果膠甲酯酶抑制劑的異源表達及其在果酒降甲醇中的應用

閆統帥，周浩洋，王澤翔，何嬌嬌，梁思宇，周世水*

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510640）

（2.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642）

（3.石灣酒廠集團股份有限公司，廣東佛山 528031）

果酒是水果發酵成的低酒精度飲料酒，很好的保留了水果中的營養成分，但是在果酒發酵過程中不可避免的生成甲醇[1]。由于甲醇為視神經毒物，可造成暫時或永久視力障礙[2]，同時甲醇還會在人體緩慢代謝成毒性更大的甲醛和甲酸，人誤食5 g以上甲醇就會嚴重中毒甚至死亡[3]，因此降低果酒中甲醇具有重要的研究意義。

果酒發酵中的甲醇主要來自水果果膠的水解[4,5]，在內源果膠甲酯酶的作用下果膠被分解成果膠酸和甲醇[6,7]。目前研究常采用高溫熱處理鈍化果膠酶[8-10]和清汁發酵[11]來降低果酒中的甲醇，兩種處理方式都會使果酒的果香和口感品質降低，而添加果膠甲酯酶抑制劑（Pectin Methylesterase Inhibitor，PMEI）有望解決這一難題。Wu 等[12]在愛玉果中提取出一種PMEI，可有效降低楊桃果酒發酵中的甲醇，Wang 等[13]進一步表征其為復合的單寧類似物，Hou等[14]發現葡萄中添加沒食子酸或香豆酸也可以降低甲醇并增加酒中保健成分。此外，來源于綠茶中的兒茶素和植物組織的根皮苷對果膠甲酯酶也具有抑制活性[15,16]，從而具有降低果酒中甲醇的潛力，但也存在含量低、提取復雜的難題。有報道來源于獼猴桃的PMEI 可以抑制果膠水解[17]，從而維持果汁的濁態[18]，且能在畢赤酵母中進行異源表達[19]，若將其應用于果酒發酵則有望降低果酒中的甲醇。

本研究將從獼猴桃中克隆出的PMEI 基因，利用雙酶切連接到表達載體pPICzαA 上，電轉化到畢赤酵母GS115 中獲得PMEI 異源表達的工程菌株GS115/pPICzαA-PMEI，并將表達純化后的PMEI 應用到果酒發酵來降低果酒中的甲醇，這為低甲醇果酒的發酵提供了新的技術路線。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

畢赤酵母表達菌株GS115，質粒pPICZαA 均為本實驗室保存，大腸桿菌DH5α感受態細胞購自金沙生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑

ApexHF HS DNA 聚合酶預混液、DNA 凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、GL DNA Marker 5000，湖南艾科瑞生物科技有限公司；EcoRI、XabI、T4 DNA 連接酶、BMGY 培養基、BMMY 培養基，購自上海生物工程有限公司，博來霉素（Zeocin）、1xPBS緩沖液，北京普博欣生物科技有限責任公司；乙酸丁酯、丙酮（均色譜純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；22 種白酒標準品，滕州中科普儀器有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

T100 聚合酶鏈式反應基因擴增儀，大龍興創實驗儀器股份公司；Tanon EPS 300 電泳儀，上海天能科技有限公司；Gel Doc2000 凝膠成像分析系統、411BR 電轉化儀，美國Bio-Rad 公司；5804R 高速臺式冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；GC8100 氣相色譜儀，滕州中科普儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建及鑒定

根據GeneBank 中的獼猴桃PMEI 基因序列，利用軟件Primer 5.0 進行引物特異性設計，并在其兩端加入酶切位點EcoRI 和XbaI，所設計的引物如表1 所示，由上海生工有限公司合成。重組質粒pPICZαA-PMEI 的構建如圖1 所示，以反轉錄出的獼猴桃的cDNA 為模板，利用引物對PMEI-F 和PMEI-R 擴増大小為480 bp 的目的基因，將獲取的目的基因與表達質粒pPICzαA 進行雙酶切連接，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α，用引物PMEI-A/D 進行菌落PCR 篩選，并提質粒進行酶切驗證[20]。

圖1 構建重組質粒pPICZαA-PMEI 示意圖Fig.1 Construction of recombinant pPICZαA-PMEI

表1 本實驗所用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.2 重組畢赤酵母的構建及驗證

將線性化的表達質粒pPICZαA-PMEI 電轉化到畢赤酵母GS115 中，涂布于含有100 μg/mL Zeocin 抗性的YPD 平板上，30 ℃避光培養2～3 d，挑取抗性平板上的陽性菌落，用引物PMEI-F/R 進行菌落PCR 驗證。

1.2.3 重組畢赤酵母誘導表達PMEI

參照梅曉宏等[21]的發酵條件對重組畢赤酵母進行誘導表達，挑取重組畢赤酵母菌于25 mL BMGY培養基中28 ℃、200 r/min 培養到OD600nm=3.0～6.0。4 ℃，4 000 r/min 離心5 min 收集菌體，用50 mL BMMY 培養基重懸菌體并轉入250 mL 三角瓶中繼續培養，每24 h 補加0.5 mL 甲醇，誘導表達120 h后離心收集上清。

