不同貯藏溫度下稻花雞肉優勢腐敗菌變化及Arrhenius貨架期預測模型的建立

劉夢竹，徐志宏,，魏琦麟，涂杜，康樺華*

（1.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心,廣東肇慶 526238）

（2.廣東省農業科學院動物衛生研究所,農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站,廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室,廣東廣州 510640）

稻花雞又名雪花雞，屬靈山彩鳳雞種，是靈山香雞與野山雞經過30 多年雜交選育而成的獨特品種[1]，其肌肉組織發達，煮熟后皮脆，脂肪少，口感細膩，雞味濃郁，是廣東地區制作白切雞等菜肴的重要原料[2]。雞肉的營養豐富，適合微生物生長繁殖，因此雞肉在貯藏過程中易發生腐敗變質，貨架期縮短，影響消費者的安全健康[3-5]。雞肉的貯藏時間、溫度、包裝氣體組成是其腐敗變質的重要因素[6-8]，導致食品腐敗變質的微生物即腐敗菌是影響肉制品腐敗變質的重要因素[9,10]。在活雞下架生鮮雞上市的政策下，有關稻花雞肉在不同貯藏溫度下貨架期的研究未見報道，因此研究雞肉在加工、運輸、貯藏和銷售等環節中優勢腐敗菌和菌落總數的變化，建立準確可靠的貨架期預測模型，監控雞肉貯藏過程中品質及微生物變化能夠降低雞肉腐敗變質的風險[11-13]，對稻花雞行業的發展具有極顯著的現實意義和實用價值。

本文前期高通量測序研究稻花雞肉在不同貯藏溫度下細菌組成多樣性的結果表明，不同貯藏溫度后期雞肉的優勢腐敗菌均為假單胞菌屬（Pseudomonas）和沙雷氏菌屬（Serratia）[14]，本研究在此基礎上，純化與鑒定優勢腐敗菌，根據鑒定結果探究25 ℃常溫保存、4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏過程中優勢腐敗菌及菌落總數的變化情況；以菌落總數和兩種優勢腐敗菌為關鍵品質因子建立Arrhenius 方程，構建稻花雞肉貨架期預測動力學模型。通過構建的菌落總數貨架期預測模型、假單胞菌貨架期預測模型、沙雷氏菌貨架期預測模型，監控稻花雞肉的品質變化，為稻花雞肉的安全貯藏提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 原料

生鮮稻花雞（每只約1.95 kg），恩平興宇生態農業有限公司；生鮮托盤，桐城市陽光塑業有限公司；25 m×20 cm 聚乙烯保鮮膜，佳能食品級保鮮膜；分析純甘油，國藥集團化學試劑有限公司；假單胞菌CFC 選擇性培養基及添加劑（PseudomonasCFC Selective Agar），青島日水生物技術有限公司；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（Violet Red Bile Glucose Agar）培養基、營養瓊脂（Nutrient Agar）、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water），廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設備

FJ300-SH 均質機，上海標本模型廠；GQZ60-02XG 控溫型保鮮箱，天津捷勝東輝保鮮科技有限公司定制；HWS 智能型恒溫箱，寧波江南儀器廠制造；5Q6892 威瑪德溫濕度檢測儀，廣州威德瑪環境儀器有限公司；BCD-648WDBE 海爾冰箱，海爾集團；YC-395L 2～8 ℃醫用冰箱，中科美菱生物醫療有限公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LRH 生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

購買于恩平興宇生態農業有限公司的稻花雞為當天凌晨屠宰的生鮮稻花雞，均已度過僵直期。預先紫外殺菌生鮮托盤和保鮮膜，雞的外包裝酒精消毒后迅速放入超凈臺中，用滅菌后的手術刀無菌割取完整雞胸和雞腿肉，每個預先消毒的生鮮托盤放置一塊完整雞胸肉和一只雞腿，用保鮮膜覆蓋托盤包裝[15]，根據不同的實驗要求分別置于25、4 和0 ℃貯藏。實驗完成后，取雞胸肉與雞腿肉1:1 混合樣本進行菌落總數的測定、假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬的鑒定與測定。

