富含OPO、OPL和LPL的結構脂質促進C57BL/6小鼠脂質代謝

孫永，賀楊正，鄧澤元，李靜，彭小雨，潘麗娜，李威，郭丹穎，汪家琦*

（1.澳優乳業（中國）有限公司，湖南長沙 410219）

（2.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌 330047）

結構脂質是指通過改變油脂甘油三酯支鏈上脂肪酸的碳鏈長度和在支鏈上的位置從而改善營養功能性質的油脂[1]。與傳統的天然油脂相比，結構脂質的脂肪酸組成和分子結構可以更精確地設計和控制，因此具有更多的營養和功能優勢[2]。結構脂營養功能已有許多報導，如提高Sn-2 脂肪酸吸收利用，促進其他種類脂質吸收，降低血清TG 及TC水平等[3]。1,3- 二油酸-2- 棕櫚酸甘油三酯（OPO）是一種特殊的甘油三酯，已被報道可用于降低高脂血癥[4]。此外，課題組先前的研究表明具有不同立體構型和比例的甘油三酯對LO2 細胞的脂質代謝具有顯著不同的影響。與Sn-2 位為棕櫚酸的1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯（OPL）、1,3-二亞油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（LPL）和OPO 相比，1-棕櫚酸-2,3-亞油酸甘油三酯（POO）可以顯著誘導脂質積累，而OPL 比LPL 和OPO 更容易誘導脂質積累[5]。但是這些結構脂質對小鼠的脂質代謝影響并不清楚。

當膳食中的甘油三酯（TAGs）被機體吸收后，它們會在在血液中被脂蛋白脂肪酶水解，生成甘油二酯（DAGs）。脂蛋白脂肪酶具有Sn-1,3 特異性，因此它主要水解TAGs 的Sn-1 位置，生成2,3-DAGs，而不水解TAGs 的Sn-2 位置的脂肪酸[6]。接下來，脂蛋白脂肪酶會進一步水解TAGs 的Sn-3 位置的脂肪酸，生成2-甘油單酯（MAGs）。然而，如果TAGs 的Sn-3 位置上的脂肪酸是花生四烯酸或二十碳五烯酸，脂蛋白脂肪酶很難水解這些酯鍵，因此不會形成2-MAGs[7]。如果血漿中肝脂肪酶的活性高，它可以進一步水解含有多不飽和脂肪酸（PUFAs）的DAGs 成為2-MAGs。然而，如果血漿中缺乏肝脂肪酶，乳糜微粒殘留物中會含有大量PUFAs 的DAGs，并且在肝臟中被肝脂肪酶進一步水解成2-MAGs。這些2-MAGs 一部分會進入肝臟作為能源使用或重新合成其他脂質，另一部分則進入周圍組織進行再酯化合成TAGs 或磷脂[7]。因此，膳食中的TAGs 會經歷一系列代謝作用，其中它們的Sn-2 位置上的脂肪酸最終會在乳糜微粒的TAGs和組織中被保留。由于相同脂肪酸組成的TAGs 可能具有不同的結構，例如POP 和OPP，因此它們可能會影響血漿中血脂的清除、組織炎癥和胰島素抵抗等方面[8]。

本研究采用酶促酯交換反應制備了一種富含OPO、OPL 和LPL 特殊結構脂質（SL）的混合物，并將其添加至C57BL/6 小鼠的飼料中進行為期7 d的短期喂養。在此期間，監測小鼠的體質量變化，檢測小鼠血清和肝臟生化指標，以及觀察肝臟中脂質代謝相關蛋白的表達差異。本研究旨在通過分析這些影響，為開發基于消費者需求和油脂特性的個性化功能性食品和營養食品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆油，益海嘉里公司；InFat CC（一種市售特殊的脂肪酸結構，用于生產嬰兒奶粉配方的產品，其OPO 含量≥40 g/100 g），澳優乳業(中國)有限公司；結構脂質（SL），實驗室合成的一種富含OPO、OPL和LPL特殊結構脂質；乙醚、異丙醇、氯仿、甲醇、正己烷等色譜純有機試劑，國藥集團化學試劑有限公司；TC 含量檢測試劑盒、TG 含量檢測試劑盒、HDL-C 測定試劑盒、LDL-C 測定試劑盒、脂肪酸合成酶ELSA 試劑盒（FAS）、PPAR-αELSA 測試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Agilent 6890N 型氣相色譜，美國Agilent 科技公司；Agilent G1260 高效液相色譜-G6430A 三重串聯四級桿質譜聯用儀，美國Agilent 科技公司；AL104精密天平，梅特勒-托利多；WGL-125B 干燥箱，天津市泰斯特儀器；臺式電動離心機，金壇市華鋒儀器；DF-101K 集熱式恒溫磁力攪拌器，鄭州長城科工貿公司；QL-861 渦流振蕩器，其林貝爾儀器制造公司；DSY-V1 氮吹儀，北京金科精華苑科技）；UVmini-1240 分光光度計，日本島津公司；DZKW-4恒溫水浴鍋，北京中興偉業儀器）。

