巢和脂肪找到后送回腹腔內。逐層縫合肌肉和皮膚。術后連續3 d 肌注青霉素鈉注射液。

對實驗動物每天進行陰道細胞監測。在卵巢摘除后第5 天開始觀察，連續5 d 觀察大鼠陰道涂片，可觀察到陰道彈性降低、陰道皺縮且伴隨動情周期紊亂的雌性大鼠即為已經進入更年期，造模成功，進而開展植物提取物A 灌胃。

1.2.2 給藥方法

完成更年期模型造模后各組動物喂飼無雌激素飼料至試驗結束，造模后第5 天分別開始對各組進行按劑量灌胃相應的植物提取物A，空白對照組和模型組灌胃純凈水，高中低劑量組灌胃劑量分別為280、140 和70 mg/(kg.d)。灌胃頻率為每天固定時間點，每天一次，連續灌胃14 周，直至模型組動物出現骨質疏松癥狀。

1.2.3 觀察

試驗開始每天觀察動物的一般臨床情況一次，至試驗結束。試驗開始、試驗結束及每周稱量體質量1 次。

1.2.4 性激素檢測

對分離的血清，使用ELISA 試劑盒檢測動物體內的激素水平，包括雌二醇，促卵泡激素以及抗苗勒氏管激素，按照說明書測定血清中的激素含量，對激素水平進行定量分析。

1.2.5 骨鈣指標及骨代謝標志物檢測

骨鈣含量測定：取左側股骨，用原子吸收法測定骨鈣含量。

骨密度測定：取右側股骨用骨密度儀測定股骨中點和股骨遠心端骨密度。

血磷和血鈣檢測：對分離的血清，采用血磷濃度測定試劑盒和血鈣濃度檢測試劑盒對各處理組中收集的血清進行定量分析，計算血磷和血鈣含量。

對分離獲得的血清，利用相應的ELISA 試劑盒對大鼠血清中骨代謝調控激素25 羥維生素D、成纖維生長因子和骨轉化標志物Ⅰ型前膠原交聯C 末端肽、Ⅰ型前膠原N 端肽、堿性磷酸酶和骨鈣素進行定量分析。

1.2.6 組織切片

對收集固定的子宮組織自來水洗滌，乙醇分級脫水，二甲苯透化，石蠟包埋。制備好的蠟塊，進行切片厚度為4 μm。對固定的子宮組織進行切片蘇木精伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，在顯微鏡下對切片觀察分析各處理組之間的子宮組織面積，腔內大小，內膜情況及腺體數量的差異；

骨組織在制備前需要對骨進行脫鈣，在骨組織固定后，使用鹽酸甲酸甲醛液中對其脫鈣處理，標本檢查以手感有彈性、用大頭針能輕松刺入為脫鈣良好，所有標本脫鈣后均放入自來水中反復沖洗30 min。后續操作如常規切片制備操作，縱向切成4 μm厚的切片。對切片進行蘇木精伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色并在顯微鏡下觀察分析骨小梁結構及小梁面積的差異分析。

1.3 數據分析

所有數據采用（x-±s）表示，應用SPSS 21.0軟件進行統計分析；計量資料數據方差齊，或數據經轉換后方差齊，則采用單因素方差分析；若數據經轉換后方差仍不齊，采用秩和檢驗進行統計分析。檢驗水平α=0.05。

2 結果與討論

2.1 植物提取物A對更年期大鼠體質量影響

2.1.1 各組動物體變化

體質量是反映動物生長情況的重要參考指標，體質量出現異常升高下降時，則提示機體健康狀況出現問題。由表1 可知，試驗期間各組動物隨灌胃時間延長體質量逐漸升高，未見體質量異常，試驗期間無動物死亡。與空白組相比，其余各組在第2～14 周體質量更高，有統計學差異（P＜0.05）。與模型組相比，給藥各組在各個時間點的體質量無統計學差異（P＞0.05）。

