供者來源游離DNA在肝移植領域相關研究與應用進展

梁 田,楊洪吉,狄文佳

(1.電子科技大學醫學院,四川 成都 611731;2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院器官移植中心,四川 成都 610072)

在過去的幾十年里,肝移植術后一年后的長期生存率并沒有改善[1,2]。移植排斥反應(transplant rejection)是指:受者進行同種異體組織或器官移植術后,外源性的組織或器官等移植物被受者免疫系統識別,受者發起針對移植物的攻擊、破壞和清除的免疫學反應。排斥反應的發生機制主要包括細胞免疫和體液免疫這兩部分。臨床最常見的急性排斥反應主要由細胞免疫介導,而超急性排斥反應和慢性排斥反應主要由體液免疫介導?；颊咝栝L期進行免疫抑制治療,來保證移植器官功能。肝移植術后患者(liver transplantation patients,LT)死亡數約四分之一來源于長期使用免疫抑制劑導致移植物出現感染,腫瘤等并發癥。移植物出現術后功能障礙導致移植患者死亡的數量約占11%～12%[1]。個性化免疫抑制(individual immunosuppression,IS)有望對LT后的長期生存產生積極影響,并能更好地平衡必要的異體反應性抑制和慢性IS的不良影響。在前瞻性研究IS最小劑量的實驗中,強調了移植物穿刺活檢的重要性[3～5],穿刺活檢能對IS指導作出有效價值,雖然穿刺活檢具有較高的準確性,但穿刺活檢價格昂貴,且不是肝移植患者常規隨訪項目[6],因此,需要一種更為簡單,有效的方法代替移植肝穿刺活檢。

1 供體來源細胞游離DNA

1.1 供體來源細胞游離DNA概述根據目前研究,最有前途的標記物之一便是供體來源細胞游離DNA(donor-derivedcell-free DNA,ddcfDNA)[7]。ddcfDNA是一種來源于移植器官細胞的游離胞外DNA?？梢栽诟我浦残g后患者的血液與尿液中檢測出。而且近期相關研究表明,血液中ddcfDNA水平的絕對和相對增加與移植物損傷的程度有關,例如,在缺血/再灌注損傷或排斥發作期間?；颊哐褐衐dcfDNA絕對值上升。因此,在診斷急性排斥反應時,ddcfDNA似乎比常規肝酶相關指標更精確[8,9]。然而,以往的研究僅限于肝移植術后1年內移植物損傷的評估[7]。近年來,關于ddcfDNA預測移植肝損失及檢測移植肝功能的實驗越來越多,受目前試驗條件受限,數據及結論也大不相同。

1.2 供體來源細胞游離DNA檢測移植物損傷的可行性隨著以PCR二代測序為基礎的高敏感性、高通量檢測技術的應用,通過多種方法證實可在移植受者血,尿樣本中檢測到ddcfDNA及其所占總細胞游離DNA的比例[11,12]。近年來,越來越多的研究表明,ddcfDNA在腎移植術后移植腎功能檢測中具有巨大前景以及應用價值。浙江大學Jiashen團隊[12]的一項關于尿ddcfDNA與BK腎病的研究,此實驗收錄了147例患者的尿液血液標本,此實驗證實了在急性移植腎損傷時,患者ddcfDNA水平明顯更高,另外也指出尿ddcfDNA水平可以區分1型T細胞介導的排斥反應與BK多瘤病毒相關腎病,他們認為ddcfDNA可以作為一種移植物損傷標志,特別對于BK腎病領域。研究指出:在器官移植術后患者中,尿液ddcfDNA含量與血液ddcfDNA含量具有相關性,該研究指出,移植物受損的患者中,尿液中ddcfDNA含量成實質性增高,且血液中含量同時成相關性增高。表明利用尿液檢測相關DNA含量評估移植物是否受損同樣具有可行性。尿液相對于血液來說,為更容易采集的標本且更易于保存,對于患者來說更容易接受且普及。因此,大家開始廣泛研究ddcfDNA對于其他移植如肝移植、心臟移植、肺移植等是否具有同樣價值。

