植物乳植桿菌類胡蘿卜素生物合成關鍵基因LpispA的功能鑒定

李舒麗，謝卓婷，沈潤澤，郭麗瓊,2，林俊芳,2，陳謀通，葉志偉,2*

（1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642）

（2.廣東省微生態制劑工程技術研究中心,廣東廣州 510642）

（3.廣東省科學院微生物研究所,華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，農業農村部農業微生物組學與精準應用重點實驗室,廣東廣州 510070）

類胡蘿卜素（Carotenoids）是由高等植物、微生物和藻類等合成的一大類類異戊二烯代謝物[1-3]。迄今為止，已在自然資源中發現了1 200 多種類胡蘿卜素，包括烴類的胡蘿卜素和含氧的葉黃素[4,5]。類胡蘿卜素具有抗衰老和抗腫瘤等多種活性功能，適量攝入該化合物可以有效防止機體細胞和組織受到氧化損傷，提高機體免疫系統能力[6-8]。目前，類胡蘿卜素已被廣泛應用于醫藥保健、食品著色、飼料營養補充和化妝品生產等多個領域[9]。據美國商務通訊公司（Business Communications Company，BCC）的市場調研報告稱，商業應用類胡蘿卜素的全球市場價值預計到2027 年將突破27 億美元關口，2022 年至2027 年的復合年增長率為5.7%[10]。

隨著生物功能技術的發展和人們食品安全意識的提高，相對于植物提取法和化學合成法，人們更青睞于通過合成生物學等手段構建微生物細胞工廠生產的新型和高安全性類胡蘿卜素。研究顯示，具有“公認安全”（Generally Regard As Safe，GRAS）地位的植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）在其代謝過程中能產生C30類胡蘿卜素、細菌素、胞外多糖和葉酸等多種有益物質[11-13]。各種類胡蘿卜素的生物合成途徑是了解生物的次生代謝演變的一個典型系統[14]。盡管目前已鑒定出各種C30類胡蘿卜素，但由于缺乏組學數據和胡蘿卜素基因的功能鑒定從而限制了對植物乳植桿菌甚至乳酸菌的類胡蘿卜素合成途徑的研究。法尼基焦磷酸（Farnesyl Pyrophosphate，FPP）和牻牛兒基牻牛兒焦磷酸（Geranylgeranyl Pyrophosphate，GGPP）分別是C30和C40類胡蘿卜素的直接前體，Matthews等[15]和Lois 等[16]研究發現，前體物質的合成是類胡蘿卜素合成代謝途徑中的限速步驟甚至是“瓶頸”。FPP 是由FPP 合成酶（FPP Synthase，ispA）催化異戊烯基焦磷酸（Isopentenyl Pyrophosphate，IPP）和二甲丙烯基焦磷酸（Dimethylallyl Pyrophosphate，DMAPP）縮合而成的，再經GGPP 合成酶（GGPP Synthase，crtE）進一步催化形成GGPP。因此，前體物質合成酶性質的研究對深入解析類胡蘿卜素合成的分子機理和調控機制都至關重要。

項目組Ye 等[17]的前期轉錄組分析表明，海洋源植物乳植桿菌菌株Lp10 含有類胡蘿卜素生物合成的基因簇。本研究對植物乳植桿菌FPP 合酶基因LpispA進行了克隆、繪制系統進化樹和構建類胡蘿卜素合成顏色功能互補的大腸桿菌表達系統pAC-BETA Δ E-ispA，利用紫外可見光譜（Ultraviolet-Visible Spectroscopy，UV-Vis）和反相高效液相色譜（Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC）檢測產物成分來驗證基因的功能，為探究植物乳植桿菌類胡蘿卜素生物合成機制及為高效合成新的類胡蘿卜素奠定理論基礎，有望進一步推進應用植物乳植桿菌作為類胡蘿卜素補充劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

植物乳植桿菌Lp10 菌株由所在研究組實驗室從海帶中分離純化并保存；質粒pAC-BETA 由所在研究組保藏；大腸桿菌DH5α購買于大連TaKaRa公司。

1.1.2 主要的試劑和儀器

細菌基因組DNA 提取試劑盒購買于TIANGEN公司；ClonExpress II 一步克隆試劑盒和Phanta Max超保真DNA 聚合酶購買于Vazyme 公司；限制性內切酶SpeI、NdeI 購買于大連Takara 公司。

高效液相色譜儀LC-2030（日本，株式會社島津制作所）；紫外可見分光光度計UV-2802PC（上海，尤尼科）；高速冷凍離心機5804R（德國，Eppendorf）；MJ Mini PCR 儀（美國，BIO-RAD）；GelDoCTMXR ＋凝膠快速成像系統（美國，BIORAD）。