表1 大鼠體質量變化情況Table 1 Body weight change of rats during the experiment (g)

2.2 植物提取物A對更年期大鼠子宮及性激素分泌影響

2.2.1 子宮切片

由圖1 可知，模型組大鼠的子宮顯著縮小，子宮內膜變薄，子宮內膜上皮細胞及子宮腺上皮細胞呈水樣變性、壞死，子宮腺體擴張，可觀察到固有層少量的炎性細胞浸潤。灌胃低、中、高劑量植物提取物A 后，子宮內膜上皮細胞、子宮腺上皮細胞水樣變性減少，子宮腺擴張減少，未見明顯的炎性細胞浸潤，固有層細胞和肌層細胞排列緊密。這表明植物提取物A 可以改善更年期大鼠的子宮狀態，其中高劑量組的改善效果最為顯著。

圖1 植物提取物A 對大鼠子宮的影響Fig.1 Effect of plant extracts A on rats uterus

2.2.2 雌二醇含量

雌激素如雌二醇（Estradiol，E2）、促卵泡激素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）、抗苗勒氏管激素（Anti-Mullerian Hormone，AMH）在機體內的平衡與更年期綜合征的發生密切相關。它們參與調節卵泡生長、發育、成熟以及排出的過程，雌激素水平的變化可以早期預測卵巢功能的潛在變化[13]。更年期轉變與激素水平的改變有關，兩個公認的激素特征是雌二醇顯著下降和促卵泡激素顯著上升[14]?？姑缋帐瞎芗に匾种坡雅萆L，防止卵泡過早過快被消耗的作用，可以早期預測卵巢功能的潛在變化[15]。

如圖2～ 圖4 所示，摘除卵巢后模型組大鼠血清中E2含量、AMH 含量相較于空白組均顯著降低（P＜0.05），而模型組大鼠血清的FSH 含量較空白組顯著升高（P＜0.05），符合更年期激素變化特征。相較于模型組，灌胃植物提取物A 可以顯著提高大鼠血清中的E2（P＜0.05）、AMH（P＜0.05），分別提高了33.33%、134.78%；灌胃植物提取物A 的大鼠血清中的FSH 含量相較于模型組降低了8.42%（P＜0.05）。在灌胃劑量70、140 和280 mg/(kg.d)的范圍內，植物提取物A 對上述三種性激素的調節均具有劑量依賴性，隨著灌胃劑量的升高，大鼠血清中E2、AMH 含量逐漸上升，FSH 含量逐漸降低。

圖2 植物提取物A 對大鼠血清雌二醇含量的影響Fig.2 Effect of plant extracts A on the level of serum estradiol of rats

圖3 植物提取物A 對大鼠血清促卵泡激素含量的影響Fig.3 Effect of plant extracts A on the level of serum follicle stimulating hormone of rats

圖4 植物提取物A 對大鼠血清抗苗勒氏管激素的影響Fig.4 Effect of plant extracts A on the level of serum anti-Mullerian hormone of rats

植物提取物A 中含大豆提取物、鼠尾草提取物、百合提取物、墨旱蓮提取物、維生素K、d-α-生育酚琥珀酸酯，豐富的營養成分可發揮緩解更年期綜合征的作用。黎桂玉等[16]研究表明，大豆異黃酮能提高更年期大鼠血清E2水平至模型組的3.6 倍。李賽君[17]使用百合地黃湯合加味逍遙散聯合西藥治療更年期綜合征患者，連續服用30 d 后，聯合服藥組患者的血清E2水平高于單一用藥組，血清FSH 水平低于單一用藥組，且聯合組治療總有效率97.67%高于單一用藥組78.94%（P＜0.05）。陳馬蘭等[18]復配使用女貞子和墨旱蓮灌胃更年期大鼠，結果表明女貞子和墨旱蓮可以提高更年期大鼠血清E2含量。佐兆杭等[19]建立卵巢衰老大鼠模型，使用不同劑量大豆膳食纖維連續灌胃4 周，結果表明大豆膳食纖維可以提高卵巢衰老大鼠中的E2以及AMH 含量，緩解卵巢衰老。

