益生菌發酵對姜制天麻活性成分及其抗氧化活性的影響

賴嵐玉，李敏，趙文俊，黎攀，杜冰

(華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642)

天麻為蘭科植物天麻（Gastrodia elataBl.）的干燥塊莖，是我國傳統名貴中藥材，也是食藥同源的一種原料。從2019 開始，國家衛生健康委準許開展有關天麻按照傳統既是食品又是中藥材的物質生產經營試點工作[1]。其中天麻中的天麻素（Gastrodin，GAS）和對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl Alcohol，HBA）是其主要功能活性成分[2]，被《中國藥典》（2020 年版）收載為天麻的質量指標?，F代藥理研究和臨床應用表明，天麻具有改善抑郁癥[3,4]、神經炎癥[5]和阿爾茲海默癥[6]等多種藥理活性，在功能性開發方面具有較大的潛力。

鮮天麻原料存在易腐敗貯藏期短等原因，使其產業鏈短，產品深加工不足，附加值低下，但不同的加工工藝對天麻的活性成分具有較大的影響[7,8]，因此對鮮天麻的深加工探索極為迫切但同時應兼顧活性成分含量。姜制是天麻重要加工手段，天麻經姜制后能夠提高其功能活性。在張霞[9]的研究中，姜制能夠提高天麻對于治療偏頭痛的作用。發酵作為一項重要的加工手段，廣泛的應用在食品加工領域。在發酵天麻的研究中，發酵能使得天麻中的有效成分例如GAS、HBA、巴利森苷A、巴利森苷E等在微生物作用下相互之間會發生轉化，能夠一定程度上提高功能活性[10,11]。在趙敏等[12]研究中，干天麻粉經酵素化后其抗氧化活性顯著提高。在蔡倪等[13]采用釀酒酵母發酵天麻粉體外抗氧化活性有所提升。在Gao 等[3]的研究中發酵鮮天麻具有抗抑郁的效果。但目前對于姜制和發酵復合加工的工藝，尚未見有報道。

因此本研究以鮮天麻為原料，采用本實驗室所有的菌株產乳酸芽孢桿菌Bacillussp. DU-106 和植物乳桿菌Lactobacillus plantarum并加入小黃姜為輔料復合進行加工的工藝，對比了發酵前后主要活性成分變化和體內體外抗氧化活性的變化，初步對以姜為輔料發酵鮮天麻（FermentedGastrodia elatawith Ginger，FGEG）的抗氧化活性和功能性食品開發潛力進行評價。為FGEG 這種新型功能性產品的開發與應用提供技術參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮紅天麻，產地為湖北省宜昌市；小黃姜，產地為云南羅平；產乳酸芽孢桿菌Bacillussp.DU-106和植物乳桿菌Lactobacillus plantarum存放于華南農業大學新資源食品及功能性原料評價中心；GAS 和HAB（HPLC≥98%）、維生素C（HPLC≥99%），上海源葉科技生物有限公司；野生型N2 秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）（下述簡稱線蟲）和缺陷型大腸桿菌Escherichia coliOP50（下述簡稱大腸桿菌OP50），上海南方模式生物科技股份有限公司；5-氟尿嘧啶和2,,7,-二氯熒光素二乙酸酯（H2DCF-DA）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl，DPPH），美國西格瑪奧德里奇公司；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和谷胱甘肽（Glutathione，GSH）等生化分析試劑盒南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

LC-20A 高效液相色譜儀，日本島津公司；Mshot MZ101 體式顯微鏡，廣州市明美科技有限公司；SPX-150B-Z 型生化培養箱，上海博迅實業有限公司；Labserv K3型酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；HZQ-B 恒溫振蕩器，蘇州威爾實驗用品有限公司；MF53-N 熒光倒置顯微鏡，上海蔡康光學儀器有限公司。

