醬油釀造過程中微生物及生物酶的研究進展

趙雪，張展開，張智宏，高獻禮

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013）

醬油是我國傳統的調味品，已有2 500 多年的歷史[1]。傳統醬油采用自然接種的方式接入發酵菌種，導致大曲和醬醪中微生物群落復雜且不穩定，醬油質量穩定性差。此外，自然接種方式可能污染環境中的有害微生物，對醬油的質量和食用安全性造成潛在威脅。隨著研究的深入，研究人員發現米曲霉為醬油釀造的關鍵微生物。為了提高醬油生產效率和安全性，20 世紀70 年代，我國科技人員從醬醪中分離出一株性狀“優良”的米曲霉，后經物理誘變，其產酶性能得到進一步提升，被命名為米曲霉滬釀3.042，目前該菌株是國內醬油釀造的重要菌株[2]。米曲霉3.042 主要分泌中性和堿性蛋白酶，其耐鹽性、耐酸性較差[3-6]。然而，醬油釀造主要在酸性（pH 值 4.9～6.5）和高鹽條件下進行，米曲霉產蛋白酶失活速度快，這是造成單菌株釀造醬油風味、外觀質量相對差和原料利用率低的主要原因[7,8]。

醬油生產過程中依靠微生物所產酶系（胞外酶）將原料（大豆/脫脂大豆、面粉、麩皮）降解成小分子物質（多數為滋味物質），部分小分子量物質再經過微生物的生物轉化作用（微生物體內酶系）形成醬油的香氣物質，上述物質與醬醪中美拉德反應產物、食鹽等共同形成了醬油的色、香、味、體[2,6]。綜上可知，醬油釀造的本質是發酵微生物所產生物酶系的催化作用，其種類和酶活對醬油品質具有直接影響。

本文首先綜述了醬油生產過程中主要微生物的種類及其演替；其次介紹了醬油釀造過程中生物酶及其對醬油品質的影響；最后介紹了生物酶的研究進展和相關的國家政策及其在醬油生產中的應用案例。

1 醬油中釀造微生物的種類及其演替

醬油釀造依靠大曲和醬醪中各種微生物及其所產酶系的共同作用，而釀造過程中微生物群落的演替對醬油質量有重要影響，其中曲霉菌、乳酸菌、酵母菌是釀造過程中的主要微生物，曲霉菌主要通過其所產的胞外生物酶對原料中大分子的分解起主要作用，乳酸菌和酵母菌則主要通過體內酶系的作用對醬油香氣的形成具有重要貢獻。

1.1 霉菌

醬油制曲過程中的關鍵微生物是曲霉。國產醬油以米曲霉3.042 為制曲菌種，而日式醬油以醬油曲霉（A.sojae）為制曲菌種。傳統醬油制曲為自然接種，大曲中除了有米曲霉，還有毛霉、青霉、枝孢霉、黑曲霉、鏈格孢菌、紅綬曲霉[9]、梗霉和布氏犁頭霉[10]等曲霉。Li 等[11]利用無標記蛋白質組學和HS-SPME-GC-MS代謝組學技術對以米曲霉3.042和醬油曲霉3.495 為菌種制備大曲的酶系進行了分析。結果顯示，以米曲霉滬釀3.042 所制備成曲中糖苷酶和纖維素酶（阿拉伯糖內切酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-葡萄糖醛酸酶、阿拉伯糖內切酶、β-1,4-內切木聚糖酶、阿拉伯糖內切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶等）以及酯酶活性較高，而利用醬油曲霉3.495 所制備大曲的蛋白酶（如肽水解酶、二肽基氨基肽酶和肽酶）活性較高。此外，兩株菌株所制備大曲的揮發性醇、醛和酯含量不同，以米曲霉滬釀3.042 所制備成曲中L-乳酸乙酯、9,12-十八碳二烯酸-甲酯和肉豆蔻酸甲酯三種酯類的含量較高，而以醬油曲霉3.495 所制備成曲中的2,3-丁二醇、癸醛、己醛、2-甲基-4-羥基苯甲醛和5-甲基-3-庚酮等含量較高，說明不同發酵菌種所分泌的生物酶及其活性不同，進而影響了大曲的風味。