2.3 植物提取物A對更年期大鼠骨組織影響及骨質疏松緩解效果

2.3.1 各組大鼠骨組織切片

由圖5 可知，與空白組相比，模型組軟骨及生長板軟骨細胞壞死，胞核固縮深染、碎裂或溶解消失，骨陷窩增大；生長板周圍骨小梁溶解，呈無結構的嗜酸性物，周圍可見大量的成骨細胞；皮質骨處結締組織增生，并伴有炎性細胞浸潤。骨小梁數量明顯減少，排列疏松。經中、高劑量植物提取物A 干預后，骨組織癥狀有明顯改善，植物提取物A 中劑量組的骨小梁數量較模型組增加，而高劑量組的骨組織接近于空白組狀態，表明植物提取物A 可改善大鼠由更年期所致的骨質疏松。

圖5 植物提取物A 對大鼠骨組織的影響Fig.5 Effect of plant extracts A on the bone tissue of rats

2.3.2 血磷和血鈣含量

當進入更年期，雌激素的缺乏可導致機體內鈣和磷的代謝紊亂。由表2 可知，與空白組對比，模型組血磷和血鈣均顯著降低（P＜0.05）；相較于模型組，灌胃不同濃度的植物提取物A 均可提高大鼠的血鈣和血磷含量，且伴隨劑量依賴性。與模型組相比，高劑量組大鼠血清中的血磷含量顯著增加（P＜0.05）；但低、中劑量灌胃組大鼠血磷和模型組相比無顯著性差異。高劑量組大鼠的血磷較模型組提高了14.04%，與空白組相比無顯著性差異，表明高劑量植物提取物A 可顯著緩解更年期大鼠血磷降低。

表2 植物提取物A對大鼠血磷和血鈣含量的影響Table 2 Effect of plant extracts A on the levels of blood phosphorus and calcium of rats (mmol/L)

與模型組相比，灌胃低、中、高劑量的植物提取物A 后各組大鼠的血鈣升高，分別升高了6.13%、9.03%和12.58%，均有統計學差異（P＜0.05）。且中、高灌胃劑量的植物提取物A 可以將大鼠的血鈣水平回調至與空白組無顯著性差異。上述結果顯示植物提取物A 在一定程度上恢復了鈣磷代謝穩態，緩解更年期血磷血鈣降低所引起的潛在骨質疏松風險。Li 等[20]對比大豆異黃酮苷元和雌二醇對去卵巢更年期大鼠血清磷、鈣含量的影響，結果表明大豆異黃酮苷元與雌激素具有相同的作用，可緩解去卵巢大鼠血清磷、鈣含量的下降，灌胃大豆異黃酮苷元組較模型組分別提高了8.13%、27.71%。

2.3.3 骨密度和骨鈣含量

骨質疏松主要以絕經后婦女和老年人多見，當進入更年期，機體內雌激素的紊亂會加速骨量流失進而導致骨質疏松的發生，骨密度如全骨骨密度、骨遠端骨密度、骨中端骨密度以及骨鈣含量是骨質疏松的直觀指標。

由表3 可知，模型組更年期大鼠的全骨骨密度、骨遠端骨密度、骨中端骨密度以及骨鈣含量較空白組均顯著降低（P＜0.05），分別降低了10.71%、10.34%、7.69%、32.64%，即更年期會伴隨骨質疏松和骨密度降低；灌胃植物提取物A 后，大鼠的全骨骨密度、骨遠端骨密度、骨中端骨密度以及骨鈣含量均較模型組有顯著提高（P＜0.05）且呈現劑量依賴性，分別提高了8.00%、7.69%、8.33%、34.87%。

表3 植物提取物A對大鼠骨密度和骨鈣含量的影響Table 3 Effect of plant extracts A on the levels of bone mineral density and bone calcium of rats (g/cm2)