1.3 樣品制備

姜汁的制備：取無腐爛，無蟲眼的小黃姜洗凈，切成小塊置于榨汁機中，按料液比3:100（g/mL）加入滅菌蒸餾水，榨汁1 min。過80 目篩網得到姜汁備用。

FGEG 粉制備：鮮天麻洗凈切成均勻片，放置蒸籠上蒸制5 min 后，置于榨汁機中，按料液比1:1（g/mL）加入姜汁榨汁得到勻漿。分裝至500 mL 具擋板三角搖瓶，按質量分數1%添加食用葡萄糖和食用鹽，并按質量分數0.1%接種活化好的復合菌液，封上濾菌膜，置于恒溫振蕩器中，溫度30 ℃，轉速120 r/min，發酵8 d。待發酵結束后，真空旋蒸濃縮，再低溫冷凍真空干燥、研磨，得到FGEG 凍干粉。

以姜為輔料鮮天麻 （Gastrodia elatawith Ginger，GEG）粉制備：在FGEG 粉制備未中，省略接種和發酵步驟，即得到GEG 凍干粉。

上述FGEG 粉和GEG 粉制備中的姜汁替換成滅菌一級水，分別得到天麻凍干粉和發酵天麻凍干粉。

1.4 GAS和HBA含量測定

該部分測定方法，根據《藥典》[2]的測定方法進行了部分的修改。精確稱取樣品1.00 g 置于塞錐形瓶，加入體積分數為30%乙醇50 mL 稱定質量，超聲處理（功率120 W，頻率50 kHz）30 min，再稱定質量用30%乙醇補足至原質量；用濾紙過濾殘渣后，精密量取10 mL 置于燒杯中，濃縮至無醇味轉移至25 mL 容量瓶中，用乙腈:水（3:97）溶液進行溶解和定容，混勻后過0.22 μm 有機膜裝入進樣瓶中待用。色譜條件為：色譜柱為Agilent Zorbaxsb-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；梯度洗脫（0～7 min，3%→10% A；7～16 min，10%→12% A；16～25 min，12%→95%；25～28 min，12%→3%）；檢測波長為220 nm。GAS 的出峰時間為13.593 min，HBA出峰時間為15.827 min；色譜圖見圖1；GAS 標曲y= 21 714x-14.713（R2= 0.999 8），HBA 標曲：y=40 271x-20.604（R2=0.999 9）。

圖1 標品和樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of standard and sample

1.5 多糖含量測定

參照DB 22/T 1685-2012《人參中人參多糖的測定 分光光度法》對樣品中多糖含量進行測定；其中葡萄糖標曲y=13.159x+0.020 7（R2=0.999 3）。

1.6 總酚含量測定

參照T/NAIA097-2021《枸杞中總酚含量的測定 分光光度法》對樣品中總酚含量進行測定；其中沒食子酸標曲y=5.396 9x-0.000 3（R2=0.999 7）。

1.7 體外抗氧化測定方法

該部分參照李婷等[14]、羅星等[15]的方法略有修改進行，實驗中選用維生素C 作為陽性對照。

1.7.1 DPPH自由基清除能力的測定

取1 mL 不同質量濃度的樣品于試管中，加入1 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 溶液，充分搖勻，4 000 r/min 離心6 min，靜置30 min，以無水乙醇為參比組調零，在517 nm 處測定其吸光度（AS）。對照組用無水乙醇替代DPPH 溶液；空白組用無水乙醇替代樣品溶液。每組樣品重復3 次，按照式（1）計算DPPH 自由基清除率。

式中：

Y——自由基清除率，%；

As——樣品吸光值；

Ac——對照組吸光值；

A0——空白組吸光值。

1.7.2 羥自由基清除能力的測定

取1 mL 不同質量濃度的樣品于試管中，依次加入6 mmol/L 的FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各1 mL，搖勻后靜置10 min，再加入6 mmol/L 的水楊酸1 mL，搖勻后室溫避光靜置30 min，在510 nm測其吸光度，空白組用蒸餾水替代樣品，對照組用蒸餾水替代水楊酸，按照羥自由基的清除率按式（1）計算。