米曲霉滬釀3.042 主要產中性和堿性蛋白酶，而醬油的發酵主要在弱酸性環境下完成，這導致米曲霉滬釀3.042 所產堿性蛋白酶快速失活，影響原料中蛋白質的利用以及醬油風味物質的形成。黑曲霉具有大量分泌酸性蛋白酶的能力，且是公認安全微生物（GRAS）[9]。因此，將米曲霉與黑曲霉以適當的比例混合制曲，可以在不影響醬油典型風味的情況下改善曲中蛋白酶系的分布，進而提高醬油原料蛋白質利用率和風味。如Gao 等[12]將米曲霉3.042和黑曲霉3.350（A.niger3.350）按照3:1 進行混合制曲，與僅以米曲霉3.042 所制成曲相比，混菌成曲的葡萄糖淀粉酶和酸性蛋白酶活性分別提高62%和190%，混菌所制醬油的氨基酸態氮、總游離氨基酸、谷氨酸、肽（≤1 ku）和還原糖的含量比對照醬油分別提高6.14%、5.97%、10.40%、71.59%和9.62%。此外，采用混菌所制備醬油的香氣化合物（如4-乙烯基愈創木酚、1-辛烯-3-醇、1-丙醇）含量顯著提高，表明黑曲霉和米曲霉混合制曲可通過改善大曲酶系，進而提高醬油風味物質含量，提高醬油質量。趙謀明等[9]從傳統釀造醬油醬醪中分離純化出黑曲霉AN2（A.nigerAN2），并將該黑曲霉與米曲霉混合制曲，這種制曲方法比僅用米曲霉所制成曲的酸性和中性蛋白酶酶活分別提高了22%和43%，且氨肽酶和糖化酶的酶活分別提高了15%和118%，進而提高了醬油原料蛋白質利用率和改善了醬油風味。綜上可知，制曲過程中曲霉菌的種類和比例對其生物酶的構成有著重要影響，進而影響了釀造醬油的品質，合理調控醬油釀造過程中生物酶系是提高醬油質量和原料利用率的重要途徑。

1.2 乳酸菌

乳酸菌是醬油發酵的重要微生物，對醬油風味的形成起重要作用[13]。醬油發酵過程中出現的主要乳酸菌包括嗜鹽四聯球菌（Tetragenococcushalophilusi）、魏斯氏菌（Weissella）、片球菌（Pediococcus）等。在醬油的釀造過程中，乳酸菌能分泌多種酶類，可作為米曲酶酶系的補充，促進原料水解[14]。孫莉等[15]在醬油制曲過程中接入乳酸菌與米曲霉共同發酵，發現酸性蛋白酶酶活力提高了47%；β-葡萄糖苷酶酶活力提高了460%（160.47 U/g），纖素酶酶活力提高了18%（24.43 U/g）；果膠酶酶活力提高了23%（38.53 U/g）。此外，乳酸菌還可以通過體內酶系的催化作用生成乳酸、乙酸等有機酸和多種風味物質，對醬油風味的形成有著重要的作用。除此之外，伴隨著乳酸菌快速生長繁殖，導致釀造體系pH 值下降，這既可抑制其他雜菌生長，又能提供低酸環境，為酵母菌生長繁殖創造發酵條件。在發酵過程中，乳酸菌的數量隨著酒精發酵的進行而迅速下降，直到魯氏接合酵母等主發酵酵母被其他酵母所替代，醬醪中會出現少量乳酸菌[13]。嗜鹽四聯球菌是醬醪的優勢種之一，可以在醬醪發酵15天被檢測到，在醬醪發酵后期含量較少[16,17]。在釀造過程中添加嗜鹽四聯球菌可以提高醬油中2-甲基丁醇、2-甲基丁酸和乙酸異戊酯的含量，從而改善醬油風味[18]。氨基甲酸乙酯具有生物毒性，在醬油釀造時添加嗜鹽四聯球菌，可使原油中氨基甲酸乙酯前體物質瓜氨酸的含量降低85.6%，從而使醬油中氨基甲酸乙酯含量減少79.3%，提高了醬油的安全性[19]。魏斯氏菌也是釀造過程中的優勢菌，類腸膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides）、食竇魏斯氏菌（W.cibaria）和融合魏斯氏菌（W.confusa）是最具優勢的3 株魏斯氏菌[20-22]。類腸膜魏斯氏菌能分泌耐鹽蛋白酶，食竇魏斯氏菌具有耐鹽和耐酸性，在醬油發酵過程中產生大量的富馬酸，因此魏斯氏菌可提高醬油的氨基酸含量和有機酸豐富度[23]。片球菌具有較好的耐鹽性，在醬醪發酵前期參與有機酸及氨基酸代謝，對醬油滋味具有一定影響[24]。片球菌等不僅產酸性物質，還能分泌具有抑菌的特性的抑制肽和細菌素，從而保障醬油釀造的安全性[25]。綜上，乳酸菌可以豐富醬油風味物質的種類和含量，還能抑制雜菌繁殖并減少氨基甲酸乙酯等有害物質的生成。因此，研究乳酸菌對醬油原料的轉化作用及其對醬油滋味、風味物質形成的影響具有重要意義，同時調控乳酸菌在醬油釀造過程中的代謝活動，對推動醬油產業的健康發展也具有重要意義。