2 供體來源細胞游離DNA在肝移植領域研究進展

在肝移植相關ddcfDNA的研究試驗中,Beck等[13]研究發現兩例移植術后發生急性排斥反應患者的血液中ddcfDNA含量增高超過正常值的55%～60%。此外,移植物相關并發癥如感染、血腫時也會影響ddcfDNA含量水平[14]。Macher等[15]研究發現當肝移植出現急性排斥反應、肝動脈或靜脈血栓或多器官功能衰竭導致的移植物損傷,血液中ddcfDNA及總細胞游離DNA含量均會有不同程度增高。而在非移植物損傷性并發癥中如膽源性腹膜炎或創口感染,ddcfDNA含量無明顯異常升高或降低。Baumann等[16]對其中心61亞臨床移植物損傷患者的研究發現,無組織性發生排斥反應的患者(包括亞臨床T細胞介導的排斥反應以及臨床顯性T細胞介介導的排異反應),其患者的血液ddcfDNA絕對值逐步增加。以上研究均顯示ddcfDNA有望成為一種監測各類器官移植物損傷的通用生物標記物。此外,有部分研究發現在肝移植發生早期明顯的急性排斥反應的前一周,ddcfDNA已開始增高[14]。Levitsky等[17]進行了一項試驗,旨在評估ddcfDNA在肝移植受者移植物損傷診斷和作為移植物功能障礙不同原因之前的預測生物標志物的效用。實驗分析其移植中心LT隊列的血漿中ddcfDNA。將經活檢證實的急性排斥反應患者(AR,n=57)、功能正?；颊?TX,n=94)和急性功能障礙且無排斥反應患者(ADNR,n=68)按一定要求分組對比,其ddcfDNA檢測損傷的準確性高達87%,從LT連續采集的血液樣本顯示,在移植物功能障礙發生前(包括急性排斥反應患者與急性功能障礙但未發生排斥反應者),ddcfDNA就以升高,但在功能正?；颊咧袥]有升高。因此他們指出,在肝功能正常的情況下,ddcfDNA的連續升高可能可以識別移植物臨床前損傷,并且在移植物發生排斥反應中最明顯。該生物標志物可幫助發現移植物損傷和排斥反應的早期跡象,為肝移植受者的管理策略提供相關參考價值。根據上述實驗結果,可知ddcfDNA在亞臨床排斥反應早期診斷中具有一定的應用價值。但Baumann等[16]同時指出:ddcfDNA片段在無創預測相關亞臨床移植物損傷方面的準確性雖然高達87%,但其敏感性和特異性相當有限,在一定的ddcfDNA片段的截斷值下,其預測靈敏度和特異性分別為73%和52%。根據此前瞻性監測活檢計劃中移植物損傷的患病率計算,ddcfDNA分數高于預設值的陽性預測值為76%,而陰性預測值為47%,因此不能實用ddcfDNA預測亞臨床移植物發生損傷的可能。而ddcfDNA僅僅只能作為移植物是否發生損傷的檢測指標。以上部分觀點前后矛盾,可能的原因有:①樣本量少,出現小樣本得出大結論的可能。②受地區、人種、年齡等多方面影響可能造成選擇偏倚。③目前各個中心檢測方法不同,造成數據差異。

3 供體來源細胞游離DNA與個體化免疫抑制治療

3.1 個體化免疫抑制治療患者進行肝移植之后,由于人免疫系統對外源性肝臟具有攻擊抵制作用,患者術后需要進行免疫抑制治療來減少免疫系統對移植肝臟的攻擊。根據之前提供的數據顯示,移植受者約四分之一死亡來源于長期使用免疫抑制劑所產生的不良反應導致移植器官衰竭或者其他組織器官出現新問題。移植藥物是現代醫學最具挑戰和復雜的領域,過去30年研發有效的免疫抑制藥物(ISDs)已大大提高了器官移植受體的存活率,ISDs可用于阻斷不同作用機制的免疫系統,最大程度減少器官排斥反應發生的風險,如炎癥、免疫力和組織修復等。但ISDs濃度過高可產生藥物毒性,濃度過低會導致移植器官發生排斥?，F在普遍認為,根據個體差異,制定個性化免疫抑制治療方案是保證移植物及患者長期生存的必要條件。