Li 等[20]使用大豆異黃酮苷元灌胃去卵巢更年期大鼠，連續灌胃90 d 后，樣品組的骨密度較模型組顯著提高且具有劑量依賴性。陳方耿等[21]調研了210 例圍絕經期婦女的骨密度和維生素K2 水平，維生素K2 缺乏組婦女的骨密度水平顯著低于維生素K2 正常組，Pearson 相關性分析表明圍絕經期婦女維生素K2 與骨密度呈正相關。

2.3.4 骨代謝調控激素

血清25 羥維生素D（Serum 25-hydroxy Vitamin D, 25-OH-VD）可通過調節骨密度與骨組織微結構，進而調控骨質疏松的發生[22]。成纖維細胞生長因子（Fibroblast Growth Factor 23，FGF23）是一種主要由骨細胞產生的內分泌激素，可調節機體磷酸鹽和維生素D 水平[23]。在人體的骨骼發育中，成骨細胞合成和分泌的骨堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）具有重要作用，ALP 主要作用于骨礦化過程，是骨形成必需的催化劑[24]。骨鈣素（Osteocalcin，OC）是成骨細胞分泌的小分子非膠原蛋白，骨基質中含量最豐富的標志物，可直接反映骨形成和骨重建功能[25]。I 型前膠原C 端肽（C-terminal Telopeptide of Type I Procollagen，CTX-I）為I 型前膠原降解產物，當CTX-I 水平升高時，I 型膠原被破壞，繼而破壞骨基質[26]。成骨細胞合成新型I 型膠原后，成骨細胞外的蛋白酶將I 型前膠原N 端肽（Procollagen I N-terminal Propeptide，PINP）從I 型前膠原中裂解而來。血清PINP 濃度反映骨新骨形成總量，是良好的骨形成指標[27]。它們可直接反映成骨細胞、破骨細胞的活動，其改變相對于骨密度而言往往表現地更早[28]，國際臨床化學聯合會骨標志物標準工作組已將血液中的CTX-I 和PINP 確定為預測骨折風險和監測骨質疏松癥治療的骨轉換的參考標志物[29]。

由圖6 可知，模型組大鼠的血清25-OH-VD水平較空白組顯著降低（P＜0.05），灌胃低、中、高劑量的植物提取物A 后，各組大鼠的血清25-OH-VD水平呈現劑量依賴型提高，分別提高了11.73%、44.44%、78.40%，與模型組相比均有顯著性增加（P＜0.05）。由圖7 可知，模型組大鼠血清中FGF23 水平較空白組顯著降低（P＜0.05），灌胃低、中、高劑量的植物提取物A 后，各組大鼠的FGF23水平均較模型組顯著升高（P＜0.05）且呈現劑量依賴性，分別提高了14.21%、39.96%、60.21%。由圖8 可知，模型組大鼠血清ALP 含量顯著低于空白組（P＜0.05），灌胃低、中、高劑量的植物提取物A 后，大鼠血清中ALP 含量呈劑量依賴型升高；中、高劑量組較模型組具有顯著性差異（P＜0.05），分別提高了20.00%、40.00%，且高劑量的植物提取物A 可將更年期大鼠血清中ALP 含量回調至與空白組無顯著差異水平（P＞0.05）。由圖9 可知，模型組大鼠血清OC 含量顯著低于空白組（P＜0.05），灌胃低、中、高劑量的植物提取物A 后，大鼠血清中OC 含量呈劑量依賴型升高，分別提高了15.73%、25.81%、51.61%，且高劑量的植物提取物A 可將更年期大鼠血清中OC 含量回調至與空白組無顯著差異水平（P＞0.05）。如圖10 所示，模型組的大鼠CTX-I 含量比空白組顯著升高（P＜0.05），而灌胃植物提取物A 后，CTX-I 含量有明顯降低，且呈現劑量依賴性。其中植物提取物A 中、高劑量組大鼠血清中CTX-I 含量較模型組顯著降低（P＜0.05），分別降低了22.46%、34.22%。由圖11 可知，模型組的大鼠PINP 含量較空白組顯著降低（P＜0.05），灌胃低、中、高劑量的植物提取物A 后，大鼠血清中PINP 含量呈劑量依賴型升高；中、高劑量組較模型組具有顯著性差異（P＜0.05），分別提高了78.57%、128.57%。以上結果表明，植物提取物A可通過促進骨形成和抑制骨吸收的雙重作用來提高骨密度和改善骨的微結構。