1.3 動物實驗

1.3.1 實驗設計

動物實驗經江西中醫藥大學動物倫理委員會批準（SCXK 2017-0004）。無脂純合日糧購買于小黍有泰（北京）生物技術有限公司。21 只5 周齡健康C57BL/6J 小鼠（湖南斯萊克實驗動物公司，SCXK（湘）2019-0004），實驗環境為普通環境，實驗期間環境溫度22～24 ℃，濕度52%～56%，實驗動物自由攝食飲水。表1 列出了實驗中喂養小鼠的無脂純合日糧飼料的組成情況。另外每天給小鼠灌胃1 次， 每次灌胃劑量100 μL/10 g（油體積/小鼠體質量）。實驗中，將小鼠分為3 組，每組7 只。在飼養期間每天測量1次體質量，以便觀察變化。分組情況如表2 所示。

表1 實驗小鼠日常飼料成分組成（每100 g含量）Table 1 Composition of experimental daily feed (100 g basis)

表2 實驗小鼠分組Table 2 Grouping of experimental mice

1.3.2 血清及肝臟指標測定

嚴格按測定試劑盒使用說明書測定TC、TG、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C、高密度脂蛋白膽固醇LDL-C、脂肪酸合成酶FAS 和過氧化物酶體增殖物活化受體αPPARα含量。

1.4 總脂肪酸組成的測定

在玻璃試管中稱取2.0 mg 的油，加入1.5 mL正己烷，渦旋混合后加入40 μL 的乙酸甲酯并渦旋混合。接著加入100 μL 甲醇鈉-甲醇，在37 ℃水浴中反應20 min。取出反應混合物，放置于-20 ℃的冰箱中10 min 后加入60 μL 的草酸-乙酸乙酯并渦旋混合，離心（轉速為4 200 r/min，離心時間為5 min），取上清液過無水硫酸鈉柱，用氮氣吹干后加入1 mL 色譜級正己烷復溶于6 890 N 氣相色譜儀中進行檢測。色譜條件為使用CP-Sil88 柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm），載氣為N2，燃燒氣為H2和空氣，進樣口250 ℃，進樣量1 μL，FID 檢測器溫度為250 ℃，使用不分流模式。升溫程序為：0～4 min，45 ℃；4～14 min，從45 ℃升溫至175 ℃；14～41 min，保持在175 ℃；41～51 min，從175 ℃升溫至215 ℃；51～86 min，保持在215 ℃。以標準品的保留時間為對照，鑒定脂肪酸的組成。

1.5 甘油三酯構型的測定

采用LC-MS/MS 測定TAG 組成，方法參照張東等[9]，稱取20 mg 反應粗產物，用1 mL 正己烷溶解后，轉移至填充有500 mg 硅藻土材質的SPE-NH2固相微萃取小柱（3 mL 規格，上海安譜儀器有限公司）。采用正己烷和乙醚（85:15,V/V）混合的洗脫液進行洗脫，將甘油三酯吹干。取洗脫后的甘油三酯5～8 mg，用異丙醇稀釋至1 mL，通過0.45 μm有機濾膜過濾。

液相條件：Zorbax Eclipse Plus C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；溶劑A：異丙醇，B：乙腈；洗脫條件為0.00～25.00 min 65% B，25.00～30.00 min 35% B，30.00～30.10 min 65% B，30.10～40.00 min 65% B；流速：0.8 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。

MS 條件：APCI 電離源，正離子模式；霧化氣流4 L/min，霧化電壓20 psi；氣化溫度325 ℃，汽化室溫度350 ℃；掃描模式，EMS-APCI 或者MRM-APCI；裂解電壓90 V；碰撞能，35 V；mass范圍，EMS 400～1 500m/z。EMS-EPI 模式用于定性分析，MRM-EPI 模式用于定量分析。

1.6 數據分析

實驗結果表示為“平均值±標準偏差”，每組實驗重復3 次。數據處理及方差分析采用GraphPad Prism 8 以及SPSS 26.0 統計分析軟件包，圖中不同字母表示具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結果與討論