1.7.3 總還原能力

取1 mL 不同質量濃度的樣品于試管中，依次加入pH 值為6.6 磷酸鹽緩沖液和質量分數為5%K [Fe(CN)] 溶液各1 mL，搖勻后于50 ℃下水浴20 min，再加入質量分數為10% 的三氯乙酸溶液1 mL，充分搖勻后以3 000 r/min 離心10 min，取上清液2.5 mL，加入等體積的蒸餾水和質量分數為0.1%的FeCl3溶液，搖勻后靜置10 min，在700 nm測其吸光度，空白組用無水乙醇替代樣品稀釋液。還原能力按式（2）計算。

式中：

X——樣品總還原力；

Ai——樣品吸光值；

Aj——空白組吸光值。

1.8 體內抗氧化測定

線蟲相關試驗參照Won 等[16]、嚴靜等[17]、安苗青等[18]的方法稍有進行修改。

1.8.1 線蟲培養

本實驗所用線蟲均為經過高氯酸鈉漂白裂解法進行同期化處理的L4 期線蟲。培養采用線蟲生長培養基（Nematode Growth Medium，NGM），在表面涂布有大腸桿菌OP50 作為線蟲食物，置于20 ℃恒溫恒濕培養箱中培養。各實驗組不同樣品在試驗前12 h 滴在NGM 以備使用。

1.8.2 樣品制備

分別稱量3 g FGEG 凍干粉和GEG 凍干粉，溶于40 mL 蒸餾水中，渦旋5 min 使得充分溶解，與活化后的大腸桿菌OP50 菌液按照1:2、1:1、2:1比例混合，得到25 mg/mL（低劑量組，FGEGL）、37.5 mg/mL（中劑量組，FGEGM/GEGM）、50 mg/mL（高劑量組，FGEGH）的樣品?？瞻捉M則用蒸餾水:大腸桿菌OP50 菌液按1:1 進行配比。

1.8.3 正常和急性應激環境壽命試驗

正常環境下壽命試驗：隨機挑取同期化至L4 期的線蟲到各組NGM 上（每組5 個平板，每個平板20 條線蟲）。從轉移時刻起記錄各組線蟲的存活天數，每24 h 轉移線蟲至新NGM 中，產卵期結束后可每兩天轉一次。每天記錄線蟲存活和死亡數并將死亡的蟲挑出，當所有組別中的線蟲均死亡時，則實驗結束。實驗重復3 次。

H2O2氧化應激試驗：隨機挑取同期化的L4 期線蟲到各組NGM 上（每組5 個平板，每個平板20條）繼續干預7 d，試驗開始時，轉移至按體積比加入0.05%φ=30%的H2O2并且不含大腸桿菌OP50的NGM 中，每隔1 h 記錄線蟲的存活及死亡個數，并繪制生存曲線，直至所有線蟲死亡。實驗重復3 次。

紫外和熱應激試驗：隨機挑取同期化的L4 期線蟲到各組NGM 上（每組5 個平板，每個平板20 條）繼續干預7 d，轉移到不含大腸桿菌OP50 的NGM中，分別放置在紫外照射環境和37 ℃恒溫環境中培養，每隔2 h 記錄線蟲的存活及死亡個數，并繪制生存曲線，直至所有線蟲死亡。實驗重復3 次。

1.8.4 線蟲體內抗氧化酶和MDA測定

隨機挑取同期化L4 期線蟲至各組NGM 上，干預7 d，用M9 緩沖溶液沖洗培養皿并收集各板上的成蟲。冷凍研磨后離心，取上清得到線蟲勻漿，參照相關試劑盒進行SOD、CAT、GSH-Px 活力和MDA 含量的測定，并用BCA 蛋白試劑盒測定上清液中蛋白質濃度進行標準化。實驗重復3 次。