3.2 ddcfDNA在IS中的研究Oellerich等[18]比較了10例肝植患者術后5～30 d血液中ddcfDNA含量與他克莫司血藥濃度,發現ddcfDNA水平絕對值與他克莫司血藥濃度呈負相關,且證實他克莫司最低有效濃度為6.8 μg/L,這與以往的研究結果相符合[19]。表明了ddcfDNA在檢測其他免疫抑制劑的免疫抑制最低有效濃度方面可能具有廣闊的應用前景。器官移植術后患者在免疫抑制劑濃度控制不理想時,為避免免疫抑制劑過量及減少不良反應會選擇更換免疫抑制劑,ddcfDNA可能用于檢測這些患者的免疫抑制效果。目前ddcfDNA在肝移植中的作用以及建立診斷標準和排除排斥反應的標準仍處于初級階段[20]。由于免疫抑制劑藥物的不良反應仍然是導致患者的長期預后不良的主要原因。一種非侵入性標記物來指導免疫抑制水平,并在免疫抑制管理中增加個性化免疫治療仍然是迫切的需求,ddcfDNA可能給我們研究方向提供一種新思路。

由于肝移植體積大,肝細胞再生率高,因此與腎移植相比,肝移植中有較高的ddcfDNA含量。Schutz等[9]發表的一項前瞻性研究(n=115)報道,在移植后的前2周內,由于缺血再灌注,受者血液中有非常高的ddcfDNA釋放。2周后,ddcfDNA中位數絕對值下降至≤10%。在沒有丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者樣本中,ddcfDNA百分率的中位數絕對值為3.3%,在HCV感染患者中,與非HCV感染患者相比,其中位水平較高,為5.9%,但仍低于10%的確定診斷或排除排斥反應的零界點。使用來自80例穩定的非HCV患者的232個樣本和來自16例活檢證實急性排斥反應患者的28個樣本,將其與傳統肝功能檢測指標(天門冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶、γ-谷氨酰轉氨酶和膽紅素)進行比較。ddcfDNA優于任何傳統肝功能檢測指標,其診斷曲線下面積為96.5%。在截斷值為10%的情況下,ddcfDNA的診斷敏感性為90.3%,特異性為92.9%,在這項研究中,當穩定的HCV陽性肝移植受者與有排斥反應的肝移植受者進行比較時,ddcfDNA的診斷敏感性、特異性和曲線下面積下降,但仍優于傳統的肝移植檢測指標。與非HCV感染患者相比,采用23.6%的截斷值,曲線下面積下降到88.2%,ddcfDNA的診斷敏感性為75%特異性為84.2%?？偟膩碚f,ddcfDNA相對于傳統肝功能檢測指標,其診斷移植物損傷診斷的敏感性及特異性都更高。上述研究中關于HCV陽性患者的經驗可能表明,考慮到同種異體移植物損傷的無數原因,缺乏高水平的ddcfDNA可能在臨床實踐中更有利于作為移植物排斥的早期標記。

4 總結與展望

在過去的幾年里,我們看到了在實體器官移植中關于ddcfDNA的臨床研究呈爆炸式增長[17]。根據現在目前的研究結果,專家們普遍認為ddcfDNA不是異體移植物排斥反應的特異性標記物,更恰當地描述應該為評估移植物損傷嚴重程度的標記物,盡管這種損傷最常見的原因通常是異體移植物排斥反應,在異體移植物損傷存在時,ddcfDNA升高,似乎預示移植后不良事件。最近有報道稱,將ddcfDNA加入Banff活檢評分與單獨行移植物活檢評分相比,前者提供更好的預測[21]。有趣的是,有人認為ddcfDNA本身可能是引起移植物炎癥,排斥反應的原因[22]。最后,如果ddcfDNA被證明是一個連續的生物標志物,它將會對移植受者管理提供全新的指導方向,提高移植受者的長期生存期。話雖如此,目前的數據并不能提供ddcfDNA關于連續監測在實體器官移植患者管理中的效用的明確結論。需要人們進一步進行探究其可行性。