2.1 結構脂質的總脂肪酸組成分析

表3 顯示了大豆油、InFat CC 和SL 中的總脂肪酸組成。結果表明，大豆油中含有大量的不飽和脂肪酸，其中相對含量最高的是亞油酸（C18:2），約占41.25%，其次是油酸（C18:1），約占23.03%，亞麻酸（C18:3），約占17.67%，這與王志高等[10]的研究結果一致，他們發現大豆油主要含有51.51%的亞油酸以及26.43%的油酸。InFat CC 主要含有棕櫚酸（16:0）和油酸（C18:1），分別占總脂肪酸的39.30%和45.86%。而合成的結構脂質中主要脂肪酸為棕櫚酸（16:0）24.43%、油酸（C18:1）33.46%和亞油酸（C18:2）25.82%。

表3 結構脂質中總脂肪酸組成（相對含量%）Table 3 Total fatty acids of structured lipids

2.2 結構脂質的甘油三酯組成分析

表4 顯示了大豆油、InFat CC 和SL 具體甘油三酯組成。大豆油中甘油三酯相對含量最高的前3 種為OLLn、OLO 和OOO，分別占26.74%、23.09%和20.74%，且甘油三酯的2 位脂肪酸主要是不飽和脂肪酸。張東等[11]研究表明，大豆油中甘油三酯的2 位脂肪酸主要是不飽和脂肪酸，但相對含量較高的甘油三酯分別是LLL（23.19%～33.57%）、LLO（15.23%～22.74%）、PLL（9.73%～16.18%）和LLLn（9.06%～14.22%），造成這種差異的原因可能是檢測方法的不同。InFat CC 中主要含有5 種甘油三酯，其中OPO（44.04%）和MPO（20.97%）為主要的兩種甘油三酯（占比＞60%）。結構脂質SL的甘油三酯種類最多，相對含量較高的前3 種甘油三酯為LPL（18.35%）、OPL（17.04%）和OPO（14.28%）。結果表明，InFatCC 和SL 中均含有較高相對含量的OPO 結構酯，Huang 等[4]研究表明OPO 結構酯具有顯著降低高脂飲食小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平以及增強抗氧化酶活性的功能。同時，InFat CC 和SL 含有的甘油三酯中2 位脂肪酸主要是飽和脂肪酸棕櫚酸，這種獨特的甘油三酯（TAG）結構對嬰兒具有有益作用，例如解決便秘、增強鈣吸收和骨骼發育、脂肪吸收和脂質代謝[12]。

表4 結構脂質甘油三酯組成（相對含量%）Table 4 Triglyceride composition ofstructured lipids

2.3 結構脂質對小鼠體質量變化的影響

圖1a 表現出7 d 中每組小鼠的飲食量情況，可以看出彼此之間飲食量沒有明顯差異（大豆油組14.51 g/d，InFatCC 組14.73 g/d，SL 組15.11 g/d）（P＞0.05），說明小鼠體質量的變化沒有受到飲食量不同的影響。圖1b 反應了不同油喂養期間小鼠體質量的變化情況，對大豆油和InFat CC 喂養的小鼠進行對比，發現其體質量的變化趨勢均呈現緩慢增加的趨勢，而SL 喂養的小鼠體質量變化呈現出下降趨勢，喂養結束三組小鼠的平均體質量分別為27.29 g、26.54 g 和23.3 g，且SL 喂養的小鼠體質量顯著低于大豆油喂養的小鼠（P＜0.05）。結果表明，SL 可以控制小鼠的體質量增加，這可能是因為SL 的特殊甘油三酯結構和脂肪酸組成促進了小鼠脂質代謝，加速了能量代謝，從而控制體質量增加。大量臨床和動物研究表明，結構脂質可以幫助控制體質量，抑制肥胖的發生[13]。Lee 等[14]的研究發現，與物理混合組相比，攝入棕櫚仁油和棕櫚油酯交換結構脂的小鼠體質量增長顯著較少。然而，也有研究報道稱，酯交換結構脂與物理混合油脂對大鼠的體質量沒有影響[15,16]。

圖1 小鼠攝食量和體質量變化Fig.1 Changes in food intake and body weight of mice

2.4 結構脂質對小鼠血清甘油三酯、總膽固醇、高密度膽固醇和低密度膽固醇水平的影響

由圖2 可知，SL 組小鼠血清的甘油三酯水平（1.17 mmol/L）要顯著低于InFat CC 組（1.54 mmol/L），與大豆油組（1.10 mmol/L）相比沒有顯著性差異。大豆油、InFat CC 和SL 組小鼠血清的TC、HDL-C 和LDL-C 濃度都沒有明顯的差異。結果表明，結構脂質能夠降低小鼠血清TG 水平，而對小鼠血清TC、HDL-C 和LDL-C 濃度影響較小。Alfieri 等[17]綜述了含有棕櫚酸和硬脂酸的酯交換油脂和非酯化油脂的甘油三酯結構對人體健康的影響。他們的結論是，與原料非酯化的物理混合油脂相比，沒有足夠的證據表明酯交換油脂不會影響或降低空腹血脂水平，但可以降低受試者餐后血漿甘油三酯濃度，這與本研究結果相一致。此外，早期的幾項研究報告表明，結構化脂質可以降低高血脂小鼠的脂質沉積，特別是甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇水平，同時維持血清和肝臟中必需脂肪酸的狀態[18]。