1.3 酵母菌

酵母菌同乳酸菌一樣，也是醬油釀造的重要微生物，它具有耐鹽、耐高滲透壓特性。在發酵后期，醬醪中的真菌以酵母菌為主[26]。目前從醬醪中分離出的酵母菌有魯氏接合酵母（Z.rouxii）、易變球擬酵母（T.versatilis）、埃契假絲酵母（C.etchellsii）等30 多個種，其中對魯氏接合酵母的研究最多[27,28]。魯氏接合酵母是一種耐高滲透壓酵母，在較高濃度的離子和非離子（糖和醇）環境下均可生長和繁殖[29]，在醬醪中的檢出率及豐度均較高[21]。魯氏接合酵母在自然條件下于醬油發酵前期大量繁殖，當成曲加入鹽水后，米曲霉開始逐步消亡，耐鹽乳酸菌被解除生長抑制開始繁殖并代謝產生乳酸，這為魯氏接合酵母等耐酸性酵母提供適宜的生長環境，使其成為發酵后期的主要真菌[30]。酵母菌具有分泌醬油關鍵香氣化合物的能力，是醬油香氣化合物的重要貢獻者。魯氏接合酵母以生物合成途徑產生乙醇，通過Ehrlich 途徑由相應的氨基酸代謝產生大量的高級醇及芳香醇，其中包括苯乙醇、2/3-甲基-1-丁醇等，這些物質是醬油醇香的主要貢獻者[31,32]。此外，易變假絲酵母（C.versatilis）和埃契假絲酵母等假絲酵母也是醬醪中常見的產香微生物，可分泌乙酸、4-乙基愈創木酚、苯乙醛、2-苯乙酸酯等醬油關鍵香氣化合物，改善醬油風味[33]。球擬圓酵母（T.globosa）、易變球擬酵母（T.versatilis）、埃切球擬酵母（T.etchellsii）和莫格球擬酵母（T.mogii）等球擬酵母可將醬醪中發酵前期生成的醇類和有機酸合成為酯類、產生4-乙基愈創木酚和4-乙基苯酚等醬油特征香氣成分，顯著改善醬油香氣?；谏鲜鼋湍妇鷥炘降漠a香性能，在醬醪釀造階段強化產香酵母以改良醬油風味是醬油行業的研究熱點之一。如方冠宇等[34]在醬醪中接種魯氏接合酵母進行發酵，發現醬醪中的乙醇、甲硫醇、苯甲醇、苯乙醇等高級醇和芳香醇的含量及種類均得到大幅上升，改善了醬油風味。Liu 等[35]于醬油發酵第45 天接種易變球擬酵母，結果顯示成品醬油中棕櫚酸乙酯和愈創木酚的含量相比對照組分別增加了7.9 和1.77 倍，3-甲基-1-丁醇的含量也得到了顯著提升，醬油風味評分得到顯著提高。Jiang 等[36]發現，在高鹽稀態醬油發酵過程引入不同的酵母菌進行發酵，其通過酯化反應或醇解反應生成的酯類物質增多，推測與其中脂肪酶的作用有關。隨著對醬油特征風味化合物及醬醪中耐鹽酵母研究的深入，這使得對醬油風味的定向調控成為可能[37]。