1.3.2 假單胞菌屬篩選及純化鑒定

參考SN/T 4044-2014 《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計數方法》，方法略作修改。稱取0 ℃冰溫貯藏8 d 的稻花雞肉25 g，置于盛有225 mL 滅菌生理鹽水錐形瓶中，8 000～10 000 r/min 均質2 min。10 倍系列稀釋，選擇3 個適宜稀釋度樣品均液，各取0.1 mL 接種到CFC 平板，涂布均勻，（25±1） ℃培養（44±4） h，挑選特征菌落進行氧化酶試驗驗證。挑選氧化酶陽性菌落，接種至LB 液體培養基中，（25±1） ℃培養（44±4） h 后劃線CFC 培養基，（25±1） ℃培養（44±4） h，挑選特征菌落進行氧化酶試驗，反復純化6 代，進行鑒定。

1.3.3 腸桿菌科沙雷氏菌屬篩選及純化鑒定

參考GB 4789.41-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗》，方法略作修改。稱取0 ℃冰溫貯藏8 d 的稻花雞肉25 g，置于盛有225 mL BPW 錐形瓶中，8 000～10 000 r/min 均質2 min。10 倍系列稀釋，選擇3 個適宜稀釋度樣品均液，各取1 mL 分別加入無菌培養皿中，每皿傾注15 mL VRBGA 培養基，混勻，待瓊脂凝固后，傾注一薄層VRBGA 培養基覆蓋平板表層，（36±1） ℃，培養（24±1） h。挑選典型菌落（有或無沉淀環的粉紅色至紅色或紫色菌落）劃線NA 平板，（36±1） ℃，培養（24±1） h。挑取菌落進行革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗及葡萄糖發酵試驗。選取革蘭氏陰性、氧化酶陰性、葡萄糖發酵陽性菌落接種至LB 液體培養基中，（36±1） ℃培養24 h，后劃線NA 培養基，（36±1） ℃培養24 h，進行革蘭氏染色鏡檢、氧化酶試驗及葡萄糖發酵試驗，反復純化6 代，進行鑒定。

1.3.4 優勢腐敗菌的16S rDNA鑒定

挑選純化第6 代，初步鑒定為假單胞菌屬和腸桿菌屬的菌落，委托生工生物工程股份有限公司進行16S rDNA 全序列鑒定。

按SK8255（細菌）試劑盒操作提取基因組DNA，后進行PCR 擴增。擴增序列5′→3′，上游引物7FC：AGAGTTTGATCCTGGCT 下游引物1540R：AGGAGGTGATCCAGCCGCA， 反應體系為：Template（ 基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL， 酶0.2 μL， F（10 μmol/L）0.5 μL， R（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸H2O 至25 μL。PCR 循環條件為：94 ℃預變性4 min，94 ℃ 45 s、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min、30 cycle，72 ℃修復延伸10 min，降溫至4 ℃終止反應。用1%瓊脂糖進行電泳，150 V、100 mA 電泳20 min。純化回收：PCR 產物電泳條帶切割所需DNA 目的條帶，純化方式見附見說明書（SK8131），PCR 產物用PCR 引物直接測序。測序結果分析：16S rDNA 序列在核糖體數據庫http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp 上比對。

1.3.5 菌落總數的測定

參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數》。

1.3.6 假單胞菌屬菌落數的測定

參考SN/T 4044-2014《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計數方法》。

1.3.7 腸桿菌科沙雷氏菌屬菌落數的測定

參考GB 4789.41-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗》。

1.3.8 菌落總數及優勢腐敗菌Arrhenius貨架期預測模型的建立

食品品質在貯藏過程中的變化可用化學反應動力學方程式來反映?；瘜W反應動力學的基本公式可表示為：

式中：

A——品質因子的濃度；

t——貯藏時間；

K——變化速率常數；

n——反應級數。

大多數食品的質量與時間關系表現出零級或一級的反應，即n=0 或n=1，動力學方程如下：

本實驗檢測25 ℃常溫保存、4 ℃冷藏保鮮、0 ℃冰溫貯藏3 種條件下菌落總數、假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬，隨貯藏時間變化的情況，通過對數據的整理，利用反應級數和反應速率常數進行推導Arrhenius 方程。通過不同溫度貯藏過程中品質因子與貯藏時間的關系圖，即可得出反應級數。阿侖尼烏斯（Arrhenius）方程如下：