1.8.5 線蟲體內活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）測定

隨機挑取同期化L4 期線蟲至各組NGM 上，干預7 d，用M9 緩沖溶液沖洗培養皿并收集各板上的成蟲。冷凍研磨后離心，取上清備用。吸取50 μL上清液和50 μL H2DCF-DA于96孔板中避光混勻后，在激發波長485 nm、發射波長530 nm 的熒光顯微鏡下每20 min 進行1 次熒光強度測定。連續測定8 次，并用BCA 蛋白試劑盒測定上清液中蛋白質濃度進行相對熒光強度標準化處理。實驗重復3 次。

1.8.6 線蟲體內脂褐質水平測定

隨機挑取同期化的L4 期幼蟲到新的各組培養板上（每組4 個平板，每個平板20 條）干預7 d，用質量分數為0.1%疊氮化鈉溶液將其麻醉，隨即轉移載玻片蓋上蓋玻片，通過熒光倒置顯微鏡（激發波長365 nm、發射波長420 nm）獲取熒光圖像并用Imgage J 軟件對熒光強度和線蟲表面積進行數據化處理和分析得到脂褐質相對熒光強度。實驗重復3 次。

1.9 數據分析

文中數據均使用“平均值±標準差”表示，統計分析通過軟件SPSS 26.0 中t檢驗和單因素分析完成，P＜0.05 為具有差異性。

2 結果與分析

2.1 益生菌發酵前后姜制天麻活性成分變化

不同加工工藝對天麻主要活性成分含量的影響實驗結果見表1，結果顯示，加姜對天麻的主要活性成分不產生影響（P＞0.05）。發酵不加輔料姜能夠顯著提高（P＜0.05）HBA、多糖、總酚的含量，但使得GAS 含量顯著降低（P＜0.05）。發酵姜制天麻，相較于天麻和未發酵姜天麻，HBA、多糖、總酚的含量顯著提高（P＜0.05 或P＜0.01），GAS 含量略有下降但不呈現顯著性差異（P＞0.05）。在趙敏等[12]研究中，干天麻粉經酵素化后，其HBA 含量相較于未發酵樣品提高了1.82 倍。在蔡倪等[13]采用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌對天麻粉進行發酵，相較于未發酵樣品HBA 含量提高了2.57 倍。本實驗中FGEG 相較于GEG，HBA 含量提高了2.54 倍，與先前的研究具有一致性。實驗結果表明，益生菌發酵姜制天麻能夠顯著提高（P＜0.05）天麻的HBA 和總酚含量。這可能是由天麻中的巴利森苷物質在微生物作用下發生轉化有關[12,13]，后續研究中可通過測定FGEG 中的巴利森苷物質的含量論證是否由其轉化至的HBA 含量提升。

表1 不同加工工藝對天麻主要活性成分含量的影響Table 1 Effects of different processes on the content of main active components of Gastrodia elata (mg/g)

2.2 FGEG體外抗氧化實驗結果

DPPH 是一種穩定的自由基，其醇溶液在波長為517 nm 下具有最大吸收，當遇到自由基清除劑能夠使得在最大吸收波長處的吸光值下降。DPPH自由基清除、羥自由基清除和總還原能力法常用于測定生物試樣的體外抗氧化能力[19,20]。由圖2 可知在7.5～37.5 mg/mL 質量濃度范圍內的GEG 和FGEG 樣品的DPPH 自由基清除能力（圖2a）、羥自由基清除能力（圖2b）、總還原能力（圖2c）都隨著隨樣品質量濃度的增加而增強，呈現出劑量依賴效應。其中FGEG 和GEG 總還原力的半數有效量IC50為9.51、10.91 mg/mL，表明FGEG 的抗氧化活性高于GEG。在相同質量濃度下，FGEG 抗氧化能力都要顯著強于GEG（P＜0.05 或P＜0.01），這可能與FGEG 的總酚含量高于GEG 有關。大量研究證明[9]，酚類物質具有較強的抗氧化活性。在趙敏等[21]的研究中，經過益生菌發酵干天麻體外抗氧化活性顯著提升，與本實驗的結果較為一致。結果表明經過益生菌發酵對姜制天麻的體外抗氧化活性得到提升。