綜上，醬油釀造過程中微生物的組成是動態變化的，其主導微生物由制曲時的曲霉逐步變為醬醪發酵時的乳酸菌、酵母菌等微生物。微生物的動態變化決定了體系中生物酶的種類構成和活性變化，進而對釀造過程中大分子的分解、小分子的生成，以及醬油感官品質變化產生重要的影響。因此，有必要對醬油釀造過程中的生物酶及其應用、改良進行進一步的研究，以期使得對醬油風味的定向調控和原料利用率的提升成為可能。

2 醬油釀造過程中生物酶對醬油品質和原料利用率的影響

醬油釀造過程中的生物酶大部分由米曲霉產生，如蛋白酶、糖化酶、氨肽酶、淀粉酶等，這些酶對醬油風味和品質的形成至關重要，其中蛋白酶、淀粉酶、果膠酶和纖維素酶等與原料利用率密切有關[38]。除米曲霉外，醬油中的其他微生物如解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）也可以產蛋白酶和淀粉酶，對醬油質量產生影響[39]。

2.1 蛋白酶對醬油品質和原料利用率的影響

蛋白酶是決定醬油質量的關鍵因素，其在發酵過程中的種類和活性對醬油中的呈味氨基酸、多肽含量及其他物質的生成有著重要影響。其中，米曲霉產生的蛋白酶主要為中性和堿性蛋白酶，這兩類蛋白酶主要把原料中的蛋白質水解為肽類和少量游離氨基酸。黑曲霉主要產酸性的蛋白酶，這類蛋白酶多為肽酶，可進一步將肽類水解為游離氨基酸[9,40]。醬油的弱酸性釀造環境決定酸性和中性蛋白酶在蛋白質的水解過程中起重要作用，而米曲霉主要存在于制曲階段和醬醪發酵前期，其所分泌的蛋白酶在發酵前期快速失活，至發酵20 d 時殘余蛋白酶酶活不足初始值的10%。因此，優化醬醪發酵過程中蛋白酶酶系或提高醬醪發酵過程中蛋白酶酶活是提高醬油質量和原料利用率的有效途徑。余潔瑜等[41]發現，在醬油發酵初期（0 d）添加0.1%的酸性蛋白酶，其酸性蛋白酶、中性蛋白酶活性分別為未添加酶制劑對照組的2.9 和2.1 倍，且在醬油pH值下降至4.5 時，總酸、氨基酸態氮含量分別提高了36.71%、16.49%。

米曲霉所產蛋白酶的耐酸和耐鹽性差導致以米曲霉單菌種發酵的醬油質量“相對低”。如米曲霉滬釀3.042 產蛋白酶耐鹽和耐酸性差，使醬油中大豆蛋白B3亞基難以被徹底降解，這不但導致醬油原料利用率低，還會導致二次沉淀形成，影響醬油外觀質量[42]。因此，篩選高產耐酸和耐鹽性蛋白酶的新米曲霉菌株成為提升醬油質量的研究熱點。Xu等[43]通過電刺激將米曲霉和黑曲霉的原生質體進行融合，獲得高產酸性蛋白酶的新菌株F76，該菌株的酸性蛋白酶活為1 500 U/g，是其親本的1.82 倍。Salamin 等[44]在米曲霉NF1 中高表達米曲霉的脯氨酰羧肽酶（AoS28D）基因，該菌株的脯氨酰羧肽酶活達到原菌株的32 倍。此外，在醬醪中添加生物酶也可以達到降低醬油二次沉淀的目的。如Shan等[45]從黑曲霉產蛋白酶中篩選出一種耐鹽酸性蛋白酶（脯氨酰內肽酶），該蛋白酶在釀造過程中能夠降解約50%的大豆蛋白B3亞基，Zhang 等[46]通過超聲輔助使該酶對B3亞基降解率進一步提高，不但顯著減少了醬油的二次沉淀，而且顯著提高了醬油氨基酸態氮（7.14%）和總氮（5.23%）含量，顯著改善了醬油外觀質量和風味。由此可見優化醬醪蛋白酶系對提升醬油質量具有重要的積極影響。