1.1.3 引物

本文所用引物如表1 所示。

表1 基因擴增的引物序列Table 1 Primer sequences for gene amplification

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因擴增

以試劑盒提取的植物乳植桿菌Lp10 菌株的基因組DNA 為模板，設計引物ispA-F&R（表1），擴增LpispA基因的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）序列。反應體系（50 μL）：模板200 ng，上下游引物各2 μL（0.4 μmol/L），Phanta Max 1 μL，dNTPs 1 μL，2×PCR buffer 25 μL，加超純水至50 μL。擴增條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃30 s，30 個循環；4 ℃保存。以質粒pAC-BETA 為模板，設計引物pAC-IBY-F&R，反向擴增線性化片段pAC-IBY，反應體系與上述LpispA基因擴增相同；擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃5 min，30 個循環；4 ℃保存。PCR 產物用1%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶并使用瓊脂糖凝膠DNA 純化回收試劑盒（MAGEN）回收目的片段并進行測序比對。

1.2.2 ispA系統進化樹的構建

用MEGA 軟件（7.0）對本研究中獲得的植物乳植桿菌LpispA基因推斷的氨基酸序列以及從GenBank 檢索的相關物種（包括植物、藻類、細菌和藍細菌）的氨基酸序列進行比對，采取鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹。

1.2.3LpispA基因功能互補表達載體的構建

植物乳植桿菌LpispA基因的功能互補表達質粒pAC-BETAΔE-ispA 的構建路線如圖1 所示。用ClonExpress II 一步克隆試劑盒將目的片段LpispA和pAC-IBY 連接，然后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，于含氯霉素 （30 μg/mL）的LB（10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g 氯化鈉，1 L 超純水，pH 值7.0）平板中37 ℃培養過夜，用引物check-F&R進行PCR 驗證。挑選擬轉化子并于含30 μg/mL 氯霉素的LB 液體培養基中37 ℃、200 r/min 下擴大培養，提取質粒進行雙酶切（SpeI 和NdeI）檢驗，并送至公司測序分析。將正確的重組質粒命名為pACBETAΔE-ispA。

圖1 重組載體pAC-BETAΔE-ispA 的構建路線Fig.1 Structure route of recombinant vector pAC-BETAΔE-ispA

1.2.4 轉化子色素的提取

參照葉志偉[18]的方法，將含有質粒pAC-BETA、pAC-BETA Δ E-ispA 和空載體的大腸桿菌工程菌株分別接種于LB 液體培養基，37 ℃、200 r/min 黑暗培養36 h。每個樣品取兩份培養物各50 mL，一份用于轉化子色素的提取，具體操作如下：a）將50 mL發酵液于4 ℃，10 000 r/min 離心5 min，棄上清液；b）用超純水重新懸浮沉淀的大腸桿菌細胞，短暫離心棄上清液；c）加入2 mL 丙酮，渦旋振蕩分散沉淀物；d）在55 ℃水浴中處理15 min，每隔5 min 振蕩一次；e）4 ℃，10 000 r/min 離心20 min 后，收集含有色素的上清液；f）離心所得的細胞沉淀物再按步驟c～e 處理一次；g）收集所有上清液并用丙酮定容至5 mL，-80 ℃保存（類胡蘿卜素易光解，色素提取過程中應避光處理）。另一份用于測定細胞干重，具體操作如下：①重復以上步驟a～b；②將細胞在65 ℃下避光干燥處理至恒重（約24 h），稱重。

1.2.5 色素提取物的UV-Vis和RP-HPLC分析

使用UV-Vis 波長掃描提取液以獲得350～800 nm光譜范圍內的光吸收情況。確定最大吸收波長后，參照Inbaraj 等[19]的方法，通過RP-HPLC 對各色素溶液進行定性和定量。色譜條件為：色譜柱，J&K Scientific C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相，甲醇:乙腈: CH2Cl2=85:12:3（V/V/V）（含0.4 g/L抗壞血酸）；流速，1 mL/min；柱溫，30 ℃；進樣量，20 μL。分析過程中使用標準加入法，即在各樣品中加入一定量的β-胡蘿卜素標準品（Solarbio）對提取液進行目的物質β-胡蘿卜素的定性，利用β-胡蘿卜素標準品試驗繪制的校準曲線進行定量分析。

1.2.6 數據分析

根據樣品中類胡蘿卜素的質量濃度和細胞干重，計算每克細胞干重的β-胡蘿卜素含量（mg/g DCW）。每個樣品設置3 個平行，實驗數據采用平均數±標準差表示。使用Graphpad Prism 8.0.2 軟件構建圖形，當P＜0.05 時為顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 LpispA基因和pAC-IBY片段克隆及純化