圖2 FGEG 和GEG 體外抗氧化實驗結果Fig.2 Results of in vitro antioxidant experiments of FEGE and GEG

2.3 FGEG體內抗氧化實驗結果

2.3.1 FGEG對線蟲正常條件下和急性應激條件下壽命的影響

線蟲的壽命是評價樣品干預下發揮體內抗氧化活性的重要指標[22,23]。FGEG 和GEG 對線蟲壽命的影響結果如圖3a 所示，與空白組相比，FGEG 各劑量組干預后均顯著提高了（P＜0.05 或P＜0.01），并呈現劑量依賴效應。其中，FGEG 低、中、高劑量組線蟲的平均壽命分別延長了28.21%、34.17%和36.15%。并且FGEG 各劑量組對于延長線蟲的壽命優于GEGM。結果表明，FGEG 能夠有效地正常生長條件下延長線蟲壽命，具有一定的抗衰老、抗氧化活性。

圖3 FGEG 對線蟲急性應激能力的影響Fig.3 Effects of FGEG on acute stress ability of C. elegans

在正常情況下，線蟲機體內ROS 產生和去除的速率是平衡，當受到急性環境的刺激，機體會產生大量自由基發生氧化反應，破壞細胞從而導致壽命的縮短[24,25]。因此常用急性環境下的線蟲壽命評價其應對急性應激能力。FGEG 對線蟲急性應激能力的影響結果如圖3b、3c 和3d 所示。在三個應激實驗中，與空白組相比，FGEG 各劑量組的曲線明顯向右移動，線蟲平均壽命顯著提高（P＜0.05 或P＜0.01）。在紫外應激實驗中，FGEG 低、中、高劑量組，相較于空白組平均壽命分別能夠提高13.03%、16.19%、18.52%。在熱應激實驗中，FGEG 低、中、高劑量組，相較于空白組平均壽命分別能夠提高11.79%、26.21%、28.43%。在H2O2應激實驗中，FGEG 低、中、高劑量組，相較于空白組平均壽命分別能夠提高61.21%、73.35%、77.76%。在三個應激實驗中，FGEG 各劑量組優于未發酵對照組。綜上，FGEG能夠提高線蟲對不良環境的耐受性和抗氧化應激的能力，說明FGEG 中具有優良抗氧化和自由基清除能力的活性物質。在李紅丹等[26]的研究中，相較于空白組益生菌發酵的大豆酸奶具有能夠延長線蟲壽命和提高線蟲抗急性氧化應激能力，與本實驗中實驗結果具有一致性。

2.3.2 FGEG對線蟲體內抗氧化相關指標的影響

ROS 是導致衰老的重要因素之一[27]，體內ROS的清除有賴于各種抗氧化酶作用，當ROS 過度積累會導致機體氧化系統失衡造成一系列的氧化損傷。FGEG 對線蟲體內抗氧化相關指標的影響結果如圖4。與空白組相比，FGEG 各劑量組能夠使得線蟲的ROS 相對含量顯著降低（P＜0.001）和抗氧化酶CAT 和GSH 含量顯著提高（P＜0.001），并呈現出劑量依賴效應。相比于GEG 對照組，FEGE 更加顯著抑制了線蟲體內的ROS 積累和提升抗氧化酶活性。MDA 是評價線蟲氧化損傷的重要指標。FGEG 對線蟲體內MDA 含量的影響結果如圖4d，與空白組相比，FGEG 各劑量組干預線蟲的MDA 相對含量極其顯著降低（P＜0.001）。結果表明經過FGEG 干預能夠清除衰老線蟲體內的自由基，減少氧化損傷從而達到抗氧化效果，說明FGEG 具有良好的抗氧化活性。