2.2 淀粉降解酶對醬油品質的影響

米曲霉是大曲中淀粉酶的主要生產者，對醬油質量具有重要影響。這類酶主要包括α-淀粉酶和糖化酶，其中α-淀粉酶能夠切斷淀粉鏈內部α-1,4 糖苷鍵，而糖化酶從淀粉非還原性末端依次切斷α-1,4糖苷鍵。在醬油的釀造過程中，淀粉顆粒糊化后能被α-淀粉酶分解成小分子的糊精和少量糖分，使淀粉黏度降低，糖化酶使短分子的糊精全部變成葡萄糖或麥芽糖[47]，可以作為米曲霉等微生物的營養素。生成的葡萄糖等還原糖還可以被酵母菌、乳酸菌等微生物利用，作為酒精、乳酸及谷氨酸等物質發酵的基礎物質，對醬油中酯類、有機酸和呈味氨基酸等風味物質的生成具有重要影響。同時，還原糖還能與氨基酸等蛋白水解產物通過美拉德反應生成多種呈香、呈色物質。綜上可知，淀粉酶類催化的淀粉液化、糖化反應對醬油的色、香、味、體均有重要影響。徐歡歡[48]發現，在制曲時候添加0.1%的α-淀粉酶，可以分別提升大曲酸性蛋白酶、淀粉酶、羧肽酶的活力14.55%、35.02%和13.89%，終產品蛋白利用率和還原糖含量分別提升了2.75%和11.36%，對產品的風味有一定的改良作用。綜上可知，糖化完全則醬油的體態濃厚，甜味好且無鹽固形物含量高。黑曲霉也產α-L-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶等淀粉降解酶，可用于補充米曲霉酶系，提高醬油質量[12,49]。

2.3 其他生物酶對醬油品質和原料利用率的影響

其他生物酶對醬油品質和原料利用率也具有重要影響。首先，原料中纖維素是大豆細胞壁的主要成分，其分解不但可以直接為釀造微生物提供碳源，而且可釋放細胞內部的蛋白質、淀粉，增加其與蛋白酶、淀粉酶的接觸機會，提高蛋白質和淀粉的水解度和利用率。因此，纖維素酶不但具有提高醬油原料利用率的功能，而且可改善醬油風味。醬油發酵過程中纖維素酶包括C1 酶、Cx 酶和β-1,4 葡萄糖苷酶等。天然纖維素被C1 酶分解為直鏈纖維素，而直鏈纖維素被Cx 酶分解為纖維寡糖和纖維二糖，纖維二糖則在β-葡萄糖苷酶的作用下被分解為葡萄糖[47]。最近的研究表明，β-葡萄糖苷酶通過水解糖苷鍵使香氣物質完成從結合態轉化到游離態，從而增加醬油風味[50]。

果膠酶包括原果膠酶、果膠甲酯水解酶、果膠酸酶三種酶。原果膠酶使天然果膠質轉化為水溶性果膠，在果膠甲酯水解酶的催化作用下，果膠去甲酯基后生成果膠酸，而果膠酸中的α-1,4-糖苷鍵被果膠酸酶切斷后生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸進入糖代謝途徑，為醬油釀造提供碳源[47]。

此外，醬油釀造過程中還存在催化醛、酯、酚、呋喃酮及芳香環類物質生成相關的酶，影響醬油風味物質的生成。如乳酸脫氫酶能催化丙酮酸生成乳酸，乳酸可以使醬油的口感變得柔和、圓潤[51]。乙醇在乙醇脫氫酶的催化作用下氧化生成羰基化合物（乙醛），多酚氧化酶把單酚、鄰苯二酚、鄰苯三酚等酚類物質氧化為相應的醌類物質，醌聚合后與胞內蛋白質的氨基反應，形成黑色素[47]，進而影響醬油的色澤及其品質。酯酶（羧基酯酶）可以水解羧酯鍵，也對己酸乙酯等低級脂肪酸酯的形成起催化作用。脂肪酶（甘油酯水解酶）既能水解脂肪形成脂肪酸和甘油，又能催化脂肪的合成[47]。谷氨酰胺酶可以通過水解谷氨酰胺，生成對醬油鮮味有重要影響的谷氨酸。周尚庭等[52]發現，在醬油發酵初期添加醬醪0.01%的谷氨酰胺酶可以在不顯著影響氨基氮、全氮、總酸和鹽分等指標的前提下，提升44.55%的谷氨酸含量，使得醬油的鮮味和口感協調性得到明顯的提升，弱化醬油的咸味和苦澀味。