式中：

T——絕對溫度；

K0——方程常數；

Ea——為活化能，J/mol；

R——氣體常數。

由式（1）和式（4），可得：

對式（5）積分后，可得貯藏過程中的品質變化通用動力學模型：

根據貯藏過程中品質因子的變化，結合公式（6）可得貯藏過程中菌落總數及優勢腐敗菌變化的動力學模型：

式中：

A0——初始菌落總數值、假單胞菌屬值、沙雷氏菌屬值；

At——貯藏t時間后的菌落總數值、假單胞菌屬值、沙雷氏菌屬值。單位為CFU/g。

1.3.9 數據分析

通過Microsoft Office Excel 2010 軟件進行數據處理和統計分析，采用Prism 軟件作圖，SPSS 19.0軟件進行動力學模型的構建。

2 結果與討論

2.1 優勢腐敗菌的初步鑒定結果

純化至6 代的菌落初步鑒定結果如表1 所示，根據參考標準，可初步認定為假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬。

表1 純化菌落初步鑒定結果Table 1 Preliminary identification results of purified colonies

2.2 優勢腐敗菌的16S rDNA鑒定結果

根據表2 可知，假單胞菌16S rDNA 全序列方法菌種鑒定結果為假單胞菌屬中的莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）。莓實假單胞菌是肉源性假單胞菌屬的優勢菌，莓實假單胞菌是有氧貯藏條件下冷鮮牛肉、禽肉和海產品中的優勢腐敗菌[16]。根據表3 可知，腸桿菌16S rDNA 全序列方法菌種鑒定結果為沙雷氏菌屬中的液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）。液化沙雷氏菌是腸桿菌科，沙雷氏菌屬中的條件致病菌，可以引起冷凍蔬菜及肉類制品腐敗變質，是與食物中毒相關的最常見菌株之一[17]。本研究表明稻花雞肉在貯藏過程中占主導地位的優勢腐敗菌為假單胞菌屬中的莓實假單胞菌和腸桿菌科沙雷氏菌屬中的液化沙雷氏菌，這與王光宇和Wang 等[18,19]研究結果一致。莓實假單胞菌隨著貯藏時間的增加，在食品菌相體系中的優勢地位越明顯[20]，在肉中的污染比例高達 56.7%～79.0%[21,22]。莓實假單胞菌在肉制品中代謝活躍，可分解糖、蛋白質和脂肪等營養物質，導致肉品出現質構軟化、變色、發黏，分解肉中的肽和氨基酸產生多種揮發性化合物，產生異味，通過胞外聚合物的作用抑制其他菌生長，成為優勢腐敗菌，且在肉制品表面形成大塊菌落和黏液[23]。液化沙雷氏菌可引起腸炎、呼吸道感染、敗血癥等系列病變[24]，液化沙雷氏菌能發酵葡萄糖等產酸，分解蛋白質，水解鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），可產生紅色素，能夠引起肉制品及蔬菜腐敗變質，影響消費者的健康[25]。

表2 莓實假單胞菌鑒定結果Table 2 Identification results of Pseudomonas fragi

表3 液化沙雷氏菌鑒定結果Table 3 Identification results of Serratia liquefaciens

2.3 不同貯藏溫度下菌落總數及優勢腐敗菌變化趨勢

稻花雞肉在25 ℃常溫貯藏條件下微生物生長曲線如圖1 所示。25 ℃常溫保存條件下稻花雞肉第0.5 天的菌落總數值為6.66 lg CFU/g，超過GB 16869-2005《鮮、凍禽產品》中規定鮮禽產品菌落總數≤1×106CFU/g 或6 lg CFU/g 規定限值。25 ℃常溫貯藏條件下稻花雞肉貨架期不超過0.5 d，且在腐敗中后期腸桿菌科沙雷氏菌屬占主導地位，增長量高于假單胞菌屬。腐敗后期腸桿菌科沙雷氏菌屬與菌落總數無顯著性差異，均與假單胞菌有顯著性差異。

圖1 稻花雞肉在25 ℃常溫貯藏條件下微生物生長曲線Fig.1 Microbial growth curve of Daohua chicken under 25 ℃normal temperature storage

稻花雞肉在4 ℃冷藏保鮮條件下微生物生長曲線如圖2 所示。4 ℃冷藏保鮮條件下第4 天的菌落總數值為 6.77 lg CFU/g，超過國家標準規定限值。4 ℃冷藏保鮮條件下稻花雞肉的貨架期不超過4 d，且在腐敗過程中，優勢腐敗菌假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬均隨貯藏時間呈增加趨勢。貯藏前期和腐敗后期，假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬差異性不顯著，但在整個貯藏過程中均與菌落總數有顯著性差異。