圖2 結構脂質對小鼠血清甘油三酯（a）、總膽固醇（b）、高密度膽固醇（c）和低密度膽固醇（d）的影響Fig.2 Effect of structural lipid on the serum level of TG (a),TC (b), HDL-C (c) and LDL-C (d) in mice

2.5 結構脂質對小鼠肝臟甘油三酯和總膽固醇水平的影響

由圖3 可知，與大豆油組和InFat CC 組相比，SL 組小鼠的肝臟甘油三酯（0.14 mmol/g prot）和總膽固醇（0.05 mmol/g prot）濃度顯著降低，大豆油組和InFat CC 組小鼠甘油三酯（0.21 和0.19 mmol/g prot）和總膽固醇（0.07 和0.08 mmol/g prot）濃度均沒有顯著性差異，說明SL 能夠降低小鼠肝臟脂肪和膽固醇的堆積。與上訴結果相似，Malongil 等[15]進行了一項大鼠實驗，將含有椰子油和米糠油（或芝麻油）的酯交換結構脂和物理混合油脂添加到正常飲食中。結果表明，盡管結構脂和物理混合油脂的脂肪酸組成相同，結構脂仍然能夠顯著降低肝臟中甘油三酯的濃度。而SL 組小鼠膽固醇濃度顯著降低，這可能是SL 能夠促進肝臟膽固醇轉化為膽汁酸從而降低小鼠肝脂水平[19]，這需要進一步的研究來證明。此外，Wu 等[5]研究發現，在使用25 μmol/L 的結構脂質OPO、OPL 和LPL 分別處理LO2細胞24 h，三種結構脂質均表現出一定的降脂作用，在本研究中OPO、OPL 和LPL 是SL 含有的三種主要甘油三酯。Zhang 等[20]研究表明與富含油酸的甘油三酯相比，富含亞油酸的甘油三酯消化性較低，但吸收性較高，與InFatCC 相比大豆油和SL 均含有更高含量的亞油酸甘油三酯，這可能是大豆油和SL 對小鼠血脂影響程度更大的原因之一。

圖3 結構脂質對小鼠肝臟甘油三酯（a）和總膽固醇（b）的影響Fig.3 Effect of structural lipid on the liver level of TG (a)and TC (b) in mice

2.6 結構脂質對小鼠肝臟脂肪酸代謝相關蛋白的影響

圖4 的結果表明，與InFat CC 組（FAS 0.17 mg/g肝臟，PPARα0.05 mg/g 肝臟）相比，SL 組小鼠肝臟中FAS 質量分數（0.13 mg/g 肝臟）顯著降低（P＜0.05）而PPARα的質量分數（0.08 mg/g 肝臟）顯著增加（P＜0.05），說明SL 喂養的小鼠肝臟中脂肪酸的合成減少且脂肪酸氧化增加。FASN 基因調控脂肪酸的脂肪合成，該基因編碼脂肪酸合成酶FAS，并催化棕櫚酰輔酶A 的合成[21]。脂肪β-氧化是脂肪的主要代謝途徑，PPARα是轉錄因子，能夠直接轉錄參與脂肪酸β-氧化的基因，增加PPARα的表達或活性可以有效增強脂肪酸β-氧化[22]?？偟膩碚f，小鼠通過攝入SL 以后，可以增強其肝臟內的脂肪酸β-氧化并且抑制脂肪酸從頭合成，這可能是SL 降低小鼠肝臟甘油三酯的一個主要原因。最近一項研究發現，SL 不但具有天然植物油的特性，而且還有一定的營養功能。例如降低血清膽固醇、減少體質量和促進脂質代謝等[23]，根據這些功能，建議結構脂質可用作嬰兒食品和藥物制劑中的營養補充劑[24]。因此本研究能夠為結構脂質用作嬰兒食品和藥物制劑中的營養補充劑通過理論依據。

圖4 結構脂質對小鼠肝臟脂質代謝相關蛋白的影響Fig.4 Effect of structural lipids on genes related to liver lipid metabolism in mice

3 結論

通過動物實驗研究表明，富含OPO、OPL 和LPL 結構脂質（SL）可以通過增強小鼠肝臟內的脂肪酸β- 氧化并且抑制脂肪酸從頭合成，降低了小鼠肝臟內脂肪和膽固醇的堆積，從而達到抑制肥胖的作用。因此，本研究可以為結構脂質在減少體內脂質堆積、促進脂質代謝和抑制肥胖的新型食品開發應用提供理論依據。