對植物乳植桿菌Lp10 的LpispA基因和質粒pAC-BETA 中的pAC-IBY 片段進行克隆及純化，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2 所示，可發現前者在800～1 200 bp 處有顯著的單一條帶，與LpispA基因ORF 序列891 bp 預期大小一致（圖2a），后者在10 000 bp 左右處有明顯的單一條帶，與pACIBY 片段9 685 bp 預期大小一致（圖2b）。擴增產物的測序結果表明，LpispA基因ORF 序列和pACIBY 片段均已被成功克隆。

圖2 LpispA 和pAC-IBY 的PCR 擴增Fig.2 PCR amplification for LpispA and pAC-IBY

2.2 LpispA的系統發育分析

利用植物、藻類、細菌和藍細菌等4 個類群的氨基酸序列構建LpispA 系統進化樹（圖3）。系統進化樹中，紅色三角形標記顯示了植物乳植桿菌LpispA 在系統樹上的位置，其它物種氨基酸序列的GenBank 登陸號顯示在相應每個物種名稱后面。系統進化樹表明植物乳植桿菌與桃色歐文氏菌（Erwinia persicina）遺傳距離最近，經過逐層匯聚，相對與藻類和植物等遺傳距離較遠。表明在所選的物種中，植物乳植桿菌與細菌分類中的桃色歐文氏菌親緣關系最近，與藍細菌次之，與藻類和植物的親緣關系最遠。

圖3 基于FPP 合成酶（ispA）氨基酸序列NJ 法構建的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of farnesyl pyrophosphate synthase (ispA) based on the amino acid sequences by the neighbor-joining method

2.3 pAC-BETAΔE-ispA重組載體的構建

對構建的重組載體pAC-BETAΔE-ispA 進行雙酶切鑒定，結果如圖4 所示，酶切出兩條條帶，亮度清晰，大小分別與線性化載體pAC-IBY 和目的基因LpispA一致。對重組質粒進行測序分析鑒定，結果顯示重組載體pAC-BETAΔE-ispA被成功構建。

圖4 pAC-BETAΔE-ispA 重組載體雙酶切驗證Fig.4 Identification of recombinant vector pAC-BETAΔEispA by double enzyme digestion

2.4 轉化子類胡蘿卜素含量的測定

低溫離心收集含質粒pAC-BETA（陽性對照）、pAC-BETAΔE-ispA 和空載體（陰性對照）構建的大腸桿菌工程菌株的細胞（圖5a），再用丙酮提取菌體中的色素（圖5b）。其中，陽性對照含有源自細菌的β-胡蘿卜素生物合成基因簇的質粒，菌體β-胡蘿卜素沉著，細胞呈現橙黃色。結果顯示，構建的LpispA基因功能互補表達工程菌株及其提取的色素顏色皆顯淺橙黃色，對比陽性對照顏色稍淺，但深于陰性對照（圖5）。對提取到的色素進行UV-Vis 波長掃描測量，轉化子與β- 胡蘿卜素標準品的色素樣品皆呈現類胡蘿卜素紫外可見光吸收圖譜的典型三指吸收峰結構，其最大吸光度在450 nm（圖6a）。利用RP-HPLC 進行定性定量分析，結果顯示，pAC-BETAΔE-ispA 組、β-胡蘿卜素標準品組以及pAC-BETAΔE-ispA+組（添加了β-胡蘿卜素標準品）均在保留時間43.90 min 下有相似的色譜峰出現，說明pAC-BETAΔE-ispA 組細胞合成了β-胡蘿卜素（圖6b）。由β-胡蘿卜素標準品制備的校準曲線進行定量，結果顯示轉化子pACBETA，pAC-BETAΔE-ispA 的β- 胡蘿卜素含量分別為0.80 mg/g DCW 和0.05 mg/g DCW，差異顯著（P＜0.05）（圖7）。實驗組的β-胡蘿卜素含量較對照組低，推測可能的原因是對照組pAC-BETA質粒的類胡蘿卜素功能酶基因來源于單一物種，而實驗組pAC-BETAΔE-ispA 為重組質粒，其中來源于不同物種的類胡蘿卜素功能基因組合在異源表達代謝通路中，容易出現基因表達和酶活性失衡[20]，不平衡的碳通量易導致中間產物的積累，從而降低系統合成效率[21]，而且可能產生對宿主生長不利的中間產物[22]。

圖5 轉化子和提取色素的顏色分析Fig.5 Colors analysis of transformants and extracted pigments

圖6 色素提取物的UV-Vis 和RP-HPLC 分析圖譜Fig.6 Chromatogram of pigment extracts by UV-Vis and RP-HPLC