圖2 稻花雞肉在4 ℃冷藏保鮮條件下微生物生長曲線Fig.2 Microbial growth curve of Daohua chicken under 4 ℃cold storage

稻花雞肉在0 ℃冰溫貯藏條件下微生物生長曲線如圖3 所示。0 ℃冰溫貯藏條件下第10 天的菌落總數值為6.94 lg CFU/g，超過國家標準規定限值。0 ℃冰溫貯藏條件下稻花雞肉的貨架期不超過10 d，且在整個貯藏周期內，假單胞菌屬、腸桿菌科沙雷氏菌屬均呈緩慢增長的趨勢。在貯藏后期假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬差異性不顯著，但均與菌落總數存在顯著性差異。

圖3 稻花雞肉在0 ℃冰溫貯藏條件下微生物菌生長曲線Fig.3 Microbial growth curve of Daohua chicken under 0 ℃ice storage

稻花雞肉25 ℃常溫貯藏下貨架期不超過0.5 d，腐敗中后期沙雷氏菌占主導地位，4 ℃冷藏保鮮貨架期不超過4 d，假單胞菌和沙雷氏菌隨貯藏時間呈增加趨勢，0 ℃冰溫貯藏貨架期不超過10 d，貯藏后期假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬差異性不顯著。這是因為腸桿菌科菌屬是嗜溫好氧和兼性厭氧微生物，在25 ℃左右能良好生長[26,27]，而假單胞菌為好氧嗜冷菌，因此25 ℃常溫保存條件下稻花雞肉在腐敗中后期占主導優勢的腐敗菌為腸桿菌科沙雷氏菌，且增長量顯著高于假單胞菌。假單胞菌在有氧情況下，貯藏溫度降低，生長優勢明顯[28-30]，且假單胞菌與腸桿菌科沙雷氏菌存在強相關性[31]，因此4 ℃冷藏保鮮和0 ℃冰溫貯藏的稻花雞肉在腐敗后期是沙雷氏菌和假單胞菌占主導優勢，且差異性不顯著。

2.4 菌落總數、假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬Arrhenius貨架期預測模型的建立

根據圖2、圖3、圖4 在不同貯藏溫度下菌落總數、假單胞菌屬、腸桿菌科沙雷氏菌屬與貯藏時間的關系可知，3 個溫度下菌落總數、假單胞菌屬、腸桿菌科沙雷氏菌屬均與時間t近似呈指數關系，菌落總數、假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬的自然對數均與時間t近似呈線性關系，相關系數R2均在0.8 以上，根據（3）式可得在貯藏中菌落總數、假單胞菌屬、腸桿菌科沙雷氏菌屬的變化均為一級反應，即反應級數n=1。由菌落總數、假單胞菌屬、腸桿菌科沙雷氏菌屬與時間t成指數關系可知，對菌落總數、假單胞菌屬和腸桿菌科沙雷氏菌屬取自然對數后與時間t進行線性回歸和相關性分析，可得到3 種不同貯藏溫度下，不同微生物的反應速率常數。菌落總數的動力學參數見表4，假單胞菌屬的動力學參數見表5，腸桿菌科沙雷氏菌屬的動力學參數見表6。

表4 在不同貯藏溫度下菌落總數的動力學參數Table 4 Kinetic parameters of the total number of colonies at different storage temperatures

表5 在不同貯藏溫度下假單胞菌屬的動力學參數Table 5 Kinetic parameters of Pseudomonas at different storage temperatures

表6 在不同貯藏溫度下沙雷氏菌屬的動力學參數Table 6 Kinetic parameters of Serratia liquefactionat different storage temperatures

根據（4）式對反應速率常數K 及溫度T 進行回歸，得到菌落總數變化的活化能Ea=57 967 J/mol，反應常數K0=7.87×1010，平均相關系數R2在0.88 以上，能較好的反映樣品中菌落總數隨時間變化的反應速率常數與貯藏溫度的關系。

將活化能Ea=57 967 J/mol，反應常數K0=7.87×1010代入式（7）可得：

式（8）可用來預測不同貯藏溫度下稻花雞肉的貨架期。

根據（4）式對反應速率常數K 及溫度T 進行回歸，得到假單胞菌變化的活化能Ea=48 634 J/mol，反應常數K0=1.70×109，平均相關系數R2在0.90 以上，能較好的反映樣品中假單胞菌隨時間變化的反應速率常數與貯藏溫度的關系。