1.2.4 PMEI的鑒定與濃縮純化

將取少量表達上清用甲醇氯仿進行10 倍濃縮抽提后進行SDS 聚丙烯凝膠電泳，觀察蛋白條帶是否符合預期。用φ=80%的硫酸銨將上清中的蛋白質進行沉淀，用1 倍體積PBS 緩沖液重懸沉淀，并用34 nm 14 000 u 的透析袋4 ℃過夜透析脫鹽，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，并估算重組畢赤酵母菌的表達量，然后-80 ℃凍存備用。

1.2.5 PMEI在果酒發酵中的應用探究

將桔子、蘋果、葡萄打漿，分別取80 mL 到100 mL 的燒杯中，加入1%（V/V）PMEI，對照組加入1%（V/V）PBS 緩沖液，接種0.1%（m/V）的果酒酵母，24 ℃發酵4 d 后用紗布過濾出酒液，靜止12 h 后取樣品測定甲醇和雜醇油含量，并測定酒精度、還原糖和總酸。

1.2.6 PMEI在桔子酒發酵中的最小抑制濃度

將桔子漿汁和過濾后桔汁按80 mL 每份分裝到100 mL 的燒杯中，實驗組分別添加0、0.25%、5%、0.75%和1%（V/V）的初步純化過的PMEI，對照組則添加對應量的PBS 緩沖液，全部接種0.1%（m/V）的果酒酵母于30 ℃進行發酵，發酵結束后用紗布過濾并測定其甲醇含量。

1.2.7 PMEI在桔子酒發酵中的最適溫度

將桔子漿汁按80 mL 每份分裝到100 mL 的燒杯中，按體積比添加0.5%（V/V）的初步純化過的PMEI，對照組則對應添加0.5%（V/V）的PBS 緩沖液，將桔子搗碎并接種0.1%（m/V）的果酒酵母，分別置于18、21、24、27 和30 ℃發酵，發酵結束后過濾上清測定甲醇含量。

1.2.8 測定方法

甲醇、雜醇油和酒精度：采用氣相色譜法測定[22,23]；還原糖：DNS 測定法[24]；總酸：采用電位滴定法測定[25]。

1.2.9 數據分析

采用SPSS 28.0 進行數據統計分析，結果用“平均值±標準差”表示，由Graphpad 8.02 對數據進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 pPICzαA-PMEI表達載體的構建

在Zeocin 平板上生長的轉化子的菌落PCR 如圖2a 所示，條帶784 bp 的為連載成功的表達載體，條帶377 bp 的為空載體，隨機挑選含有目的基因的陽性克隆進行質粒提取，利用EcoRI 和XbaI 進行雙酶切驗證，酶切結果如圖2b 所示，電泳顯示三個條帶，分別為未酶切完全的重組質粒pPICZαAPMEI，雙酶切形成的pPICZαA 和PMEI，條帶大小分別為4 000、3 530、470 bp。

圖2 pPICZαA-PMEI 表達載體的構建Fig.2 Construction of pPICZαA-PMEI expression vectors

圖3 重組畢赤酵母菌落PCR 驗證Fig.3 Colony PCR verification of recombinant Pichia pastoris

2.2 重組菌株GS115/pPICzαA-PMEI的篩選

取電轉化后涂布在Zeocin 抗性平板上長勢良好的酵母進行菌落PCR 驗證，所挑選的5 個轉化子均能擴增480 bp 的目的基因，這表明PMEI 基因已被成功整合到畢赤酵母GS115 的染色體上。

2.3 PMEI的表達與純化

pPICzαA 因無法篩選高拷貝菌株而表達量較少，故對表達上清采用10 倍濃縮處理。蛋白質電泳如圖4 所示，上清中沒有太多的雜蛋白，預測目的蛋白為19.8 ku，這與以往PMEI 在畢赤酵母中表達的條帶相近[19,26]，與大腸桿菌中表達的條帶相差較大[27]，在目的蛋白條帶下方有一條雜帶，推測可能是去糖基化修飾的原始條帶 （17 ku）[28]。將50 mL 表達上清用硫酸銨沉淀、透析后得到10 mL 純化的PMEI，測定其蛋白質量濃度為176.88 mg/L，因此菌株表達PMEI的量約35.38 mg/L，這與曹等用GAP 啟動子構建的組成型表達菌株表達量相近（66 mg/L）[26]，但遠低于Mei 等[19]構建的高拷貝表達菌株的表達量（200 mg/L）。