由此可得，醬油釀造的本質是釀造微生物所產酶系的催化作用，其催化作用對釀造過程中大分子的分解，關鍵呈味、呈香物質的生成有重要影響。隨著人們生活水平的提升，消費者對釀造醬油的品質有了更高的要求，企業和學術界可以通過對生物酶及其應用進行更深層次的研究，以進一步提升醬油原料利用率和色、香、味物質的轉化效率。

3 生物酶研究進展及其在醬油中的應用

3.1 微生物對醬油中生物酶的影響

在醬油釀造過程中主要通過新菌種、菌種改造和多菌種協同發酵達到調控生物酶的目的。Ao等[53]從自然發酵的蠶豆醬中篩選出一株米曲霉新菌株，該菌株所產蛋具有較強的耐酸/耐熱性能，可優化醬油釀造過程中的生物酶。Shu 等[54]對米曲霉滬釀3.042 的孢子進行常壓室溫等離子體（ARTP）處理（照射150 s），得到所產中性和酸性蛋白酶酶活分別為親本菌株1.55 和1.17 倍的新菌株。Gao等[55]也利用ARTP 處理米曲霉3.042 孢子，獲得了一株米曲霉新菌株H8。新菌株所產生的耐鹽堿性蛋白酶、中性蛋白酶、天冬氨酸氨基肽酶的酶活是其親本菌株的1.26、1.29、1.28 倍，具有較高的應用潛力。Hu 等[56]利用PCR 技術使米曲霉胞外中性蛋白酶NPI 的編碼基因發生隨機突變，并在畢赤酵母GS115 中表達，篩選出NPI 酶突變體Y122F 的最適pH 值為5.5，而野生型NPI 的最適pH 值為7.5，且該酶在40 ℃時的比活為1 383.50 U/mg，是野生型的2.75 倍，成功完成了對中性蛋白酶NPI 的修飾，該酶有望在醬油酸性發酵過程中提高對原料的利用率。Sahar 等[57]克隆米曲霉S2 胞外α-淀粉酶AmyA 的編碼基因并在巴斯德畢赤酵母SMD1168H 中成功表達，獲得酶活為72 U/mL 的胞外淀粉酶且該酶的最適pH 值為5.6 并具有耐熱性（60 ℃），適合應用于醬油等發酵行業。鄭博[58]將黑曲霉FND-A47 和米曲霉B-2 以4:1 的比例混合制曲，所得成曲的酸性和中性酶活力是米曲霉單菌種所制曲的1.27 和1.39 倍。上述生物酶調控技術均可有效調控和優化了醬油釀造過程中的生物酶，提升醬油滋味物質含量和原料利用率，具有重要應用價值。

3.2 酶制劑對釀造醬油品質的影響

在確保酶的安全性的前提下，在醬醪釀造階段補充適當的生物酶可有效提升醬油質量和原料利用率。路懷金[59]在醬醪釀造階段添加商品木聚糖酶降低醬油酸味強度31.96%，提高了醬油咸味和鮮味強度48%和68%，改善了醬油風味。史龍君[60]在醬醪中添加適量的纖維素酶發酵96 h 后，醬油氨基酸態氮和還原糖含量以及色度均明顯提高，改善了醬油品質，且原料蛋白質利用率提高了8%。Shan等[45]從黑曲霉產蛋白酶中篩選出一種耐酸、耐鹽脯氨酰內肽酶，在醬醪釀造階段添加2 U/g 醬醪的該酶。終產品醬油總氮、氨基酸態氮、還原糖和非鹽溶性固體的含量均顯著提高，并且減少約61%的醬油二次沉淀，顯著提升了醬油風味和外觀質量。Lee 等[61]從韓國豆醬中分離出一株米曲霉，該曲霉所產蛋白酶AOLK-101 具有優異的耐酸性（pH 值4.5～7.5）、耐鹽性（10%）和耐高溫性（50 ℃），在豆醬釀造過程中添加一定量的該酶可顯著改善產品風味，說明該微生物所產蛋白酶在醬油釀造過程中也具有潛在應用價值。目前，市面上有較多的蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等基礎商用酶制劑可供選擇，但部分新型生物酶的制備和應用僅限于實驗室規模，需進一步降低成本以滿足工業化應用的可行性。