將活化能Ea=48 634 J/mol，反應常數K0=1.70×109代入式（7）可得：

式（9）可用來預測不同貯藏溫度下稻花雞肉的貨架期。

根據（4）式對反應速率常數K 及溫度T 進行回歸，得到腸桿菌科沙雷氏菌屬變化的活化能Ea=60 922 J/mol，反應常數K0=3.79×1011，平均相關系數R2在0.95 以上，能較好的反映樣品中腸桿菌科沙雷氏菌屬隨時間變化的反應速率常數與貯藏溫度的關系。

將活化能Ea=60 922 J/mol，反應常數K0=3.79×1011代入式（7）可得：

式（10）可用來預測不同貯藏溫度下稻花雞肉的貨架期。

2.5 Arrhenius貨架期預測模型的驗證

根據GB 16869-2005《鮮、凍禽產品》規定，可食用鮮禽的菌落總數值≤1×106CFU/g。因此可以確定菌落總數限制值為1×106CFU/g，而假單胞菌屬、腸桿菌科沙雷氏菌屬沒有國家標準規定的具體限制值，則根據前期實驗25 ℃常溫保存稻花雞的貨架期為0.5 d，假單胞菌屬值為6.1×105CFU/g，腸桿菌科沙雷氏菌屬值為1.4×105CFU/g。4 ℃冷藏保鮮稻花雞的貨架期為4 d，假單胞菌屬值為3.6×106CFU/g，腸桿菌科沙雷氏菌屬值為4×106CFU/g。0 ℃冰溫貯藏稻花雞的貨架期為8 d，假單胞菌屬值為6.1×105CFU/g，腸桿菌科沙雷氏菌屬值為4.8×105CFU/g。分別取25、4、0 ℃貨架期終點時假單胞菌和沙雷氏菌的中間值作為限制值，因此假單胞菌的限制值為6.1×105CFU/g、腸桿菌科沙雷氏菌屬的限制值為4.8×105CFU/g，菌落總數，假單胞菌屬，腸桿菌科沙雷氏菌屬貨架期預測模型的驗證如下表7 所示，通過與實測各指標到達限制值時的貨架期進行對比，驗證3 種貨架期預測模型的精確性。

表7 稻花雞肉貨架期預測值和實測值Table 7 Shelf life prediction and measured values of Daohua chicken

貨架期預測模型的預測值與實測值平均相對誤差在15%以內即可，結果如表7 所示，本實驗建立的稻花雞肉3 種貨架期預測模型相對誤差最大的為菌落總數貨架期預測模型11.58%，其次沙雷氏菌貨架期預測模型的相對誤差為7.04%，假單胞菌屬貨架期預測模型的相對誤差僅為6.48%。3 個貨架期預測模型的誤差均在允許范圍內，表明菌落總數貨架期預測模型、假單胞菌屬貨架期預測模型、腸桿菌科沙雷氏菌屬貨架期預測模型均可有效的預測稻花雞肉的貨架期，其中預測效果最佳的為假單胞菌屬貨架期預測模型，相對誤差僅為6.48%，且貯藏溫度越低，貨架期越久，3 個貨架期預測模型的預測效果越好。

3 結論

本研究表明稻花雞肉在貯藏過程中占主導地位的優勢腐敗菌為假單胞菌屬中的莓實假單胞菌和腸桿菌科沙雷氏菌屬中的液化沙雷氏菌。稻花雞肉25 ℃常溫貯藏下貨架期不超過0.5 d，腐敗中后期沙雷氏菌占主導地位，4 ℃冷藏保鮮貨架期不超過4 d，假單胞菌和沙雷氏菌隨貯藏時間呈增加趨勢，0 ℃冰溫貯藏貨架期不超過10 d，腐敗后期假單胞菌屬和沙雷氏菌屬差異性不顯著。利用菌落總數、假單胞菌、沙雷氏菌3 個指標建立的貨架期預測模型分別為經過驗證，3 種貨架期預測模型均能對各自的指標進行真實的預測，預測效果最佳的為假單胞菌屬貨架期預測模型，其相對誤差僅為6.48%，其次是沙雷氏菌貨架期預測模型的相對誤差為7.04%，菌落總數貨架期預測模型為11.58%，相對誤差均在允許范圍內。綜上，稻花雞肉優勢腐敗菌為莓實假單胞菌和液化沙雷氏菌，降低溫度能夠延長其貨架期，且構建的3 個貨架期預測模型均能良好的監控其貨架期。