圖7 轉化子的β-胡蘿卜素含量Fig.7 β-carotene content of transformants

2.5 細菌類胡蘿卜素的潛在生物合成途徑

質粒pAC-BETA 含有來自草生歐文氏桿菌的β-胡蘿卜素生物合成基因簇，包括GGPP 合成酶基因crtE、番茄紅素環化酶基因crtY、八氫番茄紅素脫氫酶基因crtI和八氫番茄紅素合成酶基因crtB。含有該質粒的大腸桿菌培養物可通過β-胡蘿卜素的積累而顯現黃色表型[23]。依據以上實驗結果，植物乳植桿菌FPP 合成酶基因LpispA在構建的大腸桿菌功能互補表達系統中成功表達并使宿主細胞產生β-胡蘿卜素，實現了對草生歐文氏桿菌GGPP 合成酶基因crtE的功能替換，為類胡蘿卜素合成多功能酶，實現在C40類胡蘿卜素合成路徑中替換crtE的缺失。Armstrong 等[24]研究發現，ispA 與crtE 的氨基酸序列在系統發育分析上具有較高的同源性。Miguel 等[25]研究表明，玉米胚乳中的FPP 合成酶具有GGPP 合成酶的功能活性，既影響FPP 的產量，也對GGPP 形成產生作用。通過定位突變等處理改變微生物中酶的鏈長決定區域（CLDR）或其它區域的氨基酸序列，可實現FPP 合成酶與GGPP 合成酶的功能互相轉化。Ohnuma 等[26]利用化學誘變法將熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearather mopbilus）的FPP 合成酶成功轉化為GGPP 合成酶。Ohnuma等[27]通過定點突變的方式在古細菌中將GGPP 合成酶基因轉變為了能表達FPP 合成酶的基因。Kawasaki等[28]的研究表明灰孢鏈霉菌（Streptomyces griseolosporeus）中突變的GGPP 合成酶和FPP 合成酶可分別產生FPP 和GGPP。細菌類胡蘿卜素的合成一般是經由甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）途徑[29]，結合本實驗結果推測出細菌類胡蘿卜素的潛在生物合成途徑如圖8 所示。

圖8 細菌類胡蘿卜素的潛在生物合成途徑Fig.8 The potential biosynthetic pathway for carotenoids in bacteria

在MVA 途徑中，2 分子乙酰輔酶A（Acetyl-Coenzyme A，Acetyl-CoA）經縮合形成3 羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-Coenzyme A，HMG-CoA），接著在HMG-CoA 還原酶（HMG Reductase，HMGR）的作用下生成甲羥戊酸。甲羥戊酸再經多個相關酶的催化下合成前體物質IPP（C5），及在IPP 異構酶idi（IPP Isomerase）的作用下生成其同分異構體DMAPP。在C30類胡蘿卜素合成途徑中，反應起始于IPP 與DMAPP 在ispA 作用下的縮合生成前體物質FPP（C15）；2 分子的FPP 在脫氫角鯊烯合成酶crtM 的作用下生成C30類胡蘿卜素diapophytoene，再經脫氫酶crtN 催化生成diaponeurosporene（C30）。在C40類胡蘿卜素合成途徑中，FPP 經crtE/ispA 催化合成前體物質GGPP（C20）；2 分子的GGPP 在八氫番茄紅素合成酶crtB 的作用下生成無色的八氫番茄紅素phytoene（C40），再由八氫番茄紅素脫氫酶crtI 和番茄紅素環化酶crtY 催化去飽和環化反應最終生成β-胡蘿卜素。

3 結論

本論文利用植物乳植桿菌LpispA基因功能替換質粒pAC-BETA 的crtE基因，構建了基于植物乳植桿菌LpispA基因的大腸桿菌功能互補表達系統pAC-BETAΔE-ispA，通過UV-Vis 和RP-HPLC 法測定含重組質粒pAC-BETAΔE-ispA 大腸桿菌工程菌株的類胡蘿卜素生物合成，驗證了LpispA 的功能。結果表明，構建的大腸桿菌工程菌株pAC-BETAΔE-ispA具有β-胡蘿卜素合成功能，推測LpispA功能性替代了crtE的作用而合成C40β-胡蘿卜素的前體物質GGPP，LpispA 為首次在植物乳植桿菌合成的類胡蘿卜素途徑中發現底物特異性變寬的酶，為類胡蘿卜素合成多功能酶。本研究構建的LpispA基因功能互補的大腸桿菌表達系統，為植物乳植桿菌類胡蘿卜素的生物合成機制研究提供了實驗基礎，有利于推動植物乳植桿菌作為類胡蘿卜素補充劑的應用，擴充了利用異源系統工程菌株生產更多新型的高價值的化合物所需的基因庫。