圖4 畢赤酵母表達上清蛋白質電泳Fig.4 SDS-PAGE of expresses supernatant by Pichia pastoris

2.4 PMEI在果酒發酵中的應用探究

將1%（V/V）的PMEI 分別添加到桔子、蘋果和葡萄的果漿中發酵，發酵結束后氣相測定甲醇含量如圖5 所示。由圖5 可知PMEI 在桔子酒發酵中降低甲醇效果最顯著，甲醇含量由189.75 mg/L 降低到99.55 mg/L，降低47.54%（P＞0.05）。蘋果酒中甲醇含量由118.15 mg/L 降低到91.20 mg/L，降低25.12%（P＞0.05）。葡萄酒中甲醇含量由17.60 mg/L 來到15.90 mg/L，甲醇變化不顯著（P＜0.05）。PMEI對果酒發酵其他成分影響如表2。從表2 可知添加抑制劑對果酒的酒精度和還原糖影響小，而總酸都有下降。在果酒酒精度較低時，抑制劑使果酒中的雜醇油顯著增加，酒精度較高時雜醇油則變化不顯著。

圖5 PMEI 對三種水果發酵甲醇含量的影響Fig.5 Effect of PMEI on methanol content in three fruits fermentation

表2 PMEI對果酒發酵中其它指標的影響Table 2 The effect of PMEI on other indicators in fruit wine fermentation

發酵果酒中的甲醇含量主要與水果中果膠含量和內源性果膠甲酯酶有關[3]，水果中甲酯化的果膠在發酵過程中由果膠甲酯酶分解形成果膠酸和甲醇，而PMEI 能和果膠甲酯酶形成1:1 非共價可逆復合物從而抑制其活性[29]，因此導致發酵果酒中甲醇含量降低和酸度降低，而抑制劑的添加由于引入了外源氨基氮，在糖代謝途徑弱而氨基酸代謝途徑強時顯著增加雜醇油的含量[30]。由于各種水果甲酯化的果膠含量以及自身果膠甲酯酶特性不同，PMEI對不同水果發酵中甲醇的降低存在較大差異，葡萄中的果膠酶活性較弱，自然條件下發酵甲醇含量較低，PMEI 的抑制效果不顯著，而桔子中果膠含量豐富，內源性果膠甲酯酶活性也較強，梅等的研究也表明PMEI 與來源于桔子的果膠甲酯酶的結合能力較強[31]，因此PMEI 在桔子酒發酵中降低甲醇的效果最佳。

2.5 PMEI在桔子酒發酵中的最低抑制濃度

通過測定不同添加量的PMEI 確定其在桔子酒發酵中的最小抑制質量濃度，結果如圖6 所示。結果顯示，兩種發酵條件下桔子酒中的甲醇有較大的差異，由于桔子酒中的果膠主要存在于果渣中，因此桔子漿發酵的桔子酒甲醇含量偏高。此條件下添加0.5%（V/V）的PMEI 可使桔子酒中甲醇降低53.27%，由120.90 mg/L 降低到56.50 mg/L，因此確定PMEI 在桔子酒發酵中最適質量濃度8.84 mg/L。桔子汁發酵的桔子酒甲醇含量都低于30 mg/L，PMEI添加量也在0.5%（V/V）時甲醇含量最低，此時甲醇含量由26.90 mg/L 降低到19.80 mg/L，降低26.39%。

圖6 不同PMEI 添加量對桔子酒中甲醇含量的影響Fig.6 Effects of different PMEI addition on methanol content in orange wine

2.6 PMEI在桔子酒發酵中的最適溫度

測定不同溫度條件下桔子酒中的甲醇濃度，結果如圖7 所示。不添加PMEI 時發酵桔子酒中甲醇含量隨著溫度的降低而降低，原因是內源性果膠酶活性隨溫度降低[32]，但是較低發酵溫度又不利于降低甲醇，這是因為低溫導致發酵時間延長而使甲醇含量上升。當添加PMEI 時，發酵桔子酒中甲醇含量都顯著下降，甲醇降低比隨溫度降低而升高，在18 ℃時甲醇降低比達66.40%，甲醇含量由265.15 mg/L 降低到89.10 mg/L。但在發酵溫度21 ℃時，甲醇含量最低為83.30 mg/L，與18 ℃發酵甲醇含量相接近，此時甲醇降低比為58.78%。由于PMEI 在低溫時對果膠甲酯酶抑制能力較強，且低溫發酵有利于果酒果香的保留，因此確定添加PMEI 發酵桔子酒的最適溫度為18 ℃。

圖7 不同溫度條件下PMEI 對桔子酒中甲醇含量的影響Fig.7 Effect of PMEI on methanol content in orange wine under different temperature conditions

3 結論

本研究成功構建了PMEI 基因異源表達的畢赤酵母工程菌株GS115/pPICzαA-PMEI，將發酵表達的PMEI 進行濃縮純化后用于果酒發酵。研究結果表明，添加PMEI 發酵的桔子酒中甲醇降低47.54%，蘋果酒中甲醇降低21.52%，而葡萄酒中甲醇變化不顯著，同時添加PMEI 還對果酒酸度有一定的降低作用。添加PMEI 的桔子酒發酵工藝優化的PMEI 最低濃度為8.84 mg/L，最適溫度18 ℃，此時桔子酒中甲醇降低比最高為66.40%。這為發酵果酒降甲醇提供了新的技術思路。