圖4 FGEG 對線蟲抗氧化相關指標影響Fig. 4 Effects of FGEG on antioxidant related indexes in C. elegans

2.3.3 FGEG對線蟲體內脂褐質水平的影響

脂褐素是線蟲機體衰老過程中細胞損傷的標志物，其積累水平可以進一步反映線蟲的衰老狀況[18]。FGEG 對線蟲體內脂褐素的影響如圖5 所示，與空白組相比，FGEG 各劑量組的熒光強度較弱，表明線蟲體內的脂褐素含量具有明顯的差異。對圖片進行量化處理見圖5f，與空白組和GEGM 相比，FGEG 各劑量組線蟲體內脂褐質水平顯著降低（P＜0.001）。結果表明FGEG 能夠顯著減少氧化對機體的造成地損傷。線蟲體內MDA 與脂褐素有著密切的關系。在機體中發生氧化應激產生MDA，MDA 會損害細胞產生脂褐素，脂褐素積累會損害細胞造成氧化應激，這樣就形成了“雪崩效應”導致加快衰老[28,29]。在本文2.3.2 中經過FGEG 干預后的線蟲體內MDA 含量相較于空白組顯著減少，這與脂褐素實驗結果具有一致性。

圖5 FGEG 對線蟲脂褐素含量的影響Fig.5 Effects of FGEG on lipofuscin content in C. elegans

綜上線蟲實驗結果，FGEG 能夠延長線蟲在正常狀態和急性環境下的壽命，提高線蟲體內CAT 活性和GSH 含量，降低線蟲體內ROS 含量和減輕氧化損傷，并呈現一定劑量依賴效應。與未發酵對照組相比，FGEG 的體內體外抗氧化活性顯著提高。FGEG 具有表現出良好的抗氧化活性，可能與發酵后HBA 含量提高存在一定的聯系。在Liu 等[6]研究中，HBA 可使N2 線蟲的正常生產條件下的平均壽命延長25%以上以及提高了線蟲在急性環境下的存活率。與本文的實驗結果具有一致性?，F代藥理研究發現，HBA 改善對失眠[30]、退行性神經疾病[6]、大腦損傷[31]等方面有重要的作用。在余星霖等[32]研究中，能夠改善腦缺血造成損傷。在Liu 等[6]的研究中HBA 能夠抗壓能力和預防與衰老相關的疾病。這為FGEG 下一步的研究指明了方向。

抗氧化活性是評價功能性食品和保健食品活性的重要指標，不僅對其功能活性的評價至關重要，而且能夠提高對研究其在預防和治療與氧化應激相關的疾病方面的效率。綜合體內體外抗氧化數據表明，FGEG 具有較好的抗氧化活性，具有成為功能性食品和保健食品潛力。

3 結論

本文采用產乳酸芽孢桿菌Bacillussp.DU-106和植物乳桿菌Lactobacillus plantarum復合菌種發酵姜制天麻，有效提高了天麻中HBA 和總酚含量，相較于未發酵對照組分別增加了2.54 倍和1.74倍。在體外體內抗氧化活性實驗發現，發酵后樣品DPPH 自由基清除能力、羥自由基清除能力和總還原力顯著提升。FGEG 能夠延長正常生長條件下和急性應激條件下線蟲的壽命，同時降低線蟲體內活性氧自由基含量和提高抗氧化酶活力，并減輕氧化應激損傷。本研究為姜制和發酵復合加工鮮天麻的功能活性開發和利用提供了理論基礎，也為鮮天麻的深加工提供一項新的工藝。FGEG 表現出具有較好的抗氧化活性，后期研究中應抓住發酵后能夠提高天麻中HBA 的含量這一特點，結合HBA 的藥理活性進一步深入開發FGEG 的功能活性，進一步深入研究天麻姜制和發酵復合加工過程中的目標代謝產物，為促進天麻的深加工發展提供理論支撐。