3.3 食品工業用酶制劑

生物酶制劑是一類通過理化方法從同源微生物的組織或發酵代謝產物中提取出的蛋白質，具有改善食品的感官品質、延長貨架期、提高產品的附加值等特點。食品工業用酶制劑在醬油中的應用符合醬油、原釀本味醬油等國家、行業標準要求（表1），對設備、能源、環保等方面較為友好，相比新型發酵菌株的引入、低溫脅迫誘變等技術方案具備更高的工業化應用可行性。

表1 酶制劑產品質量標準Table 1 Product quality standards for enzyme preparations

當前，生物酶的固定化技術是生產具有工業化應用價值酶制劑的關鍵技術。該技術通過包封、共價結合、交聯和吸附等手段將酶和固定基質相結合，使酶在生物反應器中保持穩定，并能夠重復利用[66]，從而進一步降低酶制劑的應用成本，并提升其在食品工業中應用的可行性。比如，吳惠玲等[67]將固定化中性蛋白酶凝膠顆粒應用于傳統高鹽稀態醬醪發酵中，發現固定化蛋白酶相比游離蛋白酶的酶活穩定性更高，蛋白質轉化率較空白對照組與游離組分別提高達6.08%和1.88%。未來利用固定化等技術獲得高質量生物酶仍是該領域研究熱點。

在法規上，食品工業用酶制劑屬于加工助劑，在食品生產過程、而非終產品中發揮作用，由負責食品添加劑的國際食品添加劑法典委員會（Codex Committee on Food Additives，CCFA）制定相關標準和指南進行管理。中國、美國、歐盟、澳大利亞等食品工業較為發達的國家均對食品工業用酶制劑有明確的質量要求規定和允許使用的酶制劑名單（歐盟的名單尚在制定中）[68]。我國現批準使用的酶制劑有45 種（包括黑曲霉所產的α-半乳糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、多聚半乳糖醛酸酶、半纖維素酶，米曲霉所產的氨基肽酶、葡萄糖氧化酶、蛋白酶、α-淀粉酶、漆酶等）[69]，并對食品工業用酶制劑進行嚴格的要求。首先，酶制劑產品的酶活力必須在標示值的85%～115%。其次，產品中的鉛含量不得超過5 mg/kg，總砷含量不得超過3 mg/kg。除此以外，產品中菌落總數（≤50 000 CFU/g）、大腸菌群（≤30 CFU/g）、大腸埃希氏菌（≤10 CFU/g或＜3 MPN/g）、沙門氏菌（不得檢出）等微生物指標必須符合相應標準。最后，我國還針對微生物來源的酶制劑要求不得檢出抗菌活性且基因重組微生物所生產的酶制劑不應檢出生產菌[70]。

由上可知，通過調控釀造過程中生物酶可有效提升醬油品質和原料利用率，目前主要通過運用具有高產特定生物酶的新菌種、非定向菌種改造、多菌種協同發酵和食品工業用酶制劑調控醬油釀造過程中生物酶，進而提升醬油品質和原料利用率。

4 結論和展望

醬油制備主要依靠微生物的形成的各種生物酶將原料中的蛋白質、淀粉等降解成小分子物質，并將其部分通過生物轉化形成風味物質的一個復雜的過程。在釀造過程中起主要作用的微生物包括霉菌、乳酸菌和酵母菌等。霉菌是淀粉類降解酶、蛋白類降解酶、脂肪酶等生物酶的主要生產者；酵母菌和乳酸菌可以產生少量的酶，并提高醬油中酸、酚、酮等風味物質含量，是醬油發酵過程中的風味菌。優化釀造醬油的發酵菌種和風味菌的種類以及在醬醪中添加發酵所需酶制劑均能達到提高原料利用率、降低二次沉淀和改善醬油風味質量的目的，為生產更優質的醬油提供了新的思路。我國當前仍然面臨微生物產酶資源開發不足的問題，在發酵環境中鑒定和篩選高產特定生物酶的新菌種，豐富發酵微生物菌庫和開發更多性能優良的食品工業酶制劑是未來研究的重要方向，也為發酵產業高質量發展提供了有力保障。