圖6 植物提取物A 對大鼠血清25 羥維生素D 含量的影響Fig.6 Effect of plant extracts A on the level of serum 25-hydroxy vitamin D of rats

圖7 植物提取物A 對大鼠血清成纖維生長因子含量的影響Fig.7 Effect of plant extracts A on the level of serum fibroblast growth factor 23 of rats

圖8 植物提取物A 對大鼠血清堿性磷酸酶含量的影響Fig.8 Effect of plant extracts A on the level of serum alkaline phosphatase of rats

圖9 植物提取物A 對大鼠血清骨鈣素含量的影響Fig.9 Effect of plant extracts A on the level of serum osteocalcin of rats

圖10 植物提取物A 對大鼠血清I 型前膠原交聯C 末端肽含量的影響Fig.10 Effect of plant extracts A on the level of serum C-terminal telopeptide of type I procollagen of rats

圖11 植物提取物A 對大鼠血清I 型前膠原N 端肽含量的影響Fig.11 Effect of plant extracts A on the level of serum procollagen I N-terminal propeptide of rats

高美等[30]研究不同劑量大豆甙元對去卵巢大鼠骨礦沉積的影響，結果表明服用大豆甙元可以提高大鼠血清中血清25 羥維生素D 和骨鈣素的含量。李小云等[31]的研究表明，百合的有效成分槲皮素可通過雌激素受體信號通路促進骨髓間充質干細胞成骨分化，改善骨微結構。楊芳芳[32]的研究表明，口服鼠尾草中的有效成分丹參酮可抑制去卵巢大鼠的骨量流失，提高大鼠血清中骨形成指標骨鈣素的含量。程敏等[33]建立大鼠骨質疏松模型，使用墨旱蓮連續灌胃，結果表明墨旱蓮可以提高骨轉化指標如血清中堿性磷酸酶和骨鈣素含量，且可提高骨密度。

3 結論

本文旨在探討植物提取物A 在緩解更年期綜合征，尤其是更年期導致的骨質疏松方面的改善作用。研究結果表明，植物提取物A 可改善更年期引起的子宮內膜及子宮腺上皮細胞壞死和炎性細胞浸潤癥狀；還可調節更年期大鼠性激素分泌，提高血清中雌二醇、抗苗勒氏管激素含量，降低血清促卵泡激素，維持性激素穩態。并且植物提取物A 可顯著改善更年期引起的骨質疏松、骨結締組織增生和炎性細胞浸潤癥狀；調節機體血鈣、血磷代謝，有助于維持更年期大鼠的鈣磷代謝穩態；減輕更年期大鼠骨鈣降低情況，提高全骨骨密度、骨遠端骨密度、骨中段骨密度，維護骨骼健康；提高更年期大鼠血清25 羥維生素D 水平，升高成纖維生長因子水平調節機體代謝，提高堿性磷酸酶、骨鈣素含量，降低I 型前膠原交聯C 末端肽含量，提高I 型前膠原N 端肽含量，通過促進骨形成、減緩骨吸收有效緩解更年期大鼠的骨質疏松。

綜上，植物提取物A 可以通過改善子宮形態、調節相關性激素分泌、改善骨質疏松以起到改善更年期綜合征的效果，此結論為植物提取物A 在功能食品上的應用提供數據支持。